馬凱 李昊 趙紅梅 王永亮 劉杰 柏娜

青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科 青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 青島 266003

外傷、腫瘤、先天畸形造成的骨缺損以及種植外科常常需要用到骨移植技術(shù)。目前該技術(shù)預(yù)期效果最佳的是自體骨移植，但自體骨移植同時(shí)存在增加手術(shù)創(chuàng)傷及手術(shù)并發(fā)癥等缺陷；此外，同種異體骨移植也是常用的骨移植技術(shù)，但該技術(shù)也存在感染和免疫反應(yīng)等問(wèn)題。綜合這些因素，人工骨替代材料在骨移植技術(shù)中具有廣闊的發(fā)展前景[1-2]。

無(wú)機(jī)牛骨是臨床常用的骨替代材料，主要成分是羥磷灰石，為多孔顆粒狀，能促進(jìn)血管長(zhǎng)入并能維持血凝塊的穩(wěn)定，為骨組織新生提供早期的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[3]；但該材料只具有骨引導(dǎo)特性，不具有骨誘導(dǎo)特性[4]，且長(zhǎng)時(shí)間放置于空氣中，材料表面易吸附空氣中的雜質(zhì)從而影響其生物活性。作為合格的骨移植材料，良好的生物相容性是首要條件。雖然目前人工骨替代物在臨床中應(yīng)用廣泛，但在人體研究中，人工骨替代物表現(xiàn)出重塑不完整的特征，?？蓹z測(cè)到殘留。臨床上在骨缺損區(qū)植入人工骨替代物后，大部分患者需要6個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間的愈合期，這就延長(zhǎng)了后期修復(fù)的時(shí)間。有學(xué)者[5]認(rèn)為，骨移植術(shù)的成功也受到其他因素的限制，包括外科手術(shù)感染、宿主骨重塑能力、材料本身吸收不足及材料毒性等。因此，對(duì)無(wú)機(jī)牛骨材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋砻嫣幚?，是提高其成骨效率、改善骨缺損修復(fù)的有效路徑之一。

等離子體（plasma）是用來(lái)描述電離氣體的術(shù)語(yǔ)，分為熱等離子體和低溫等離子體。熱等離子體作為一種表面涂層技術(shù)，可以將金屬和陶瓷噴涂到其他材料上。金屬顆粒如鈦或銀以及羥磷灰石都是通過(guò)熱等離子體噴涂技術(shù)對(duì)牙科或骨科植入物進(jìn)行處理來(lái)強(qiáng)化其生物相容性。與此相反，低溫等離子體的溫度較低，可以通過(guò)滅菌、凝血、傷口愈合和組織再生直接治療活體組織，或通過(guò)將等離子體處理的材料植入活體組織進(jìn)行間接治療。在骨和軟骨再生生物材料的處理中，低溫等離子體具有潛在的優(yōu)勢(shì)，但目前關(guān)注無(wú)機(jī)牛骨替代物經(jīng)低溫等離子體處理后生物學(xué)效應(yīng)的研究還較為少見(jiàn)[6]。

低溫等離子體進(jìn)行材料表面改性時(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)于材料表面連接大量的、不同種類(lèi)的化學(xué)功能團(tuán)，使材料表面的反應(yīng)活性顯著改善；另外該工藝還具有效率高，能耗低，安全且無(wú)二次污染，簡(jiǎn)單易行，常壓下操作時(shí)無(wú)需價(jià)格昂貴的真空設(shè)備和繁瑣耗時(shí)的操作程序等優(yōu)勢(shì)。低溫等離子體的這些優(yōu)點(diǎn)使其具有在常溫常壓環(huán)境下對(duì)骨替代材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋砻嫣幚淼目赡苄?，有望在植入前?duì)骨替代材料的特性進(jìn)行改善。本實(shí)驗(yàn)使用低溫氬氧等離子體對(duì)無(wú)機(jī)牛骨進(jìn)行表面活化，觀察活化后的無(wú)機(jī)牛骨對(duì)成骨細(xì)胞黏附、增殖和分化的影響，探討低溫氬氧等離子體能否改善無(wú)機(jī)牛骨生物學(xué)特性，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 無(wú)機(jī)牛骨（塊型，5 mm×10 mm×20 mm，煙臺(tái)正海生物科技股份有限公司）；小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素、CCK（cell counting kit）-8試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒、TritonX-100（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 主要儀器 AS400型低溫氬氧等離子體發(fā)生裝置（Plasmatreat GmbH公司，德國(guó)），BIOBASE-EL 10A型酶標(biāo)儀（濟(jì)南博科公司），CKX53型倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），Phenom Pro型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）（Phenom公司，德國(guó)），Nexsa? X型X射線光電子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀和Forma?8000型CO2培養(yǎng)箱（ThermoFisher公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和低溫氬氧等離子體活化 將無(wú)機(jī)牛骨先用紫外線燈照射消毒2 h，消毒完畢后用無(wú)菌環(huán)切刀和醫(yī)用無(wú)菌刀片將骨塊制備成直徑5 mm、高度2 mm的圓柱狀骨塊，制備完畢后再用紫外線燈照射消毒2 h，備用。使用低溫氬氧等離子體對(duì)無(wú)機(jī)牛骨進(jìn)行等離子體活化，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，不作處理的無(wú)機(jī)牛骨為對(duì)照組，每組3個(gè)樣本。低溫氬氧等離子體系統(tǒng)原理如圖1所示，它是一個(gè)尺寸為33 cm×12.5 cm的輝光放電等離子體工作區(qū)，由射頻功率為20 kHz的電源和匹配網(wǎng)絡(luò)供電。調(diào)整設(shè)備參數(shù)為電壓320 V，電流0.3 A，氣體以500 L·h-1的速度流至噴射口，借助于與控制系統(tǒng)一起工作的集成式質(zhì)量流量計(jì)，可以確保精確的流速。基板固定在鋁板上，實(shí)驗(yàn)中將骨塊固定在基板上距離低溫等離子體噴射口2.5 cm的位置，以氬氣＋體積分?jǐn)?shù)5%氧氣作為輸出氣體產(chǎn)生低溫氬氧等離子體，處理骨塊60 s[7]。

圖 1 低溫氬氧等離子體系統(tǒng)原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of low temperature argon-oxygen plasma system

筆者通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫氬氧等離子體的處理時(shí)間與骨塊表面溫度和骨塊表面形貌密切相關(guān)（圖2）。

圖 2 低溫氬氧等離子體系統(tǒng)處理時(shí)間與材料表面溫度的關(guān)系Fig 2 The relationship between treatment time of low temperature argon-oxygen plasma system and surface temperature of materials

處理時(shí)間為60 s時(shí)，骨塊表面溫度約為80 ℃，表面形貌沒(méi)有明顯變化；處理時(shí)間為60～100 s，表面溫度會(huì)緩慢上升15 ℃左右；隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，表面溫度穩(wěn)定在這一水平不再升高，但是會(huì)出現(xiàn)骨塊表面干裂及內(nèi)部連接結(jié)構(gòu)斷裂的情況（圖3）。為保證低溫氬氧等離子體發(fā)揮其活化能力又不引起骨塊表面形貌變化，本實(shí)驗(yàn)選用的處理時(shí)間為60 s。

圖 3 溫度過(guò)高導(dǎo)致骨塊內(nèi)部連接結(jié)構(gòu)斷裂 SEM × 2 000Fig 3 The excessive temperature caused the fracture of the internal connecting structure of the inorganic bone SEM × 2 000

1.2.2 SEM觀測(cè)表面形貌 使用SEM觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的表面形貌。SEM觀察前，骨塊表面涂覆鈀金以獲得更好的成像質(zhì)量，加速電壓為10 kV，放大倍數(shù)為2 000倍和10 000倍。

1.2.3 XPS分析表面元素組成 采用XPS儀對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行表面元素和化學(xué)分析，收集高分辨率C1s、O1s、Ca2p和P2p的光譜。激發(fā)源采用Al kα射線（hv=1 253.6 eV），工作電壓12.5 kV，燈絲電流16 mA，并進(jìn)行10次循環(huán)的信號(hào)累加。測(cè)試通能為40 eV，步長(zhǎng)為0.1 eV，并以C1s=284.60 eV結(jié)合能為能量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行荷電校正。實(shí)驗(yàn)組骨塊在空氣中暴露2 d后，再用同樣的方法分析該組表面元素組成。

1.2.4 細(xì)胞早期黏附 使用24孔板，將MC3T3-E1細(xì)胞以每孔2×106個(gè)細(xì)胞的密度接種在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨塊上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水（30%、50%、70%、90%、100%乙醇各脫水15 min），噴金處理后于SEM下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用96孔板，調(diào)整MC3T3-E1細(xì)胞密度至每毫升3×105個(gè)，取100 μL細(xì)胞懸液接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨塊表面，2 h后沿孔壁邊緣緩慢加入100 μL培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)2 h、4 h、1 d時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞在骨塊表面的生長(zhǎng)情況。在1、3、5 d更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液200 μL，隨后每孔加入10 μL CCK-8試劑，將96 孔板置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn) 使用96孔板，調(diào)整MC3T3-E1細(xì)胞密度為每毫升5×105個(gè)，取100 μL細(xì)胞懸液接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨塊表面，用含抗壞血酸成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第7、14天后使用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每孔中加入120 μL細(xì)胞裂解液，經(jīng)反復(fù)凍融處理使細(xì)胞膜破裂，收集細(xì)胞，按ALP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處OD值，根據(jù)公式換算出ALP的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 表面形貌

SEM觀察顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的表面形貌沒(méi)有明顯差異，提示等離子體表面處理沒(méi)有對(duì)骨塊表面造成明顯的損傷，仍表現(xiàn)為粗糙的表面（圖4）。

圖 4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的表面形貌 SEMFig 4 The surface morphology of the experimental group and control group SEM

2.2 XPS檢測(cè)

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的表面元素百分比如表1所示，可以看到兩組骨塊表面的元素組成相同，但百分比存在差異。實(shí)驗(yàn)組骨塊表面碳（C）元素百分比減少，氧（O）、磷（P）、鈣（Ca）元素百分比有所增加。

表 1 兩組骨塊表面元素百分比的XPS分析Tab 1 XPS analysis of the percentage of bone surface elements in two groups %

各個(gè)元素XPS峰值結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)低溫氬氧等離子體處理后，在 531.1 eV 處O1s光電子強(qiáng)度提高，說(shuō)明氬氣（Ar）和氧氣（O2）的混合氣體在骨塊表面產(chǎn)生了活性氧基團(tuán)（圖5B）；此外，實(shí)驗(yàn)組Ca2p（347.1 eV）、P2p（130.6 eV）的光電子強(qiáng)度也有明顯增加（圖5C、D）。實(shí)驗(yàn)組C1s在284.60 eV的光電子強(qiáng)度明顯減少（圖5A），說(shuō)明低溫氬氧等離子體可以有效去除骨塊表面的有機(jī)雜質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)組處理后放置于空氣中暴露2 d，再次進(jìn)行XPS檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6：實(shí)驗(yàn)組表面元素百分比呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，骨塊表面的碳（C）元素百分比明顯增加，而氧（O）、磷（P）、鈣（Ca）元素百分比均減少。

2.3 細(xì)胞早期黏附

兩組骨塊表面MC3T3-E1細(xì)胞的早期黏附情況見(jiàn)圖7和圖8。對(duì)照組：細(xì)胞大多呈球形黏附于材料表面（圖7A），進(jìn)一步放大可見(jiàn)細(xì)胞成球形且有偽足形成，但無(wú)明顯鋪展（圖7B）。實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞多數(shù)為鋪展?fàn)顟B(tài)，呈多邊形（圖7C紅線標(biāo)記處），進(jìn)一步放大可見(jiàn)細(xì)胞鋪展較為充分，周?chē)由斐龊穸L(zhǎng)的突觸（圖7D紅線標(biāo)記處）。由圖8可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組表面成骨細(xì)胞的黏附面積百分比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4 細(xì)胞增殖

CCK-8法測(cè)定的MC3T3-E1細(xì)胞增殖結(jié)果見(jiàn)圖9，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞在兩組骨塊上的增殖數(shù)量逐漸增加，對(duì)照組1 d與3 d、1 d與5 d的細(xì)胞增殖數(shù)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組1 d與5 d、對(duì)照組1 d與實(shí)驗(yàn)組5 d的細(xì)胞增殖數(shù)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)1、3、5 d時(shí)的細(xì)胞增殖數(shù)量均高于相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖 5 XPS檢測(cè)兩組骨塊表面元素的變化Fig 5 XPS detected changes in bone surface elements in the two groups

圖 6 實(shí)驗(yàn)組即刻及暴露2 d后表面各元素百分比Fig 6 The percentage of surface elements in the experimental group after immediate and 2 days of exposure

2.5 細(xì)胞分化

MC3T3-E1細(xì)胞的ALP檢測(cè)及分析結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可見(jiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，MC3T3-E1細(xì)胞在兩組骨塊上的ALP活性逐漸增加。對(duì)照組培養(yǎng)7 d與培養(yǎng)14 d、實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)7 d與培養(yǎng)14 d的ALP活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)7 d時(shí)，MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P>0.05），而在培養(yǎng)14 d時(shí)，MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖 7 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組表面MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài) SEMFig 7 MC3T3-E1 cell morphology on the surface of the control group and the experimental group SEM

圖 8 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表面成骨細(xì)胞的黏附面積百分比Fig 8 Percentage of adherent surface area of osteoblasts in the experimental group and control group

圖 9 MC3T3-E1細(xì)胞增殖結(jié)果Fig 9 Proliferation of MC3T3-E1 cells

圖 10 MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性檢測(cè)結(jié)果Fig 10 ALP activity of MC3T3-E1 cells

3 討論

作為近年來(lái)使用頻率較高的一種骨替代物，無(wú)機(jī)牛骨具有良好的生物相容性，形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)與礦化人骨相似，因此在臨床上應(yīng)用廣泛，并取得良好的成骨效果。但臨床實(shí)踐也發(fā)現(xiàn)，該材料存在不易被機(jī)體完全吸收的缺點(diǎn)，因此如何改善其成骨效果成為近年的研究熱點(diǎn)。Schmitt等[8]用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子修飾無(wú)機(jī)牛骨粉使其具有骨誘導(dǎo)功能，增強(qiáng)成骨效果，但蛋白質(zhì)合成工序復(fù)雜、價(jià)格昂貴，植入體內(nèi)可能會(huì)引起免疫反應(yīng)或感染，限制其臨床應(yīng)用。高媛媛等[9]使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列（arginine glycine aspartic acid，RGD）修飾無(wú)機(jī)小牛骨粉來(lái)增強(qiáng)成骨效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)牛骨與RGD物理結(jié)合后可促進(jìn)細(xì)胞黏附及分化，但對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有促進(jìn)作用，且RGD溶液的制備需嚴(yán)格控制濃度，臨床推廣存在一定的困難。由此可見(jiàn)，如能找到一種簡(jiǎn)單、高效的表面處理方式來(lái)增強(qiáng)無(wú)機(jī)牛骨的成骨效果無(wú)疑非常有助于其臨床應(yīng)用。

等離子體是一種由自由電子和帶電離子為主要成分的物質(zhì)形態(tài)，廣泛存在于宇宙中，常被視為物質(zhì)的第四態(tài)，被稱(chēng)為等離子態(tài)[10]。等離子體已廣泛應(yīng)用于工業(yè)表面處理，包括清洗、活化和表面鍍膜[11]，而低溫等離子體具有低溫、高效的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[11]。Duske等[12]采用低溫氬氣等離子體處理不同表面的鈦片，之后復(fù)合成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，SEM下觀察到處理組細(xì)胞的伸展程度明顯提高。稀有氣體的混合物，如氬（Ar）和氧（O2）以一定比例混合后，作為亞穩(wěn)稀有氣體種類(lèi)可攜帶大量的能量，在低溫等離子體的環(huán)境中可以通過(guò)能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)導(dǎo)致活性氧物質(zhì)的形成，使得材料表面能大幅增加[13]。由此推測(cè)，若使用氬氣和氧氣的混合氣體產(chǎn)生的低溫等離子體處理無(wú)機(jī)牛骨表面，可能會(huì)產(chǎn)生更理想的骨反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)使用氬氣+5%氧氣產(chǎn)生的低溫氬氧等離子體處理無(wú)機(jī)牛骨塊，通過(guò)SEM觀測(cè)其表面形貌，可知對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的表面形貌沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明低溫氬氧等離子體不會(huì)破壞無(wú)機(jī)牛骨表面的結(jié)構(gòu)，這與之前的研究[14-15]結(jié)果相同。低溫氬氧等離子體處理骨塊前后的XPS結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的氧（O）、鈣（Ca）、磷（P）元素峰值均較對(duì)照組增高，而碳（C）元素峰值較對(duì)照組減少，這可能是因?yàn)榈入x子體處理后會(huì)引起材料表面的化學(xué)變化，具體表現(xiàn)為碳?xì)浠衔锖康臏p少和羥基（-OH）、羧基（-COOH）等官能團(tuán)的增加[16]。自然界中存在的碳元素會(huì)不可避免地附著在材料表面，碳在表面的吸附會(huì)引起生物活性降低[17]，從而影響無(wú)機(jī)牛骨和成骨細(xì)胞的結(jié)合；而等離子體的表面清潔[18]作用會(huì)有效去除無(wú)機(jī)牛骨表面的碳雜質(zhì)，有利于成骨細(xì)胞的附著。Fran?a等[19]在2014年指出，從生物陶瓷中去除這些雜質(zhì)是很重要的，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響材料植入骨再生過(guò)程中的力學(xué)性能。因此筆者認(rèn)為，低溫等離子體可以去除材料表面的雜質(zhì)，有利于細(xì)胞附著，后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一推測(cè)。氧元素含量增加有助于增加材料表面能，促進(jìn)細(xì)胞早期黏附，而鈣、磷作為骨組織代謝中的重要元素，其含量的增加同樣有利于細(xì)胞的早期附著及形成良好的細(xì)胞形態(tài)[20]。然而，低溫等離子體處理材料后，表面化學(xué)構(gòu)成隨著時(shí)間延長(zhǎng)也會(huì)發(fā)生改變。有學(xué)者[21]進(jìn)行了低溫等離子體處理鈦片的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)等離子體處理后的鈦片表面的接觸角均值隨著在空氣中放置時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增大，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組暴露于空氣中2 d后，其表面元素發(fā)生了明顯變化。這可能是由于材料表面官能團(tuán)半衰期較短，表面氧化膜與空氣中的碳?xì)浠衔锇l(fā)生反應(yīng)，材料親水性下降[22]。

成骨細(xì)胞早期黏附的觀測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組表面的成骨細(xì)胞呈球形，未見(jiàn)明顯的伸展，而實(shí)驗(yàn)組表面的成骨細(xì)胞呈多邊形扁平狀，表現(xiàn)出良好的黏附和伸展性能，同時(shí)可以觀察到成骨細(xì)胞在材料表面延伸出厚而長(zhǎng)的突觸。這一結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)等離子體活化后的無(wú)機(jī)牛骨有利于成骨細(xì)胞的早期黏附。這可能與等離子體處理后材料表面氧元素增加和碳雜質(zhì)降低有關(guān)。有研究[23-24]證明，氧元素含量升高，碳元素含量降低有利于增加材料表面的親水性和表面能，而材料的表面能在促進(jìn)早期細(xì)胞黏附中起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)低溫氬氧等離子體處理過(guò)的骨塊表面細(xì)胞增殖明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)活化的骨塊表面可有效提高成骨細(xì)胞的增殖能力，這可能與骨塊表面活性增加有關(guān)。研究[25]表明，生物材料的表面特征可以直接影響細(xì)胞反應(yīng)，從而影響新組織的生長(zhǎng)速度和質(zhì)量。成骨細(xì)胞在分化早期即表達(dá)ALP，ALP被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志，因此ALP檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的成骨細(xì)胞特異性檢測(cè)方法。本研究ALP檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在7、14 d的成骨活性均高于對(duì)照組，說(shuō)明等離子體的表面活化對(duì)骨形成具有一定的促進(jìn)作用。

無(wú)機(jī)牛骨作為一種人工骨替代物，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于種植及引導(dǎo)組織再生領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)使用低溫氬氧等離子體對(duì)其進(jìn)行活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)處理的無(wú)機(jī)牛骨對(duì)細(xì)胞黏附、增殖及分化均有一定的促進(jìn)作用，同時(shí)不改變材料本身的表面形貌及化學(xué)組成。綜合本研究結(jié)果可以認(rèn)為，低溫氬氧等離子體活化的無(wú)機(jī)牛骨在增強(qiáng)成骨能力方面有良好的前景，但還需進(jìn)一步研究。