吳 靜 綜述，沈佐君 審校

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，安徽合肥 230001)

細(xì)胞外囊泡是所有細(xì)胞主動(dòng)分泌的納米級(jí)囊泡，活細(xì)胞釋放不同類型的細(xì)胞外囊泡進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞間交流，細(xì)胞外囊泡越來(lái)越多地被認(rèn)為是有希望的液體活檢生物學(xué)標(biāo)志物[1]。根據(jù)相似囊泡的直徑大小可將細(xì)胞外囊泡分為三類，直徑在50～150 nm的外泌體，直徑在100～1 000 nm的微囊泡、外粒體和微顆粒，直徑在100～5 000 nm的凋亡小體[2]。目前主要認(rèn)為，外泌體產(chǎn)生的過程是細(xì)胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)體，再形成多泡體，多泡體與質(zhì)膜融合導(dǎo)致其管腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外，產(chǎn)生一種稱為外泌體的EV亞型。

1 外泌體的生物學(xué)特性

在透射電鏡下可以觀察到外泌體呈茶托型或一側(cè)凹陷的半球形，由脂質(zhì)雙分子層包裹。外泌體是一種富含脂質(zhì)的囊泡，含有豐富蛋白質(zhì)及DNA和RNA片段(mRNA、miRNA和其他非編碼RNA)，CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP70等可作為外泌體的標(biāo)志性蛋白，可用于外泌體的提取和鑒定。有研究認(rèn)為，miRNA僅在其起源細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)起作用[3]，ZHENG等[4]的研究表明，在他們的測(cè)序研究中檢測(cè)到的外泌體miRNA不僅可以作為潛在的生物診斷標(biāo)志物，還可以被鑒定為潛在的抗癌藥物靶標(biāo)。

外泌體的有效提取是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的第一步，本綜述旨在全面概述外泌體的提取方法及外泌體miRNA在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的應(yīng)用。目前已經(jīng)開發(fā)了多種不同的分離和富集方法，包括超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、沉淀法、試劑盒法、尺寸排阻法(SEC)、超濾法、基于表面成分親和力分離法、交流電動(dòng)力學(xué)(ACE)分離法及微流控芯片法。

2 外泌體的提取純化方法

2.1基于密度的分離方法

2.1.1超速離心法 超速離心法是最常用的外泌體提取方法[5]，首先，施加較低速度的離心力300 g以從細(xì)胞培養(yǎng)液中去除細(xì)胞；然后，對(duì)上清液施加較大的離心力(10 000～20 000 g)，去除大的細(xì)胞碎片和破碎的細(xì)胞器；最后，再次進(jìn)行高速(100 000～150 000 g)離心從上清液中收集外泌體，所有離心在4 ℃下進(jìn)行[6]。超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染，且分離數(shù)量多，處理樣本小。盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但仍然有很多缺點(diǎn)，如所需的超高速離心儀器比較昂貴、樣品量大、耗時(shí)長(zhǎng)、電鏡觀察外泌體時(shí)仍存在蛋白質(zhì)污染。

2.1.2蔗糖密度梯度離心法 目前已發(fā)現(xiàn)，外泌體在蔗糖梯度為1.15～1.19 g/mL密度中漂浮[7]，所以根據(jù)這個(gè)特性，可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心，外泌體沉降到不同的密度區(qū)域就可以將其區(qū)分出來(lái)。蔗糖密度梯度離心法需要預(yù)先配好連續(xù)梯度濃度的蔗糖溶液，將蔗糖溶液鋪于離心管底部，再將樣本放于上部，4 ℃下100 000 g超速離心。蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高，但是前期準(zhǔn)備復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，又不能完全將外泌體與蛋白質(zhì)分離開。2013年10月ISEV會(huì)議一些研究人員表示，通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時(shí)，細(xì)胞囊泡的生物功能喪失。

2.2沉淀法

2.2.1聚乙二醇(PEG) PEG是一種水溶性非離子化合物，具有極強(qiáng)的親水性，可以與疏水的脂質(zhì)雙分子層結(jié)合，從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉淀。RIDER等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PEG水平會(huì)影響外泌體的產(chǎn)率，且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數(shù)量和質(zhì)量上足以用于蛋白質(zhì)組學(xué)和測(cè)序分析。沉淀法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，更經(jīng)濟(jì)，外泌體產(chǎn)量高，但是會(huì)沉淀一些非外泌體的疏水性物質(zhì)而導(dǎo)致外泌體純度不夠。

2.2.2試劑盒法 最近已經(jīng)開發(fā)出基于聚合物共沉淀的試劑盒，如ExoQuick、TEI等，可用于提取多種體液中的外泌體。聚合物沉淀劑ExoQuick與樣品4 ℃共孵育30 min，然后室溫1 500 g離心30 min，即可獲得外泌體沉淀。與超速離心法比較，試劑盒法更簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，且能獲得更高的外泌體產(chǎn)量[8]。試劑盒法獲得外泌體沉淀含有的雜質(zhì)較多，不同來(lái)源的樣本需要使用不同的試劑盒來(lái)進(jìn)行提取，且試劑盒價(jià)格較貴。

2.3基于大小的分離方法

2.3.1SEC SEC主要根據(jù)外泌體的大小對(duì)外泌體進(jìn)行分離和純化。樣品中大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔而被流動(dòng)相快速洗脫出來(lái)，尺寸小于孔徑的物質(zhì)可進(jìn)入多孔材料，需要較長(zhǎng)時(shí)間被洗脫出來(lái)，即可通過不同的洗脫時(shí)間分離外泌體。B?ING等[9]證明了瓊脂糖凝膠可以從無(wú)血小板上清液中純化出外泌體，通過這種方法，外泌體很容易從蛋白質(zhì)和高密度脂蛋白中分離出來(lái)。HONG等[10]通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體，與漫長(zhǎng)而復(fù)雜的超速離心法不同，它可在30 min內(nèi)完成外泌體分離。通過SEC分離得到的外泌體純度較高，分離出結(jié)構(gòu)上完整且功能活躍的囊泡是基于微型SEC分離的重要優(yōu)勢(shì)，但數(shù)量較少，而且需要特殊設(shè)備，故應(yīng)用不廣泛。

2.3.2超濾法 超濾法是根據(jù)外泌體的大小使用相應(yīng)孔徑的濾膜，將樣品中小分子物質(zhì)過濾到膜的另一側(cè)，而將大分子物質(zhì)滯留在膜上來(lái)達(dá)到分離的目的。超慮法簡(jiǎn)單、省時(shí)、成本低。LIU等[11]改良了簡(jiǎn)單的超濾法，通過將不同孔徑的膜(200、100、80、50、30 nm)串聯(lián)在一起，實(shí)現(xiàn)了不同大小外泌體的快速分離，且捕獲效率明顯高于超速離心法。然而，過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質(zhì)堵塞，這種情況很容易導(dǎo)致膜壓力過大而破碎。

2.4基于表面成分親和力的分離法

2.4.1蛋白質(zhì) 外泌體表面含有豐富的蛋白質(zhì)，所以基于其表面成分的親和力特別適合于分離外泌體。CD63是外泌體中發(fā)現(xiàn)的最豐富的蛋白質(zhì)之一，因此，常用抗CD63免疫吸附外泌體。ZHAO等[12]通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合，將外泌體捕獲到磁珠上后，加緩沖液沖洗5 min，然后引入3種不同熒光染料標(biāo)記的抗體[抗CD24、抗上皮細(xì)胞黏附分子(抗EpCAM)、抗糖類抗原-125(抗CA-125)]，通過觀察不同熒光強(qiáng)度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平。

2.4.2膜磷脂 雖然大部分基于表面成分的親和方法是基于外泌體表面的蛋白質(zhì)，但是脂質(zhì)雙層也是一種很好的檢測(cè)目標(biāo)。XU等[13]利用外泌體膜上表達(dá)的磷脂酰絲氨酸(PS)可以被PS結(jié)合受體Tim4很好地結(jié)合，用Tim4固定化的磁珠與樣品反應(yīng)進(jìn)行外泌體捕獲，并且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態(tài)，與商業(yè)外泌體提取試劑盒相比，表現(xiàn)出更高的捕獲率。CHEN等[14]利用外泌體將帶負(fù)電荷的PS暴露在膜上的特點(diǎn)，使用帶正電荷基團(tuán)的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應(yīng)，血漿中的外泌體就能與磁珠結(jié)合，通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質(zhì)蛋白。

2.5ACE分離法 ACE微陣列產(chǎn)生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場(chǎng)產(chǎn)生的，納米級(jí)的粒子和其他納米級(jí)實(shí)體物質(zhì)被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場(chǎng)區(qū)域，細(xì)胞和大的實(shí)體物質(zhì)被吸引到DEP低場(chǎng)區(qū)域。IBSEN等[15]的ACE裝置需要30～50 μL血漿樣品就能夠在15 min內(nèi)將外泌體濃縮到微電極周圍的高場(chǎng)區(qū)域。ACE設(shè)備流程明顯快于目前使用的方法，這個(gè)裝置簡(jiǎn)化了外泌體提取和回收過程的能力，明顯減少了加工步驟和消耗時(shí)間。CHEN等[16]構(gòu)建了具有交叉電極的DEP芯片，能在30 min內(nèi)從血漿樣品中分離出外泌體。經(jīng)過測(cè)試證明，DEP芯片具有高捕獲率和高回收率，需要的時(shí)間更短，并且不需要笨重和貴重的儀器。

2.6微流控芯片法 微流控芯片法是新開發(fā)出來(lái)的用于快速高效分離樣品中外泌體的方法。WOO等[17]使用2個(gè)納米過濾器(Exodisc)集成的實(shí)驗(yàn)盤在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了20～600 nm外泌體的全自動(dòng)富集。使用納米粒子跟蹤分析定量檢測(cè)證實(shí)了細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外泌體的回收率大于95%。與超速離心法相比，Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平，更省時(shí)，所需樣本量更少。FANG等[18]開發(fā)了一種微流體芯片，將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入芯片，在第1個(gè)腔室中捕獲到外泌體，通入一抗與磁珠-外泌體混合物結(jié)合，再通入熒光標(biāo)記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個(gè)腔室。微流控芯片法操作簡(jiǎn)單，捕獲率高，特別適合于生物學(xué)研究。

外泌體作為癌癥診斷的有前景的生物學(xué)標(biāo)志物，其在癌癥的液體活檢中受到關(guān)注。外泌體的生物學(xué)價(jià)值和臨床應(yīng)用價(jià)值凸顯了開發(fā)有效提取和分離外泌體技術(shù)的重要性和必要性。相信隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，外泌體提取將變得更加簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，純度越來(lái)越高，完整性越來(lái)越好。

3 外泌體的應(yīng)用

外泌體廣泛存在于血液、唾液、尿液、母乳和腹水等體液中[19]，可以方便獲得。與健康對(duì)照組比較，癌癥患者外周血中具有更高水平的外泌體[20]，肺癌細(xì)胞分化的外泌體對(duì)于診斷肺癌有重要臨床意義。肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中NSCLC占所有類型肺癌的85%以上，具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、惡性程度高等特點(diǎn)，生存率較低。目前仍然缺乏精準(zhǔn)的早期篩查方法，因此，有必要尋找靈敏度和特異度更高的早期檢測(cè)的分子標(biāo)志物。

3.1外泌體miRNA在NSCLC中的作用 miRNA被定義為一種小非編碼RNA，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用。miRNA越來(lái)越被認(rèn)為是潛在的疾病非侵入性生物學(xué)診斷標(biāo)志物，有越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA表達(dá)失調(diào)與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[21-22]。RODRGUEZ等[23]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與非腫瘤患者血漿外泌體中檢測(cè)到的miRNA比較，在NSCLC患者的血漿外泌體中檢測(cè)到更多具有高表達(dá)的miRNA。ZHOU等[24]通過系統(tǒng)搜索PubMed、Web of Science和Embase進(jìn)行研究，強(qiáng)調(diào)外泌體衍生的miRNA可以用作NSCLC患者的潛在診斷和治療生物學(xué)標(biāo)志物。

3.2外泌體miRNA在NSCLC中的診斷 外泌體miRNA可能成為篩選、診斷、檢測(cè)癌癥的有效生物標(biāo)志物。GIALLOMBARDO等[25]通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)8種miRNA(miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221和miR-222)與NSCLC相關(guān)，并且推斷從這些上調(diào)或下調(diào)的miRNA中能發(fā)現(xiàn)NSCLC的外泌體生物學(xué)標(biāo)志物。MUNAGALA等[26]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21和miR-155在復(fù)發(fā)肺癌中的表達(dá)明顯增高，表明外泌體miRNA在區(qū)分復(fù)發(fā)性肺癌和原發(fā)性肺癌中起重要作用。JIN等[27]通過分離NSCLC患者血漿中腫瘤來(lái)源的外泌體，與健康個(gè)體來(lái)源的外泌體進(jìn)行miRNA測(cè)序，并對(duì)其診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，腺癌特異性的miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p及鱗狀細(xì)胞癌特異性的miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b可用于早期NSCLC的診斷，是非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物的有效候選者。

外泌體作為一種生物載體，分布廣泛，可用于無(wú)創(chuàng)性診斷，包含蛋白質(zhì)、核酸等生物信號(hào)，可在細(xì)胞之間傳遞生物信息和物質(zhì)交換。外泌體囊泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可有效保護(hù)miRNA免受RNase降解，使外泌體內(nèi)的miRNA更穩(wěn)定、豐度更高。外泌體在肺癌治療過程中會(huì)逐步提高其診斷的精確性和準(zhǔn)確性，能夠盡早發(fā)現(xiàn)肺癌，并及時(shí)進(jìn)行治療，提高患者的生存率。

4 外泌體提取面臨的挑戰(zhàn)及展望

近十年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到外泌體的重要作用。盡管人們對(duì)這一領(lǐng)域的興趣日益濃厚，但是如何提高外泌體的產(chǎn)量和純度是目前面臨的一大挑戰(zhàn)。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試不同的分離純化方法，取得了一定進(jìn)展，但成本和效率仍然是限制外泌體研究和應(yīng)用的關(guān)鍵。因此，建立可靠的外泌體提取方法，有助于外泌體在臨床上的應(yīng)用。本文主要介紹了幾種不同外泌體的分離提取方法及其在NSCLC中的作用。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新，外泌體還有很多需要探索的地方，相信外泌體在肺癌的診斷和治療應(yīng)用上將會(huì)有更廣闊的前景。