石嘉琛，王家敏，喬自林 *

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

20世紀(jì)50年代，研究人員開始將血清作為一種細(xì)胞培養(yǎng)基添加物使用，獲得了良好的培養(yǎng)效果。添加血清的培養(yǎng)基的效果與未添加血清的培養(yǎng)基相比，細(xì)胞活率更高，生長密度更大，持續(xù)培養(yǎng)時間更長。一些要求較高的細(xì)胞需要在培養(yǎng)體系加入自體血清，如大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[1]、豬耳緣成纖維細(xì)胞[2]等。新生牛血清或胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的生長補充劑，主要是因為它具有高水平的生長刺激因子和低水平的生長因子。使用牛血清作為培養(yǎng)基添加劑在建立原代細(xì)胞培養(yǎng)、維持器官/組織外植體和干細(xì)胞繁殖的情況下仍然是必要的，因為血清具有促進(jìn)分化的功能，還具有運輸攜帶激素（如轉(zhuǎn)運蛋白）、礦物質(zhì)和微量元素（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）和脂質(zhì)的蛋白質(zhì)的功能，且含有貼附和擴散因子，在維持pH值或直接抑制蛋白酶作用方面也有一定效果，使用血清就不需要為每個細(xì)胞系和菌種優(yōu)化培養(yǎng)基，這可節(jié)省大量人力物力，加快研究進(jìn)程[3]。

1 血清所含成分對細(xì)胞培養(yǎng)的影響

血清組成成分十分復(fù)雜，包含蛋白質(zhì)，多肽，激素等一些細(xì)胞生長的有益因子，如白蛋白可作為載體蛋白攜帶小分子物質(zhì)，維持細(xì)胞生長，還具有緩沖pH的作用?？赡芪廴静《?、支原體等外源微生物的新生牛血清可通過滅能處理進(jìn)行滅活，但同時可能使血清內(nèi)有利于細(xì)胞培養(yǎng)的生物活性物質(zhì)變性降解，從而影響細(xì)胞的培養(yǎng)[4]。一項關(guān)于胎牛血清組成的研究表明，隨著時間的增加，幾種細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白的數(shù)量以及營養(yǎng)相關(guān)蛋白、細(xì)胞擴散蛋白的數(shù)量都會發(fā)生變化，這種差異性不僅迫使大多數(shù)實驗室進(jìn)行他們自己的胎牛血清和新生牛血清篩選，并且在此之后使用“預(yù)先選擇”的批次，它也常常使不同研究者的數(shù)據(jù)處理變得困難[5]。

2 血清濃度對細(xì)胞培養(yǎng)的影響

在一定范圍內(nèi)，提高細(xì)胞培養(yǎng)基含有的血清含量，可促進(jìn)細(xì)胞分化速度,但血清濃度過高會導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)異常[6]。一般來講，在培養(yǎng)基中添加5%～20%的血清可滿足絕大多數(shù)細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。采用T75方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)PK15細(xì)胞時只需要在培養(yǎng)基中添加5%的血清即可生長狀態(tài)良好，經(jīng)過72 h的培養(yǎng)后，細(xì)胞增長倍數(shù)均為10倍以上[7]。

細(xì)胞在含有一定培養(yǎng)基血清濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長時，血清所含的生長因子可維持細(xì)胞的快速生長，有助于阻止細(xì)胞的機械損傷[8]。一項培養(yǎng)基中血清添加量對于成纖維細(xì)胞的影響表明，10%血清濃度條件下成纖維細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，增殖速率較高，但40%血清濃度對成纖維細(xì)胞有損害作用，出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)量下降的現(xiàn)象[9]，肝細(xì)胞原代培養(yǎng)中血清濃度為20%時會對肝細(xì)胞造成一定傷害[10]。血清是細(xì)胞生物制品生產(chǎn)中的主要成本，幼小倉鼠腎細(xì)胞（BHK21細(xì)胞）經(jīng)過一段時間的馴化可以逐步適應(yīng)低血清培養(yǎng)條件，但其營養(yǎng)物質(zhì)代謝速率、乳酸和氨的積累速度降低[11]。添加15%FBS的培養(yǎng)基可取得較好的牛原代肌衛(wèi)星細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)效果[12]。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是疫苗生產(chǎn)中常用的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式，豬乙型腦炎病毒可在Vero細(xì)胞中增殖，維持液的血清濃度不僅影響細(xì)胞生長，對病毒效價也有一定影響，血清濃度在1%～4%范圍內(nèi)時，病毒毒價隨濃度升高而升高，維持液血清濃度超過 4%后，毒液的效價下降[13]。

3 血清種類對培養(yǎng)效果的影響

血清根據(jù)來源動物品種不同可分為人血清、馬血清和牛血清等。牛血清來源較豐富，目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)。牛血清制品可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清，在這三種血清制品中，胎牛血清品質(zhì)最高，胎牛因未接觸到外界，血清中的細(xì)胞毒害成分最少，但其價格在牛血清中是最為昂貴的[15]。

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，簡稱FBS）是經(jīng)心臟采集230～240日齡的胎牛全血，分離血清，經(jīng)濾過除菌制成，是疫苗生產(chǎn)的重要原輔料之一[18]。胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中效果最好的天然培養(yǎng)基，可提供細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子，還能發(fā)揮酸堿緩沖液作用[17]。新生牛血清指采集出生時間小于24 h的健康牛犢的血清，它是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有血小板促生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子等，在可獲得較好的細(xì)胞生長增殖效果[19]。

目前市場上血清種類繁多，李自良等[15]對國產(chǎn)胎牛血清、進(jìn)口胎牛血清、國產(chǎn)新生牛血清對MDCK細(xì)胞促生長效果做了相關(guān)研究，結(jié)果表明，國產(chǎn)新生牛血清可連續(xù)傳代MDCK細(xì)胞，細(xì)胞生長良好，排列緊密，不同代次MDCK細(xì)胞長成致密單層時細(xì)胞形態(tài)基本一致，但新生牛血清的有效集落數(shù)低于胎牛血清，這可能與二者所含的激素和其他活性物質(zhì)等組分與比例不同有關(guān)。王梅珂等對于國產(chǎn)血清和進(jìn)口血清對于Vero細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞匯合度的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)的一批血清細(xì)胞收獲量值大于3.00×108個/ml，且細(xì)胞相對增長率大于90%，與進(jìn)口血清促細(xì)胞生長效果相近，可替代進(jìn)口血清[16]。

4 細(xì)胞培養(yǎng)使用血清存在的不足

牛血清來源廣，即便是同一來源，同一批次的血清質(zhì)量也存在很大差異，具有因化學(xué)、蛋白質(zhì)方面差異和內(nèi)分泌參數(shù)的血清變異性，這提示我們在解釋使用血清補充劑可能具體定量的實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾或調(diào)節(jié)，血清作為細(xì)胞生長和維持的重要物質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用的同時，也帶有許多至今無法解決的問題和弊端[20]，如血清中成分復(fù)雜，不能準(zhǔn)確加以區(qū)分血清批次間差異很大，且血清的保存期短，給批次生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)化帶來限制。牛血清在使用時需要低溫儲存，然后解凍使用，血清中的脂蛋白產(chǎn)生沉淀，營養(yǎng)價值流失，從而影響細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，造成細(xì)胞生長緩慢。

生物技術(shù)的發(fā)展、生物醫(yī)學(xué)的進(jìn)步都離不開細(xì)胞培養(yǎng)，很多牛血清供應(yīng)商為小型企業(yè)，質(zhì)檢存在很多局限性，且生產(chǎn)環(huán)境是否合格無菌，設(shè)備的科技程度也因成本的限制而存在問題。2000年10月1日，《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》開始實施，牛血清質(zhì)量雖有提升，但影響牛血清質(zhì)量的主要因素是大腸桿菌或噬菌體的污染，其次是細(xì)胞增殖檢查及細(xì)菌內(nèi)毒素[21]。此外，血清在培養(yǎng)基中的存在使產(chǎn)品的分離純化變得更加復(fù)雜，牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)常用的天然培養(yǎng)基，其成本較高，且易被外界的雜菌污染[22]。牛血清蛋白可能內(nèi)化在干細(xì)胞上，刺激產(chǎn)生免疫原性，因此，可能會產(chǎn)生許多潛在的問題，如病毒和朊病毒的傳播，或由于牛蛋白附著在細(xì)胞上而引起的免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞在移植后充當(dāng)抗原基質(zhì)。

5 結(jié)語

血清作為細(xì)胞培養(yǎng)中大量使用的培養(yǎng)基添加物，具有其他物質(zhì)無法比擬的優(yōu)勢，使用血清最大的缺點是其未經(jīng)測試的生物安全性和補充基本培養(yǎng)基的額外成本，針對這些問題，需要制定一個全面，科學(xué)的血清生產(chǎn)行業(yè)規(guī)范，加速產(chǎn)業(yè)升級，使用血清替代品，主要是使用化學(xué)確定的培養(yǎng)基，可減輕風(fēng)險，但目前血清仍然是建立和維持原代細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系的過程中使用最廣泛的添加物，對其化學(xué)組分的不明確也制約著血清的生產(chǎn)和質(zhì)量把控，一旦成分明確，相信血清將會成為生命科學(xué)研究中的一把利器。