楊葉青 陳明 吳補領(lǐng)

1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔科 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 廣州 510515

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類特殊的非編碼RNA，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。與線性RNA相比，circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可抵抗RNA酶R的消化，因而不易被降解，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[1]。除此之外，circRNA還具有分布廣泛、高保守性、組織細胞表達特異性等特征[2-3]。在某些特定情況下，circRNA的表達豐度超過了相關(guān)線性信使RNA（messenger RNA，mRNA）豐度的10倍之多。因而circRNA被認為是理想的疾病診斷標志物及治療靶點，具有非常重要的研究意義及臨床應用價值[4-5]。circRNA對干細胞的多向分化及維持細胞的多潛能狀態(tài)也起著重要的調(diào)控作用。在干細胞的分化、免疫和炎癥反應中都發(fā)現(xiàn)了特異表達的circRNA。不同研究表明，circRNA可調(diào)控胚胎干細胞的多能性及分化能力，并且可以誘導多能干細胞的形成。隨著對circRNA生物學功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)circRNA在多種復雜疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中可發(fā)生特異性表達，這些疾病包括動脈粥樣硬化、帕金森病、阿爾茨海默病、肌強直營養(yǎng)不良、糖尿病以及各類腫瘤[6-11]。

間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，取決于局部微環(huán)境的刺激，間充質(zhì)干細胞可產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，具有造血支持、提供營養(yǎng)、激活內(nèi)源性干/祖細胞、組織損傷修復、免疫調(diào)節(jié)、促進血管新生、抗細胞凋亡、抗氧化、抗纖維化以及歸巢等多方面的作用。多種組織和器官中間充質(zhì)干細胞含量豐富，如骨髓、脂肪、牙髓、臍帶和胎盤等[12-13]。已證實間充質(zhì)干細胞具有成骨向分化特性，但間充質(zhì)干細胞在成骨向分化過程中的作用機制尚不明確，本文重點介紹了目前研究發(fā)現(xiàn)的circRNA在間充質(zhì)干細胞成骨向分化作用中的機制。

1 circRNA在牙源性間充質(zhì)干細胞成骨向分化中的作用

牙源性干細胞具有優(yōu)越的干細胞特性，可以從醫(yī)療廢棄物（如正畸需要拔除的牙、智齒等）中獲得，包括牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙根尖乳頭干細胞、牙周膜干細胞以及牙囊前體細胞等[14-15]。Laino等[16]成功在體外使用牙髓干細胞形成新鮮自體骨，將新鮮自體骨植入鼠皮下4周后，其成功改建為板層骨。Amir等[17]的研究表明，犬牙周膜干細胞能夠修復直徑10 mm以下的頜骨缺損。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，脫落乳牙牙髓干細胞在植入免疫缺陷動物后，能在老鼠腦組織中生存和遷移，并且能夠在體內(nèi)產(chǎn)生非板層骨和牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。因此，明確牙源性干細胞成骨向分化的調(diào)控機制，將有助于進一步優(yōu)化基于干細胞的組織再生治療，為實現(xiàn)干細胞治療的臨床應用提供新的依據(jù)和思路。Bahn等[19]發(fā)現(xiàn)，circRNA可能與口腔環(huán)境中的一些炎癥性疾病有關(guān)。

1.1 在牙周膜干細胞成骨向分化中的作用

張雄等[20]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA8433在人牙周膜干細胞成骨向誘導21 d后顯著高表達，將來可能是人牙周膜干細胞成骨向分化新的生物學標志物。Zheng等[21]用牙周膜干細胞礦化誘導3 d時發(fā)現(xiàn)，與未誘導細胞相比，共有118個circRNA存在差異表達；7 d時共有128個circRNA存在差異表達；14 d時有139個circRNA存在差異表達。在所有樣品中，僅約4%的circRNA以時間方式改變，同時動態(tài)表達在牙周膜干細胞的成骨向分化和生物礦化過程中，表明circRNA可能在細胞成骨向分化和骨形成中起作用。差異表達的circRNA富集在細胞質(zhì)或膜結(jié)合的囊泡和細胞外基質(zhì)中，表明它們在調(diào)節(jié)細胞外囊泡的生物發(fā)生中的潛在作用。

Gu等[22]發(fā)現(xiàn)牙周膜干細胞經(jīng)礦化誘導后，總共檢測到147個長鏈非編碼RNA、1 382個circRNA與148個常見微小RNA（microRNA，miRNA，miR）組合，并與744個mRNA競爭miRNA結(jié)合位點。預測這些mRNA參與了細胞成骨向分化、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、Wnt途徑和調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號傳導途徑?；趍iRanda預測，其中circRNA BANP和circRNA ITCH可能與miR-34a和miR-146a相互作用，通過MAPK途徑調(diào)節(jié)牙周膜干細胞成骨向分化。

近期研究[23]發(fā)現(xiàn)，機械加力組牙周膜干細胞與未加力對照組相比，2 678個circRNA差異表達，1 191個上調(diào)，1 487個下調(diào)。其中circRNA3140與miR-21高度廣泛相關(guān)，miR-21在機械力誘導的牙周膜干細胞成骨向分化中起關(guān)鍵作用。機械加力后的牙周膜干細胞中顯著下調(diào)的circRNA436與miR-107和miR-335都相關(guān)，而miR-107和miR-335與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路相關(guān)，表明circRNA436可能是機械力刺激下牙周膜干細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一；同時，根據(jù)基因本體論（gene ontology，GO）分析可知，差異表達的circRNA4004與細胞外囊泡外泌體有關(guān)，它提供了外胚層介導的骨組織工程成骨向分化模式[24-25]。差異表達的circRNA4214參與了轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路調(diào)控MAPK信號通路。眾所周知，MAPK信號通路有利于成骨細胞的增殖和分化。GO分析顯示，circ-RNA3140與Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路和核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路相關(guān)。TLR可通過激活NF-κB途徑影響人間充質(zhì)基質(zhì)細胞的成骨潛能，并介導牙周膜干細胞在脂多糖誘導的炎癥微環(huán)境中的成骨向分化[26-28]。通過預測軟件分析可知，circRNA5331表現(xiàn)出與miR-204高度相關(guān)。2010年Huang等[29]已經(jīng)闡明miR-204可通過負調(diào)節(jié)Runt2來抑制間充質(zhì)祖細胞和骨髓基質(zhì)細胞的成骨。Wang等[23]繼續(xù)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖預測可知，circRNA126、circRNA4045和circ-RNA4251可以分別與多種miRNA（包括miR-101、miR-335和miR-107）相互作用。而Wang等[30]和Zhang等[31]曾報道m(xù)iR-101和miR-335通過靶向Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路來調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞的成骨向分化。

目前關(guān)于circRNA在牙周膜干細胞成骨向分化方面的研究主要集中在基因芯片和生物信息學分析水平，但也有少量研究進行了機制方面的探討，內(nèi)源性競爭RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）代表一種全新的基因表達調(diào)控模式，比miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為精細和復雜，涉及更多RNA分子（包括mRNA、miRNA和circRNA等）。Li等[32]檢測了成骨誘導期間牙周膜干細胞中circRNA CDR1as和miR-7的動態(tài)表達譜。在成骨誘導期間，CDR1as的表達逐漸上調(diào)，14 d后，其表達比初始水平高10倍以上；miR-7的表達在牙周膜干細胞中顯著下調(diào)。CDR1as的低表達和miR-7的過表達抑制了堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、茜素紅S染色和成骨基因的表達。miR-7的過表達顯著降低了含有生長分化因子（growth/differentiation factor，GDF）5的野生型而非突變體3"非翻譯區(qū)序列的熒光素酶報告載體的活性。GDF5的下調(diào)部分逆轉(zhuǎn)了miR-7抑制劑對成骨細胞分化的影響。隨后CDR1as或GDF5的下調(diào)抑制Smad1/5/8和p38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，而miR-7的上調(diào)降低磷酸化Smad1/5/8和p38 MAPK的水平。因此牙周膜干細胞circRNA CDR1as可充當miR-7抑制劑，引發(fā)GDF5的上調(diào)和隨后的Smad1/5/8和p38 MAPK磷酸化，以促進牙周膜干細胞的成骨向分化。

綜上，circRNA在牙周膜干細胞分化過程中的調(diào)控機制以及調(diào)控的多條途徑之間的關(guān)聯(lián)可能成為今后的研究熱點。

1.2 在牙乳頭干細胞成骨向分化中的作用

占云燕等[33]發(fā)現(xiàn)在經(jīng)礦化誘導的小鼠牙乳頭細胞中，獲得了4 064個差異表達的circRNA，其中上調(diào)的共3 255個，下調(diào)的共904個。對上調(diào)circRNA來源基因進行分析，發(fā)現(xiàn)其中很多基因與牙的發(fā)育過程及硬組織礦化相關(guān)，其中Ipo7與Smad1的核轉(zhuǎn)位有關(guān)。Smad1為牙發(fā)育過程中起重要作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路的效應分子，circRNA在成牙本質(zhì)細胞發(fā)育過程中有重要的調(diào)控作用。Setd2與組蛋白功能有關(guān)，在骨的重建中發(fā)揮重要作用。

新近研究[34]發(fā)現(xiàn)，根尖牙乳頭細胞在經(jīng)礦化誘導后，共有650個circRNA的表達顯著改變，其中317個circRNA下調(diào)，333個circRNA上調(diào)。通過京都基因與基因組百科全書KEGG和GO分析差異表達的基因，這些差異表達基因大多涉及Wnt信號通路、MAPK信號通路和其他一些與成骨相關(guān)的信號通路。隨后建立了成骨相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)，選出其中的circRNA NTATC1利用實驗驗證，證明其可促進牙根尖乳頭干細胞的成骨向分化；同時也發(fā)現(xiàn)miR-4483的表達與circRNA NFATC1的趨勢呈負相關(guān)；利用circRNA數(shù)據(jù)庫circBase預測到miR-4483與circRNA NFATC1有結(jié)合位點，為牙根尖乳頭干細胞的成骨向分化提供了新的見解。

目前關(guān)于circRNA在牙乳頭干細胞成骨向分化中的功能及機制的探討較少，尚停留在小鼠模型研究及基因芯片和生物信息學分析水平，相信伴隨著新的研究技術(shù)體系的建立，circRNA在牙乳頭干細胞成骨向分化中的機制將進一步闡明。

2 circRNA在非牙源性間充質(zhì)干細胞成骨向分化中的作用

2.1 在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化中的作用

目前對非牙源性間充質(zhì)干細胞在成骨向分化中circRNA的功能研究大多集中在骨髓來源的細胞，多為在骨質(zhì)疏松方面的功能及作用。

Li等[35]發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor，ER）β缺乏會抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化。沉默ERβ會使骨髓間充質(zhì)干細胞中的一些circRNA差異表達，并且成骨相關(guān)蛋白質(zhì)在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達下調(diào)。通過RNA-Seq分析檢測ERβ對circRNA表達的影響，146個circRNA存在差異表達，68個circRNA下調(diào)，78個circRNA上調(diào)。構(gòu)建circRNA-microRNA網(wǎng)絡(luò)表明，ERβ可以通過2:27713879|27755789/2:240822115|240867796-miR-328-5p-mRNA網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)成骨向分化。隨后相繼有學者發(fā)現(xiàn)circRNA在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化中有重要的作用，Zhang等[36]發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化期間，與未分化細胞相比，第7 d時總共有3 938個circRNA上調(diào)，150個circRNA下調(diào)；大約95%的差異表達的circRNA來自編碼蛋白質(zhì)的基因，GO分析表明差異表達的circRNA的親本基因與成骨存在關(guān)聯(lián)；其中一些circRNA與具有成骨作用的miRNA存在關(guān)聯(lián)，表明這些circRNA可能在骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化中起作用。circRNA IGSF11的沉默促進了成骨細胞分化并提高了miR-199b-5p的表達水平，證明了circRNA-miRNA相互作用對人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化有積極作用。趙可偉[37]通過circ-RNA芯片檢測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者外周血單核細胞中circRNA的表達水平，檢測到11 246個circ-RNA；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組與非患病對照組相比，381個circRNA表達變化倍數(shù)≥1.5（P<0.05），其中203個上調(diào)、178個下調(diào)；其中circRNA0001275具有作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥生物標志物的潛能。研究結(jié)果證明了circRNA在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。在防治骨質(zhì)疏松癥方面，Yin等[38]也發(fā)現(xiàn)在人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化過程中，circRNA RUNX2（circRUNX2）可以與miR-203結(jié)合并增強RUNX2的表達，抑制成骨向分化，因此證明circRUNX2可預防骨質(zhì)疏松癥。

Yang等[39]發(fā)現(xiàn)，與非骨質(zhì)疏松癥患者相比，骨質(zhì)疏松癥患者血清中miR-217水平升高，血清circRNA VANGL1和RUNX2水平降低。circRNA VANGL1（circ-VANGL1）通過吸收miR-217來調(diào)節(jié)RUNX2表達，而加速成骨向分化。circ-VANGL1的過表達使與成骨相關(guān)的RUNX2、骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨鈣蛋白的表達上調(diào)。同時，過表達circ-VANGL1的骨髓間充質(zhì)干細胞中ALP活性增加。共同過表達circ-VANGL1和miR-217的骨髓間充質(zhì)干細胞中的ALP活性略微增加。Ren等[40]發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽（calcium gene-related peptide，CGRP）刺激骨髓間充質(zhì)干細胞后，有58個顯著差異表達的circRNA，其中44個circRNA下調(diào)，14個circRNA上調(diào)；其中mmu_circRNA_003795顯著增加，而沉默mmu_circRNA_003795后，mmu_miR-504-3p的表達增加，F(xiàn)os樣抗原2表達和細胞增殖減少。上述結(jié)果證明了circRNA在CGRP誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖中有重要作用，確定circRNA涉及調(diào)節(jié)機制的部分，進一步提供了研究骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化及增殖的能力的新方向。

2.2 在胚胎間充質(zhì)干細胞成骨向分化中的作用

Qian等[41]通過RNA-seq分析不同成骨細胞分化階段circRNA的差異表達，鑒定circRNA19142和circRNA5846與成骨細胞分化有關(guān)，BMP2可通過circRNA9142/circRNA5846誘導小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1158細胞的成骨向分化。

2.3 在脂肪間充質(zhì)干細胞成骨向分化中的作用

Long等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞成骨過程中不同階段存在差異circRNA表達，共檢測到14 236個circRNA，其中有40個上調(diào)，circRNA通過干擾成骨相關(guān)的miRNA在成骨向分化中發(fā)揮重要作用；circRNA-miRNA共表達網(wǎng)絡(luò)顯示miR-338-3p與上調(diào)的circRNA13422及circRNA22566相關(guān)。circRNA表達譜數(shù)據(jù)對脂肪來源干細胞成骨向分化期間circRNA功能的確定有重要的價值。

3 circRNA在間充質(zhì)干細胞成骨向分化中的作用研究展望

綜上所述，雖然目前涉及circRNA對間充質(zhì)干細胞成骨向分化方面的文獻較少，研究方法主要集中在基因芯片檢測以及生物信息學分析的層次上，對其相互作用的機制研究仍然欠缺，許多circRNA的生物學功能尚未得到闡明。從本文所述中可以看出，間充質(zhì)干細胞的成骨向分化會受到circRNA的調(diào)控，兼有抑制或促進效應；少量的機制研究中發(fā)現(xiàn)，circRNA與miRNA和mRNA關(guān)系密切，彼此相互作用，在人體內(nèi)構(gòu)成一個復雜而精準的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，可能構(gòu)成了近年來探討較多的ceRNA的作用機制，circRNA可以結(jié)合某些miRNA以發(fā)揮分子海綿作用，調(diào)控宿主的基因表達[43]。關(guān)于circRNA對間充質(zhì)干細胞成骨向分化的相關(guān)調(diào)控因素作用方面的研究有助于深入探究circRNA這一重要的非編碼RNA，也將有利于為間充質(zhì)干細胞的再生治療提供新的思路和方法。