(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島 266042)

海參是一種海洋棘皮動(dòng)物,其體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì),如巖藻糖基硫酸軟骨素、巖藻聚糖、皂苷、腦苷脂、糖基鞘磷脂和膠原蛋白等[1-2],具有抗癌[3]、抗凝血[4]、抗氧化[5]的作用。因此海參具有較高的商業(yè)價(jià)值,是中國(guó)、日本、韓國(guó)、越南、印度等許多亞洲國(guó)家重要的養(yǎng)殖水產(chǎn)物種之一,也是澳洲以及美國(guó)、加拿大、墨西哥等歐美國(guó)家亟待開發(fā)的水產(chǎn)資源。鮮活海參如仿刺參(Stichopusjaponicus)的體態(tài)一般呈平圓筒狀,表皮整體完好,有彈性;背部略隆起,具有圓錐狀肉刺,海參的主要食用部分為海參體壁組織,然而,海參在收貨、運(yùn)輸、貯藏和加工過(guò)程中極易發(fā)生自溶。自溶時(shí)海參會(huì)發(fā)生“吐腸”現(xiàn)象,這是一種自我保護(hù)的條件反射;海參體表松弛,白色真皮外露,出現(xiàn)脫皮現(xiàn)象;海參體壁的可變結(jié)締組織中的膠原蛋白纖維、微纖維間的間隙加大,膠原纖維分解為膠原原纖維和膠原纖維束,纖維間的蛋白聚糖橋消失,纖維網(wǎng)絡(luò)解體,繼而膠原纖維的形態(tài)和輪廓變模糊,部分原本堅(jiān)固的體壁形成粘稠團(tuán),局部發(fā)生“溶解”,甚至最終“融化”為液態(tài),其成分主要為蛋白、多糖等[6-7]。海參自溶速度極其迅速,快者可在幾分鐘內(nèi)致使海參體壁發(fā)生局部液化,從而導(dǎo)致海參品質(zhì)嚴(yán)重下降,進(jìn)而造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為此,本文針對(duì)海參自溶,綜述了海參體壁的組成、海參自溶機(jī)制和自溶控制技術(shù),為進(jìn)一步研究海參自溶機(jī)制和控制技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 海參體壁的組成及其自溶過(guò)程中的變化

海參體壁由角質(zhì)層、皮層、肌肉層組成,其中皮層中的真皮占比最大,為可變結(jié)締組織。該組織是由膠原纖維和微纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如圖1所示,膠原纖維呈草繩狀平行緊密排列,通過(guò)蛋白聚糖橋連接[6-8],被微纖維網(wǎng)絡(luò)包圍,微纖維網(wǎng)絡(luò)維持組織并提供遠(yuǎn)程恢復(fù)力[9]。膠原纖維的主要結(jié)構(gòu)單元是膠原原纖維和膠原纖維束。膠原纖維及其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要組成是海參多糖和膠原蛋白。

圖1 海參體壁剖面圖及其體壁膠原纖維Fig.1 Contraverse section and collagen fibers of body wall of sea cucumber

海參多糖主要由海參硫酸軟骨素和巖藻聚糖構(gòu)成,其相對(duì)分子質(zhì)量分別為4×104～5×104、8×104～10×104[10]。Chen[11]等得到了巖藻硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu),如圖2(a)所示;Yu[12]等在刺參體壁中得到了海參巖藻多糖,其結(jié)構(gòu)如圖2(b)所示。目前發(fā)現(xiàn)的海參多糖的單糖組成為N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、半乳糖、巖藻糖、葡萄糖胺、葡萄糖醛酸、甘露糖等[13-14],糖苷鍵的連接方式為α-1,3、α-1,4[12-15]。硫酸基團(tuán)在糖單元中的結(jié)合位點(diǎn)(2、3、4、6位)和數(shù)量(19.54%～29.95%)因海參種類而異[16]。海參多糖在自溶過(guò)程中可以釋放68%的硫酸多糖,被分解并轉(zhuǎn)化成脫氧半乳聚糖[17],其結(jié)構(gòu)如圖2(c)所示。

圖2 海參體壁中的巖藻硫酸軟骨素(a)和海參巖藻多糖(b)以及自溶產(chǎn)物脫氧半乳聚糖(c)Fig.2 Chondroitin sulfate(a)and polysaccharide(b)in the body wall of sea cucumber and the resultant deoxygalactosan(c)after autolysis

海參膠原蛋白是結(jié)締組織中的主要組成成分。每個(gè)膠原蛋白分子由三條肽鏈(三條肽鏈可以彼此相同,也可以彼此不同)相互纏繞成草繩狀而成,呈右手超螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為300 kDa,長(zhǎng)300 nm,直徑1.5 nm,其中每條肽鏈約有1000個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量為95～100 kDa[18]。在自溶過(guò)程中,海參體壁中TCA可溶性寡肽的溶出率隨之逐漸增大[19],說(shuō)明體壁中的蛋白結(jié)構(gòu)可能發(fā)生酶促降解。

2 海參自溶的機(jī)制

海參體壁自溶過(guò)程極其迅速,基本上可歸因于海參體壁內(nèi)源酶。當(dāng)然,外源微生物的存在也受到關(guān)注。

2.1 海參內(nèi)源酶

2.1.1 海參體壁酶 海參體壁自溶與即食海參的體壁失穩(wěn)與海參體壁中海參多糖和膠原蛋白降解有關(guān),而這些降解與海參體壁中的多糖酶和蛋白酶有關(guān)[20-21]。

目前已發(fā)現(xiàn)的多糖水解酶有α-糖苷鍵水解酶,如以α-淀粉和果膠等為底物可探知其具有淀粉酶和果膠酶等活性[22-23]。張杰[22]等通過(guò)從海參體壁中分離純化并得到了α-1,4淀粉酶,其分子質(zhì)量約為420 kDa。劉征東[23]等從海參體壁中分離純化了果膠酶,并發(fā)現(xiàn)該酶是一種耐強(qiáng)熱酶,在90 ℃條件下保溫20 min后活力無(wú)顯著性變化,可水解高溫處理的海參體壁組織,產(chǎn)生更多的還原端。海參經(jīng)過(guò)煮沸或者高壓蒸汽滅菌后,其體壁中的果膠酶仍有較高的活力[24],即具有較高的熱穩(wěn)定性。

海參體壁蛋白酶主要有組織蛋白酶L、半胱天冬酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和組織蛋白酶K。Zhou[25]等從海參體壁中分離得到的組織蛋白酶L可催化水解酰胺鍵(以Z-Phe-Arg-MCA為底物)。該酶存在于細(xì)胞液泡內(nèi)表面,在紫外照射下液泡膜與細(xì)胞膜融合,使該酶從細(xì)胞中釋放出來(lái),并擴(kuò)散到組織中,與細(xì)胞外基質(zhì)如膠原纖維接觸并降解[6]。Qi[26]等發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡可誘導(dǎo)增強(qiáng)該酶活性,加劇海參的自溶?？赡艿脑蚴?絲裂原活化蛋白激酶與應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路密切相關(guān),調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生、炎癥、生長(zhǎng)、分化、存活、凋亡等關(guān)鍵下游基因的轉(zhuǎn)錄。紫外照射會(huì)增強(qiáng)海參中自由基的形成,激活絲裂原活化蛋白激酶家族中的應(yīng)激活化蛋白激酶通路和p-38絲裂原活化蛋白激酶通路,從而導(dǎo)致降解膠原蛋白,并激活半胱天冬酶-3,而后者激活組織蛋白酶L進(jìn)一步降解膠原蛋白。此外,該通路也可直接導(dǎo)致DNA的損傷。因此,最終導(dǎo)致海參自溶?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的含鈣鋅內(nèi)肽酶,主要包括膠原酶和明膠酶。膠原酶降解膠原蛋白,明膠酶降解明膠和一些基底膜蛋白。基質(zhì)金屬蛋白酶在海參可變結(jié)締組織的合成和水解中發(fā)揮著重要作用,Sun[27]等發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶是海參自溶過(guò)程中的關(guān)鍵酶,參與了海參自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解,其作用集中在膠原纖維的高級(jí)結(jié)構(gòu)[28]。海參體壁中組織蛋白酶K也參與了海參自溶,組織蛋白酶在酸性條件下可降解膠原蛋白,海參組織的堿性環(huán)境可隨著自溶的進(jìn)行,溶酶體的溶解和組織蛋白酶的釋放,變?yōu)樗嵝原h(huán)境,從而使組織蛋白酶K發(fā)揮活性。組織蛋白酶K能夠?qū)哂蟹€(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原進(jìn)行多位點(diǎn)降解,可降解Ⅰ和Ⅱ型膠原蛋白以及非膠原蛋白[29]?？傊?海參體壁自溶與其體內(nèi)的蛋白酶關(guān)系密切。

2.1.2 海參腸道酶 半胱天冬酶可在紫外照射下被激活,參與自溶。Su[30]等發(fā)現(xiàn)紫外刺激海參可使線粒體膜功能障礙,細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞漿中激活半胱天冬酶并參與海參自溶。半胱天冬酶抑制劑可以不可逆地結(jié)合到蛋白酶的催化位點(diǎn),抑制蛋白酶的活化,從而降低海參自溶。海參腸壁多糖水解酶可以作用于α-1,4糖苷鍵和β-1,3糖苷鍵,其中淀粉酶活力最高,是一種金屬蛋白酶,在60 ℃內(nèi)活力穩(wěn)定[31]。然而,由于海參體壁自溶極其迅速,其與海參內(nèi)臟酶的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

2.2 外源微生物

除了海參自身能夠產(chǎn)生多種多糖酶和蛋白酶外,海參腸道中的多種微生物也可以產(chǎn)生多糖酶和蛋白酶。海參腸道微生物已被分離和鑒定,如芽孢桿菌和枝芽孢桿菌[32]、放線菌[33]和立克次氏體[34],可產(chǎn)生多種外源性消化酶,如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶,對(duì)海參的食物消化有貢獻(xiàn)。采用分類器對(duì)海參消化道中微生物進(jìn)行分類,得到10個(gè)細(xì)菌門,23綱44目83科127屬[32,35]。但是,沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道這些外源微生物是否參與海參自溶。Bakunina[36]等從海洋檸檬假單胞菌(Pseudoalteromonascitrea)中分離得到三種可以產(chǎn)生巖藻聚糖酶的枸櫞酸菌株。Chang[37]等分離出了一種新的黃桿菌科菌株-CZ1127,該菌株可以產(chǎn)生多種巖藻聚糖降解酶來(lái)利用海參巖藻多糖。由于海參體壁自溶發(fā)生于體壁內(nèi)部,且自溶速度極快,因此,很難將海參體壁外源微生物與海參體壁自溶聯(lián)系起來(lái)。

3 自溶的控制技術(shù)

3.1 熱力滅酶

熱力滅酶包括高溫?zé)崃缑负驼婵諢崃缑?。在高溫?zé)崽幚?121 ℃ 15 min)過(guò)程中,海參中的微生物和內(nèi)源蛋白酶會(huì)完全失活,膠原纖維束的結(jié)構(gòu)被破壞和斷裂,膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)也逐漸解旋和降解。在貯藏過(guò)程中,膠原纖維束和膠原蛋白的結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞和降解,且被破壞的程度與貯藏溫度呈正相關(guān),其中,硬度和咀嚼性下降極為明顯,彈性、凝聚性和恢復(fù)性均有所下降,膠原纖維最初緊密交錯(cuò)排列,之后結(jié)構(gòu)斷裂,排列混亂[38-39]。這種變化有可能來(lái)源于海參體壁中的多糖酶,高溫處理后,該類酶活力不降反升[23-24]。采用真空熱力滅酶法時(shí),設(shè)置加熱溫度為95 ℃,真空鍋真空壓力為0.04 MPa,加熱時(shí)間為3 h,雖然得到的海參有較高含量的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、礦物質(zhì)、氨基酸和微量元素,但仍會(huì)造成部分營(yíng)養(yǎng)流失[40-41]。采用熱力滅酶,雖然抑制了酶對(duì)海參的自溶,但也明顯破壞海參的組織結(jié)構(gòu)并使其外部結(jié)構(gòu)大幅度縮小,而影響其商業(yè)價(jià)值。

3.2 超高壓技術(shù)

為了進(jìn)一步提高自溶酶的滅酶力度,超高壓(200 MPa以上)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該條件會(huì)使微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白質(zhì)降解,酶活性降低,幾乎會(huì)殺死所有細(xì)菌、霉菌和酵母,但不會(huì)像高溫滅菌一樣造成營(yíng)養(yǎng)流失和風(fēng)味變化[42]。

超高壓處理海參后,能夠有效鈍化海參體內(nèi)自溶酶活性,其中蛋白酶和淀粉酶活力被明顯抑制。如在600 MPa、保壓時(shí)間30 min、處理溫度15 ℃條件下制作的超高壓海參軟罐頭,其室溫貯藏期為60 d,冷藏貯藏期為90 d[25];在300 MPa、保壓時(shí)間10 min、處理溫度60 ℃的條件下,處理得到的刺參持水力大,且該工藝能夠很好的改善刺參的質(zhì)構(gòu),并有效地保留了刺參中的功能成分[43]。把該滅酶技術(shù)應(yīng)用于海參加工工藝中,如果在海參的風(fēng)味方面有進(jìn)一步的改善,將有望獲得消費(fèi)者樂(lè)于接受的即食海參產(chǎn)品。

3.3 超聲波輔助電解水

電解水是將食鹽、鹽酸等含有氯離子的溶液電解,生成含有次氯酸的溶液,其中,微酸性電解水的pH維持在5.0～6.5。在微酸性電解水中主要起殺菌作用的物質(zhì)為次氯酸。次氯酸能損害細(xì)胞膜,致使細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶、RNA和DNA無(wú)法發(fā)揮正常的生化活性,導(dǎo)致微生物死亡,且與微生物及有機(jī)物接觸后立即還原為水。然而,電解水只能殺滅海參表面的微生物,因此,需聯(lián)合超聲波技術(shù)抑制海參自溶酶活性[44]。

3.4 高壓電場(chǎng)干燥

高壓電場(chǎng)可增加細(xì)胞膜的跨膜電壓,使其變薄并形成微孔甚至崩解,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,其胞內(nèi)酶的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)也相應(yīng)遭到破壞[45],從而達(dá)到抑制海參體壁自溶的目的。利用該法干燥海參,其復(fù)水率、蛋白質(zhì)和酸性粘多糖含量、質(zhì)地、顏色、外觀和風(fēng)味雖然略遜于真空冷凍干燥法[46],但解決了海參體壁自溶問(wèn)題,且使干燥成本明顯降低。

3.5 酶抑制劑

目前產(chǎn)業(yè)中對(duì)捕撈海參的加工前都進(jìn)行滅酶處理,大部分采用酶抑制劑。金屬蛋白酶抑制劑EDTA Na2和1,10-菲羅啉可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活力,在EDTA Na2或1,10-菲羅啉存在下,蛋白降解幾乎完全被抑制[27-28]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括反環(huán)氧琥珀酰-l-l-亮氨酸-氨基(4-胍基)丁烷、碘乙酸、乳清蛋白濃縮物,對(duì)肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白的水解均有部分抑制作用,對(duì)組織蛋白酶K的抑制率均可達(dá)到90%以上[47-48]。使用食品級(jí)金屬蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑,有利于減少海參在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中的自溶,具有成本低、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

3.6 交聯(lián)

為增強(qiáng)海參體壁的穩(wěn)定性,可以采用交聯(lián)方法延長(zhǎng)海參的保質(zhì)期。交聯(lián)方法可以分為化學(xué)交聯(lián)、生物交聯(lián)和固化交聯(lián)?；瘜W(xué)交聯(lián)可利用五倍子提取物和訶子提取物作為交聯(lián)劑,它們含有多元酚的結(jié)構(gòu),能與蛋白質(zhì)、多糖和生物堿發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。該交聯(lián)劑與膠原蛋白發(fā)生的共價(jià)結(jié)合作用使膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不容易降解,能夠保持海參的微觀結(jié)構(gòu),沒(méi)有難以接受的異味,海參表面能保持刺的完整性和海參完整的形狀和外觀[49]。生物交聯(lián)可以采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)海參,其制作方法為:將海參去內(nèi)臟,清洗,預(yù)煮;在中性水溶性殼聚糖溶液中真空浸漬,取出再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶液中固化;調(diào)味;真空充氮包裝;高壓蒸汽滅菌等。采用該方法后,膠原蛋白穩(wěn)定,海參具有較長(zhǎng)的保藏期,0～4 ℃條件下為一年[50]。固化交聯(lián)可以采用海藻酸鈉與海參交聯(lián),該方法可以保持海參的完整性和彈性,將海參進(jìn)行原料處理、海藻酸鈉固化處理、灌湯封口、殺菌加工成即食罐頭產(chǎn)品,更好地解決了海參在貯藏過(guò)程中參體彈性差,體壁破裂,湯汁渾濁,保質(zhì)期短的問(wèn)題[51]。生物交聯(lián)法具有無(wú)毒、無(wú)異物、不影響海參品質(zhì)等特點(diǎn),可有效保持海參的營(yíng)養(yǎng)成分和物理外觀。

4 展望

海參體壁組成成分復(fù)雜,相互關(guān)聯(lián)緊密,由此所構(gòu)成的組織結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜而有致,但極易發(fā)生自溶,其自溶機(jī)制和控制自溶的技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。從目前研究進(jìn)展來(lái)看,海參自溶主要與海參內(nèi)源酶有關(guān),目前控制海參自溶的技術(shù),如真空熱力滅酶、超高壓技術(shù)、超聲波輔助電解水、高壓電場(chǎng)干燥、酶抑制劑和交聯(lián)技術(shù),主要是基于控制海參內(nèi)源酶而建立的。由于海參體壁自溶的發(fā)生極其迅速,因此,很難將海參體壁自溶與其內(nèi)臟和體表及體內(nèi)寄生的微生物聯(lián)系起來(lái)。有關(guān)鮮活海參自溶機(jī)制的問(wèn)題仍有待于進(jìn)一步研究,如自溶啟動(dòng)機(jī)制、參與自溶的酶系、酶攻擊的關(guān)鍵靶點(diǎn)、靶點(diǎn)對(duì)于海參體壁構(gòu)架穩(wěn)定性的關(guān)系以及膠原蛋白與糖類分子及其它分子之間的鍵合方式等。另外,控制海參自溶的技術(shù)也有待不斷優(yōu)化和更新,既要避免海參結(jié)構(gòu)破壞和營(yíng)養(yǎng)成分流失,又能夠保證安全有效地抑制海參自溶,得到高質(zhì)量海參?？傊?自溶的研究方法以及海參自溶的控制技術(shù)仍是當(dāng)前解決自溶問(wèn)題的關(guān)鍵。