李夢(mèng)婷，祝小薦，萬(wàn)紹貴

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2019級(jí)碩士研究生；2.2018級(jí)碩士研究生；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子病理學(xué)中心，江西 贛州 341000)

冠狀病毒是一種可以引起多種動(dòng)物多系統(tǒng)感染的病毒，在人類中主要導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病，例如嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)、中東呼吸綜合征(MERS)[1-2]。2019年底武漢暴發(fā)的以發(fā)熱、咳嗽等始發(fā)癥狀的病毒性肺炎被鑒定為一種新型冠狀病毒引起，該病毒屬B系β-冠狀病毒，還包括2003年在中國(guó)引起非典大流行的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和蝙蝠SARS樣冠狀病毒[3]。新型冠狀病毒被世界衛(wèi)生組織命名為2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)[4-5]，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2，存在人傳人和人類嚴(yán)重感染情況。該病毒之所以被命名為冠狀病毒是因?yàn)樵陔娮语@微鏡下，病毒邊緣有一個(gè)類似冠狀病毒的突起，且通過(guò)高通量測(cè)序手段發(fā)現(xiàn)該病原體基因序列和SARS-like bat coronavirus有著密切的進(jìn)化關(guān)系，與SARS相關(guān)冠狀病毒密切相關(guān)[6-8]，2019-nCoV與SARS相似性約79%[9]，最終鑒定為SARSr-CoV(SARS相關(guān)冠狀病毒)。新型冠狀病毒的檢測(cè)方法多樣，通過(guò)臨床樣本和冠狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清可用于初步分析評(píng)估[7]；實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)可用于檢測(cè)病毒特有RNA[7,10-11]；透射電子顯微鏡可觀察病毒形態(tài)[10]。此外，高通量測(cè)序也在病毒檢測(cè)中扮演了至關(guān)重要的角色。高通量測(cè)序平臺(tái)可以獲得病毒全基因組信息，發(fā)現(xiàn)病原體[12]，有利于檢測(cè)新型冠狀病毒，同時(shí)能迅速發(fā)現(xiàn)變異增加人類對(duì)其的認(rèn)識(shí)度。高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)疫苗和新療法的開(kāi)發(fā)、病毒進(jìn)化的研究、疾病遺傳、跟蹤暴發(fā)具有重要作用，近期也有報(bào)道高通量測(cè)序應(yīng)用于監(jiān)測(cè)醫(yī)療環(huán)境中病毒的暴發(fā)[13-15]。本篇綜述針對(duì)不同高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)新型冠狀病毒的檢測(cè)應(yīng)用和其特點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

1 基于二代基因測(cè)序的宏基因組測(cè)序(mNGS)

NGS是目前實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生物學(xué)及臨床基因組學(xué)研究的有力工具[16]，應(yīng)用十分廣泛。宏基因組二代測(cè)序(mNGS)是指對(duì)微生物群體進(jìn)行高通量測(cè)序，無(wú)須分離培養(yǎng)微生物，且超高深度的mNGS具有較高的病原體鑒定靈敏度，同時(shí)在傳染病的發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)中極具潛力[17]。基于Illumina平臺(tái)的mNGS技術(shù)對(duì)冠狀病毒的測(cè)序分析有助于了解新型冠狀病毒的變異情況、有更加深刻的認(rèn)識(shí)病毒基因序列，同時(shí)可以提高對(duì)新型冠狀病毒的檢出復(fù)核效能和病毒傳播的追蹤分析。

任麗麗等利用Illumina NGS的測(cè)序平臺(tái)，對(duì)取自2019年12月18日武漢市的5例肺炎患者肺泡灌洗液(BAL)臨床標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，5例臨床樣本中的一例樣本，約97%的病毒閱讀數(shù)(reads)歸類于冠狀病毒科，其余4例臨床樣本的病毒閱讀數(shù)也被歸類于β-CoVs，且未發(fā)現(xiàn)其他病原體感染(如細(xì)菌病原體)。通過(guò)Sanger測(cè)序確定樣本病原體基因組序列，發(fā)現(xiàn)5例臨床樣本病原體全基因組序列的核苷酸相似度為99.8%～99.9%，基因5' -ORFlab-S-E-M-N-3'與著名的bat SARS-like(SL)-CoV相似。對(duì)病毒全長(zhǎng)基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒與bat SARS-like-CoVs最為相似，但在不同CoVs中高度保守的RNA依賴的RNA聚合酶序列只顯示86.3%～86.5% nt同源性，提示5例臨床樣本中的病原體并非是bat SARS-like-CoVs感染，確認(rèn)為新發(fā)現(xiàn)的病原體，即2019-nCoV[18]。

同時(shí)，CHEN等也使用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)2例臨床肺炎樣本進(jìn)行研究。測(cè)序結(jié)果顯示，2例樣本的reads數(shù)與冠狀病毒相似度分別為99.9%和99.7%。雖然2例樣本存在一些單核苷酸多樣性，但是從2例樣本獲得的一致性的基因序列是相同的，提示2名患者是由同一種冠狀病毒感染的。對(duì)病毒全基因組進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)樣本中的冠狀病毒株與BtCoV/4991株的核苷酸同源性為98.7%，與蝙蝠冠狀病毒bat-SL-CoVZC45株和bat-SL-CoVZXC21株的核苷酸同源性為87.9%，與目前人類已知的冠狀病毒包括SARS冠狀病毒的核苷酸同源性為79.7%。CHEN等進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該2例肺炎患者的病毒株與其他bat-SL-CoVs在不同基因上的系統(tǒng)發(fā)育不一致，存在重組情況，且未發(fā)現(xiàn)除冠狀病毒外其他病原體感染。提示這2例患者為同一種新型冠狀病毒感染[19]。

mNGS可以直接從原始臨床樣本中調(diào)查感染微生物[20]，2019-nCoV已被確認(rèn)為RNA病毒，但在未知病原體是何類型病毒時(shí)，基于RNA的mNGS方法可以揭示生物體內(nèi)的整個(gè)感染情況，包括DNA病毒、RNA病毒、細(xì)菌、真菌等[21]，Illumina的錯(cuò)誤率為0.1%[22]，故針對(duì)此次新型冠狀病毒的暴發(fā)，使用基于RNA的mNGS方法可以快速準(zhǔn)確鑒定臨床病例中潛在病原體和鑒定臨床發(fā)熱病例是否為2019-nCoV感染，新型冠狀病毒基因組分析和鑒定在5天內(nèi)可以完成[23]，明確病毒的起源和進(jìn)化，對(duì)疾病的控制、預(yù)防和針對(duì)性治療有重大意義。

基于Thermo Fisher公司Ion Torrent平臺(tái)的NGS的基因組測(cè)序，可以直接利用臨床樣本提取病毒RNA，通過(guò)RT-PCR構(gòu)建cDNA文庫(kù)，之后進(jìn)行測(cè)序、結(jié)果比對(duì)分析。靶向擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)信息RNA文庫(kù)中包含了病毒信息和大量的背景信息，不僅浪費(fèi)數(shù)據(jù)量，還干擾數(shù)據(jù)分析。而進(jìn)行靶向擴(kuò)增病毒RNA可以完美的解決上述問(wèn)題。將分離提純的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，通過(guò)增加特異性識(shí)別靶向序列的啟動(dòng)子進(jìn)行特異性擴(kuò)增，去除人為添加序列，連接barcode和adapter后進(jìn)行質(zhì)量控制，完成文庫(kù)構(gòu)建，完成后進(jìn)行測(cè)序。某省疾控中心使用該平臺(tái)成功獲得新型冠狀病毒序列，與BetaCoV-Wuhan-IVDC-HB-01-2019片段一致性為99%，體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，增加結(jié)果可信度[24]。

2 第三代納米孔高通量測(cè)序

以牛津納米孔公司為例，牛津納米孔公司的設(shè)備可以對(duì)DNA和RNA進(jìn)行測(cè)序并提供快速分析，納米孔測(cè)序技術(shù)直接對(duì)核酸片段進(jìn)行全長(zhǎng)讀取，從而進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列的高通量基因測(cè)序[12]，同時(shí)具有極高的精確度，高樣本檢測(cè)效率。該技術(shù)已被應(yīng)用于許多科學(xué)方面的研究，包括人類遺傳學(xué)、癌癥研究和環(huán)境應(yīng)用等，還被應(yīng)用于多種疾病暴發(fā)情況，目前已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)采用納米孔基因測(cè)序技術(shù)對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行高通量基因組測(cè)序檢測(cè)。

JASPER FUK-WOO CHAN等使用納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行研究。樣本來(lái)源于確診的2名患者及其他5名家族成員，采用全基因組測(cè)序方法。樣本中提取核酸，去除宿主DNA后，應(yīng)用不依賴序列的單引物擴(kuò)增方法，用特異性引物A(5' GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3')將DNA酶處理的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Klenow片段(3'→5' exo-)進(jìn)行cDNA第二條鏈的合成(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，馬薩諸塞州伊普斯維奇)。用引物B(5' -GTTTCCCACTGGAGGATA-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)。進(jìn)行納米孔測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)準(zhǔn)備完成即可進(jìn)行測(cè)序，采用R9.4.1進(jìn)行12～48小時(shí)測(cè)序。利用MEGA X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。他們發(fā)現(xiàn)了一種與蝙蝠SARS樣冠狀病毒bat-SL-CoVZXC21(NCBI登錄號(hào)MG772934)和bat-SL-CoVZC45(NCBI登錄號(hào)MG772933)關(guān)系最為密切的新型冠狀病毒，且其中2名患者的病毒株基因組序列完全一致，提示為同一病毒株感染。且2名患者家屬也存在同一病毒株感染情況，故提示該病毒具有傳染性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，痰樣本來(lái)源的循環(huán)閾值比咽拭子樣本來(lái)源早8～13個(gè)循環(huán)，表明下呼吸道病毒載量較高，提示臨床初篩陰性患者可以重復(fù)檢測(cè)上呼吸道樣本或下呼吸道樣本[25]。

為了更好地對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行測(cè)序研究，納米孔公司發(fā)布了一個(gè)關(guān)于2019-nCoV測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程[26]，利用針對(duì)新型冠狀病毒特異性的98對(duì)引物對(duì)患者核酸樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，靶向富集病毒基因組序列片段，進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序分析[26]。

納米孔具有的長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，對(duì)未知新型肺炎病原體檢測(cè)、鑒定具有重要意義。利用納米孔技術(shù)，在建庫(kù)時(shí)不同樣本添加不同的barcode以區(qū)分樣本信息，對(duì)于不同樣品之間的異同點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)新型肺炎家族聚集性或人傳人現(xiàn)象具有重大意義[25]。不同樣本來(lái)源提示病毒載量的多少，有利于臨床初篩陰性樣本針對(duì)病毒載量高的部位重新取樣、檢測(cè)，降低漏診率，對(duì)疫情控制具有重要作用。

3 展 望

針對(duì)新型冠狀病毒肺炎的疫情暴發(fā)，目前臨床上病原檢測(cè)存在假陰性、病毒分離鑒定時(shí)間較長(zhǎng)，病毒變異的潛在性等問(wèn)題，而高通量測(cè)序技術(shù)很好地解決了這些問(wèn)題。當(dāng)前高通量測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，具有極高的準(zhǔn)確率，提高了對(duì)病原體檢測(cè)的準(zhǔn)確率，對(duì)于新型冠狀病毒，高通量測(cè)序技術(shù)能更好地鑒定和分析其來(lái)源、變異情況，減少臨床檢察的盲目性，且檢出速率較高。以納米孔測(cè)序技術(shù)為例，牛津納米孔公司與納米孔社區(qū)科學(xué)家開(kāi)發(fā)實(shí)時(shí)快速的病毒基因組測(cè)序方案來(lái)有效的監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)掌握病毒變異動(dòng)態(tài)。杭州市疾控中心使用納米孔基因測(cè)序平臺(tái)對(duì)新型冠狀病毒基因組進(jìn)行高通量測(cè)序和組裝分析，發(fā)現(xiàn)其與參考基因組一致性為100%。在納米孔社區(qū)開(kāi)通的新型冠狀病毒的檢測(cè)方案流程，可在8小時(shí)內(nèi)完成從樣本到結(jié)果的獲取。進(jìn)一步體現(xiàn)了高通量測(cè)序在新型冠狀病毒應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)。疫情尚未結(jié)束，對(duì)新型冠狀病毒的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)尤為重要，高通量測(cè)序在了解病毒來(lái)源、了解病毒變異情況具有積極作用。高通量測(cè)序的快速檢測(cè)對(duì)于新型冠狀病毒的控制、了解新型冠狀病毒傳播情況進(jìn)而采取有效措施極其重要。故高通量測(cè)序?qū)μ岣咛幚碇卮蟊┌l(fā)事件的應(yīng)急能力，對(duì)保障人類生命安全有積極意義。