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人單核細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞極化特性的比較

2020-05-09 03:18:22劉曄洪潤丹王志國劉涵云孟琛達(dá)王茹徐全臣
國際口腔醫(yī)學(xué)雜志 2020年3期
關(guān)鍵詞:單核細(xì)胞來源極化

劉曄 洪潤丹 王志國 劉涵云 孟琛達(dá) 王茹 徐全臣

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科 青島 266003;2.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 青島 266003;3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院美容整形科 青島 266003;4.青島大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病科 青島 266003

20世紀(jì)90年代,巨噬細(xì)胞(macrophages,Mφ)極化是指在極化刺激因子脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)組合誘導(dǎo)下,生成經(jīng)典活化的M1型Mφ,即M1 Mφ[1]。后來發(fā)現(xiàn),IFN-γ刺激的Mφ還能被輔助型T細(xì)胞2(T helper 2 cell,Th2)分泌的Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4和IL-13所抑制,而Th2型細(xì)胞因子刺激的Mφ被命名為替代活化型Mφ,即M2 Mφ[2]。M1 Mφ可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子并誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng);而M2 Mφ主要分泌抑制性細(xì)胞因子并介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié),清除凋亡細(xì)胞和碎片,參與組織修復(fù)[3-4]。目前,Mφ的極化狀態(tài)在機(jī)體免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生和消退,參與獲得性免疫反應(yīng),影響組織的修復(fù)進(jìn)程,是當(dāng)前生物治療研究熱點(diǎn)[5]。

外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)衍生的Mφ(PBMC Mφ)和人單核細(xì)胞株THP-1衍生的Mφ(THP-1 Mφ)在極化研究中常被用作體外細(xì)胞模型[6-7]。PBMC直接來源于機(jī)體組織,更能反映體內(nèi)狀態(tài);然而該細(xì)胞存在提取效率低,無增殖能力,無法凍存,體外培養(yǎng)需要加入生長因子維持性狀,供體間差異較大等諸多問題,其應(yīng)用較為受限[8]。為克服這些缺點(diǎn),學(xué)者們使用THP-1建立Mφ的研究模型。THP-1是人單核細(xì)胞系,易于獲取,操作簡便,純度高,遺傳背景相同且能無限傳代,使用較為廣泛[9]。但是有研究[10]指出,不同來源的Mφ在不同分化狀態(tài)下的表型屬性存在差異,會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在建立PBMC體外分離和培養(yǎng)模型的同時(shí),比較了THP-1 Mφ和PBMC Mφ的極化特性,為THP-1替代原代PBMC的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國),胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS;BI公司,以色列),Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(Takara公司,日本),佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA;Mce公司,美國),LPS(Sigma公司,美國),人重組IFN-γ(human recombinant IFN-γ,rhIFN-γ)、人重組IL-4(human recombinant IL-4,rhIL-4)(PeproTech公司,美國),人重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human recombinant macrophage colony-stimulating factor,rhM-CSF)、淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(北京索萊寶科技有限公司),CD14免疫磁珠分選試劑盒和磁極、流式抗體抗人CD86-PE和CD206-PE(Biolegend公司,美國)。

1.2 原代PBMC的分離和培養(yǎng)

在征得供體知情同意的條件(倫理學(xué)批號(hào):QYFYWZLL25653)下,采集健康人新鮮外周血20 mL置于抗凝管中,并用生理鹽水按體積比1:1稀釋。

吸取淋巴細(xì)胞分離液Ficoll置于離心管內(nèi),將相同體積的稀釋血液沿管壁緩慢疊加于分層液面上,注意保持界面清楚。在室溫下以2 000 r·min-1水平離心20 min,液體可分為3層。在上層和中層間的界面處有一個(gè)以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶(圖1)。將吸管插到云霧層,小心吸取細(xì)胞置于離心管中,并且加入5倍體積無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混勻。1 500 r·min-1離心10 min后吸棄上清液,洗滌2次。隨后用3 mL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基將底部沉淀混勻,過濾細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。根據(jù)試劑盒說明,應(yīng)用免疫磁珠法分選CD14+PBMC。

洗脫的細(xì)胞使用含10% FBS以及40 ng·mL-1rhM-CSF的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,密度達(dá)到每毫升3×106個(gè)細(xì)胞后接種于6孔板,置于5%CO2、37 ℃條件下孵育7 d,獲得貼壁的細(xì)胞即為PBMC Mφ。通過倒置相差顯微鏡(Nikon公司,日本)觀察細(xì)胞形態(tài)。

圖 1 密度梯度離心法中液體分為3層Fig 1 Liquid was divided into three layers in density gradient centrifugation

1.3 單核細(xì)胞株的培養(yǎng)

人單核細(xì)胞系THP-1購自上海中喬新舟生物有限公司,并培養(yǎng)在含10% FBS和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中。THP-1為懸浮細(xì)胞,生長速度較快,細(xì)胞密度一般控制在每毫升0.8×106~1.0×106個(gè),每2~3 d傳代1次。收集生長狀態(tài)良好的THP-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞以每孔0.5×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板,用含10% FBS和100 nmol·L-1PMA的RPMI 1640培養(yǎng)基孵育24 h分化成初始巨噬細(xì)胞(M0 Mφ)。隨后用新鮮培養(yǎng)基替換,靜置24 h,置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 極化模型的建立

取兩種來源的靜息狀態(tài)下的Mφ,用LPS(50 ng·mL-1)和IFN-γ(20 ng·mL-1)進(jìn)行刺激,使其向M1型極化;另外再取兩種Mφ,使用IL-4(20 ng·mL-1)進(jìn)行刺激,使其向M2型極化;以未加任何刺激因子的細(xì)胞作為對照,所有細(xì)胞孵育24 h后進(jìn)行檢測。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time-polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測各組細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況,包括表征M1型分化標(biāo)志的IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),以及表征M2型分化標(biāo)志的甘露糖受體C1樣蛋白(mannose receptor C-type 1,MRC1)和IL-10。

收集上述6組細(xì)胞,冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌2次,使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。本研究所用的PCR引物序列見表1,均由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用LightCycler 480 qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序如下:95 ℃ 30 s預(yù)變性;95 ℃ 5 s變性,60 ℃ 30 s退火和延伸,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,檢查融解曲線以確定PCR產(chǎn)物的特異性。使用比較Ct值法(2-ΔΔCt)計(jì)算相對mRNA水平,管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的平均值作為參考對結(jié)果進(jìn)行校正。

表 1 qRT-PCR檢測基因的引物序列Tab 1 Primer sequences of qRT-PCR analysis

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

CD86、CD206是已被廣泛接受的Mφ極化標(biāo)記[11],本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD86、CD206的表達(dá)。消化并收集兩種來源的細(xì)胞,分別經(jīng)LPS+IFN-γ和IL-4刺激后形成M1、M2型極化細(xì)胞,密度為每毫升不少于106個(gè),PBS洗滌2次后,根據(jù)操作說明,分別加入流式抗體CD86-PE、CD206-PE,以相應(yīng)單克隆抗體作同型對照,4 ℃避光孵育30 min,洗滌3次后重懸于PBS中,用流式細(xì)胞儀檢測,使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

收集經(jīng)LPS+IFN-γ和IL-4刺激后形成的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)嚴(yán)格按照操檢測各組細(xì)胞IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組至少進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)結(jié)果使用Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖,兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

圖 2 兩種來源Mφ的形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡Fig 2 Morphological changes of Mφ from two cells sources inverted microscope

倒置顯微鏡下觀察可見,兩種來源的細(xì)胞在靜息狀態(tài)下均黏附牢固,形態(tài)相似,呈圓形,散在分布(圖2A、B)。PBMC在rhM-CSF誘導(dǎo)下分化培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞多數(shù)為橢圓形,呈“煎蛋狀”,少數(shù)呈長梭形(圖2C)。THP-1在PMA誘導(dǎo)24 h后分化成包含圓形和紡錘形細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群,細(xì)胞體積增大,偽足伸展明顯(圖2D)。繼續(xù)向靜息狀態(tài)下的Mφ加入極化刺激因子后,細(xì)胞形態(tài)更為多樣(圖2E、F)。

2.2 qRT-PCR結(jié)果

使用qRT-PCR測定兩種來源Mφ極化標(biāo)記基因的相對表達(dá)量,結(jié)果見圖3。

圖 3 兩種來源Mφ極化后細(xì)胞因子mRNA的相對表達(dá)量Fig 3 Relative expression level of cytokine mRNA after Mφ polarization from two resources of cells

與靜息狀態(tài)細(xì)胞相比,Mφ在接受LPS+IFN-γ刺激后,M1型相關(guān)標(biāo)志基因(TNF-α、IL-1β)的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05,圖3A、B)。THP-1 Mφ的IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達(dá)量分別為8.72±1.58、10.39±1.58,高于PBMC Mφ的相對表達(dá)量(5.14±2.08、9.54±2.31),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mφ在接受IL-4刺激后,M2型相關(guān)標(biāo)志基因(MRC1和IL-10)的相對表達(dá)量也明顯高于對照組(P<0.05,圖3C、D)。THP-1 Mφ的MRC1和IL-10 mRNA的相對表達(dá)量分別為2.32±0.32和1.74±0.33,均低于PBMC Mφ的相對表達(dá)量(3.73±0.51和2.26±0.15);其中MRC1 mRNA表達(dá)水平響應(yīng)LPS+IFN-γ的極化反應(yīng)較弱,但在IL-4刺激后出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05,圖3C)。上述結(jié)果說明,LPS+IFN-γ可以成功誘導(dǎo)兩種來源細(xì)胞的M1型極化反應(yīng),IL-4可以誘導(dǎo)M2型極化反應(yīng),THP-1對M1型極化的刺激更為敏感。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測及量化結(jié)果顯示:THP-1 Mφ接受LPS+IFN-γ刺激后,M1型標(biāo)記物CD86較靜息狀態(tài)下表達(dá)顯著升高,PBMC Mφ有相似的趨勢(P<0.05,圖4上);PBMC Mφ接受IL-4的誘導(dǎo)后,M2型標(biāo)記物CD206的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05),但THP-1 Mφ中CD206的表達(dá)則沒有明顯差異(P>0.05,圖4下)。上述結(jié)果說明,LPS+IFN-γ可以誘導(dǎo)Mφ向M1方向極化,IL-4可以誘導(dǎo)Mφ向M2方向極化,CD206對THP-1的M2極化反應(yīng)沒有特異性表達(dá)。

圖 4 Mφ極化標(biāo)記物CD86和CD206的表達(dá)Fig 4 The expression of polarization markers CD86 and CD206 from Mφ

2.4 ELISA結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)上清液的ELISA檢測結(jié)果見表2。兩種來源細(xì)胞經(jīng)LPS+IFN-γ刺激后分泌的細(xì)胞因子水平存在差異:IL-1β、TNF-α在THP-1 Mφ中表達(dá)更強(qiáng),高于PBMC Mφ(P<0.05);相反,IL-6在PBMC Mφ中的表達(dá)較THP-1 Mφ更明顯(P<0.05)。兩種來源細(xì)胞經(jīng)IL-4刺激后分泌的細(xì)胞因子水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表 2 兩種來源Mφ上清液中細(xì)胞因子的表達(dá)量Tab 2 The expression levels of cytokines in Mφ supernatant from two resources of cells pg·mL-1

3 討論

單核細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生,進(jìn)入血液循環(huán)并外滲后分化為Mφ,后者在協(xié)調(diào)損傷反應(yīng)中起著重要作用[12]。人白血病來源的單核細(xì)胞系THP-1克服了使用原代Mφ的限制,已在研究中廣泛使用[9]。THP-1衍生的Mφ與原代人Mφ有非常相似的表型和功能特征[13],但不能簡單地假設(shè)兩者必然相等。因此,本研究比較了兩種細(xì)胞在靜息和活化狀態(tài)下的基因表達(dá)、表面標(biāo)志物以及細(xì)胞因子分泌等特征。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合筆者經(jīng)驗(yàn)和先前的研究[14]為THP-1和PBMC選擇了合適的培養(yǎng)和誘導(dǎo)方案。采集健康人新鮮循環(huán)外周血提取PBMC,使用免疫磁珠法捕獲CD14+單核細(xì)胞。CD14是細(xì)胞表面的糖蛋白,被認(rèn)為是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)特征性的表面標(biāo)記物[15]。免疫磁珠是一種細(xì)胞分選技術(shù),可以將培養(yǎng)物進(jìn)一步分化成高純度的巨噬細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)[16]。PMA是從THP-1獲得與PBMC Mφ相似巨噬細(xì)胞的最有效的激活劑[17]。根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道,PMA誘導(dǎo)THP-1分化的最佳方案是:細(xì)胞在100 nmol·L-1的PMA誘導(dǎo)下孵育24 h,然后在沒有PMA的培養(yǎng)液中靜置至少24 h,以減少分化期間上調(diào)的核因子-κB表達(dá)。通過上述方法獲得的兩組細(xì)胞緊緊黏附在培養(yǎng)板內(nèi),不易被0.25%的胰酶消化,符合Mφ貼壁牢固的特點(diǎn)。通過倒置顯微鏡觀察到,初始狀態(tài)的兩種Mφ形態(tài)相似,均為散在分布。不同極化條件下的Mφ由不同形狀的細(xì)胞異質(zhì)群組成。紡錘形或偽足伸展明顯的Mφ被認(rèn)為具有促炎性質(zhì),而圓形或觸角圓鈍的Mφ被認(rèn)為具有抗炎特性。

本研究結(jié)果顯示:在接受LPS+IFN-γ刺激時(shí),表征M1型標(biāo)志的IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量顯著增加,而接受IL-4刺激時(shí)IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達(dá)量無明顯變化,兩種Mφ的極化反應(yīng)相似;表征M2型標(biāo)志的MRC1、IL-10 mRNA相對表達(dá)量在接受IL-4刺激時(shí)表達(dá)增強(qiáng),且THP-1 Mφ的相對表達(dá)量較PBMC Mφ要低。兩種Mφ的表面標(biāo)志物在極化過程中也存在明顯差異:表征M1型標(biāo)志的表面分子CD86在兩種Mφ接受M1極化因子刺激后同時(shí)增強(qiáng);而表征M2型標(biāo)志的CD206,接受M2極化因子刺激后僅在PBMC Mφ極化反應(yīng)時(shí)變化明顯。上述結(jié)果說明,M1型標(biāo)志物的表達(dá)在兩種Mφ極化反應(yīng)之間是相似的,但是部分M2型標(biāo)志物僅在PBMC Mφ的極化反應(yīng)中有表達(dá)。分析兩種Mφ培養(yǎng)上清液可以發(fā)現(xiàn),在M1極化因子的刺激下,兩種來源Mφ分泌的細(xì)胞因子水平明顯提高,并且IL-1β、TNF-α在THP-1 Mφ中表達(dá)更強(qiáng),而IL-6在PBMC Mφ中表達(dá)更強(qiáng)。

由本研究結(jié)果可以看出,THP-1 Mφ確實(shí)與PBMC Mφ有相似的極化表達(dá),但THP-1 Mφ對M2表型的極化能力有限,并不能完全替代原代細(xì)胞。THP-1可能更適合進(jìn)行M1極化的研究,而PBMC更適合進(jìn)行M2極化的研究。當(dāng)在Mφ極化模型中使用THP-1和PBMC時(shí),需要考慮這些差異。造成這種差異的原因可能與THP-1和PBMC的生物學(xué)差異有關(guān),例如基因表達(dá)程度和細(xì)胞因子分泌程度的差異等[18]。與THP-1相比,PBMC與組織來源的巨噬細(xì)胞可以在肥胖、慢性炎癥疾病等不同的疾病中處于不同極化狀態(tài),能夠產(chǎn)生不同的表型,從而發(fā)揮不同的促炎和抗炎作用[19]。

綜上所述,人類的健康與免疫功能密切相關(guān),而免疫功能受多種因素影響。體外細(xì)胞系的應(yīng)用能夠最大限度地減少培養(yǎng)期和遺傳變異的影響、倫理問題的限制,以及供者的可獲得性,在研究方面具有一定意義;但在研究中應(yīng)注意,體內(nèi)細(xì)胞是以交互作用的網(wǎng)絡(luò)形式而存在,而體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中缺乏這種交互作用,因此應(yīng)明確不同細(xì)胞在不同狀態(tài)下的功能及表達(dá),以進(jìn)一步模擬體內(nèi)情況。

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