劉俊圻 陳藝尹 楊文賓

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院口腔頜面外科 成都 610041

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell）是主要存在于骨髓的一類具有自我更新及多向分化為骨相關結(jié)構潛能的干細胞[1]。在生理狀態(tài)下，作為成骨細胞和骨髓脂肪細胞的共同祖細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化與成脂向分化的相互平衡受到嚴格的時空控制，以保障骨骼健康。在衰老或激素紊亂等病理刺激下，骨髓間充質(zhì)干細胞優(yōu)先向脂肪細胞分化，導致骨髓脂肪組織沉積以及進行性骨質(zhì)丟失。年齡相關的骨質(zhì)疏松癥的特點即是骨量減少，骨髓中脂肪組織過度沉積。骨微結(jié)構的改變增大了骨折的風險，為患者的日常活動帶來不便。

作為成骨細胞的最主要來源，骨髓間充質(zhì)干細胞一直被視作解決骨相關疾病的一個跳板[2-3]。然而，由于骨髓間充質(zhì)干細胞在分化為成骨細胞的同時，也能分化為軟骨細胞、脂肪細胞等其他結(jié)構，給其臨床應用帶來不確定性，故研究骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的明確機制顯得尤為重要。在過往的研究中，研究者多把重心放在了一些外在的影響因素以及轉(zhuǎn)錄因子上，隨著表觀遺傳學研究的不斷發(fā)展，學界對于骨髓間充質(zhì)干細胞命運決定機制的理解及研究得以進展。

表觀遺傳是指不改變基因本身的核苷酸序列，但基因的表達卻發(fā)生了可遺傳性改變的一種遺傳方式，通常包括DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA（Micro RNA，miRNA）以及RNA甲基化等。其中，DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA等已被公認為參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的重要表觀遺傳學標記，但關于RNA腺嘌呤6-甲基化修飾在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化中扮演的角色卻鮮少被提及[4-6]。新近的一系列研究則逐漸填補了這一空白，提示RNA腺嘌呤6-甲基化修飾調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的作用不容小覷。

1 RNA腺嘌呤6-甲基化修飾介紹

RNA腺嘌呤6-甲基化修飾是指RNA腺嘌呤的6號位N原子被甲基化，形成6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A），是真核生物RNA上豐度最高的表觀遺傳學修飾。比如平均每個mRNA上就有3~5個m6A位點[7-8]。

1.1 RNA腺嘌呤6-甲基化修飾的調(diào)節(jié)因素

RNA腺嘌呤6-甲基化修飾是動態(tài)可逆的，其功能的發(fā)揮依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶以及讀取蛋白三者的共同調(diào)節(jié)[9]。

甲基轉(zhuǎn)移酶負責催化m6A的形成。在哺乳動物中，甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣（methyltransferase like，METTL）3、METTL14、腎母細胞瘤1相關蛋白（Wilms tumour 1-associated protein，WTAP）以及KIAA1429。METTL3與METTL14通過形成異源二聚體發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用，其中METTL13是催化亞基，而METTL14則是促進RNA結(jié)合的必要成分[10-13]。WTAP雖無直接的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但對于引導METTL3-METTL14復合體至核散斑起著至關重要的作用[14-15]。

去甲基化酶FTO和ALKBH5則可“擦除”這種甲基化修飾。FTO和ALKBH5雖然在酶動力學上表現(xiàn)相當，但在組織分布以及具體的功能上卻表現(xiàn)出一定的特異性。FTO在大腦以及脂肪組織中表達水平最高，并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及脂肪形成的調(diào)控[16-20]。ALKBH5則在睪丸中分布最多，并與精子的正常形成息息相關，Alk-bh5基因缺陷會導致雄性小鼠不育[20]。

m6A通過改變RNA結(jié)構或者吸引特定的RNA讀取蛋白從而影響RNA的代謝[21]。常見的讀取蛋白主要包括含YTH結(jié)構域的蛋白質(zhì)以及真核生物起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）3。對哺乳動物來說，含YTH結(jié)構域的蛋白質(zhì)主要包括YTHDC1-2和YTHDF1-3[22]。YTH結(jié)構域可折疊成疏水的袋狀結(jié)構，從而直接容納并且緊密結(jié)合RNA m6A殘基，介導下游RNA的翻譯、降解以及選擇性剪切等過程[23-25]。哺乳動物和酵母中的m6A大多位于mRNA終止密碼子附近和3"端非翻譯區(qū)[26-28]，eIF3則可以直接或者在YTHDF1的誘導下間接與mRNA 5"端非翻譯區(qū)的m6A結(jié)合，而影響mRNA的翻譯效率[29]。值得注意的是，隨著表觀遺傳學的高速發(fā)展，不斷有新的酶或蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)可能成為上述三類物質(zhì)的新成員，豐富了學界對RNA腺嘌呤6-甲基化修飾的理解與認識[9,29-30]。

1.2 RNA腺嘌呤6-甲基化修飾對干細胞分化的調(diào)控

RNA m6A位點或水平的變化可能導致在個體正常生長、發(fā)育過程中負責干細胞分化的關鍵基因表達增強或受阻，從而調(diào)控干細胞的分化。過往的一系列研究[31-34]表明，RNA m6A在胚胎干細胞、造血干細胞、神經(jīng)干細胞等干細胞的分化過程中都發(fā)揮了十分重要的作用。

Geula等[35]發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞的原始態(tài)和始發(fā)態(tài)受到RNA m6A的調(diào)控，認為m6A可降低mRNA的穩(wěn)定性，抑制m6A會使優(yōu)勢基因表達更加明顯。故敲除原始態(tài)胚胎干細胞內(nèi)Mettl3之后，原始態(tài)胚胎干細胞將傾向于維持幼稚狀態(tài)，更難進入始發(fā)態(tài)，分化受到了抑制。同理，敲除始發(fā)態(tài)胚胎干細胞內(nèi)Mettl3會抑制其自我更新，而促進其不斷分化[35-36]。

Zhang等[37]發(fā)現(xiàn)，RNA m6A通過YTHDF2介導notch1a mRNA和rhocamRNA的穩(wěn)定性，參與調(diào)控造血內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮基因和造血基因表達平衡，從而影響造血干細胞的生成。Mettl3的缺失將導致動脈內(nèi)皮發(fā)育相關的mRNA的豐度增加，內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過程受到阻斷。此外，Weng等[38]在研究中還發(fā)現(xiàn)，METTL14通過m6A抑制造血干細胞和部分急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細胞分化，抑制METTL14則會促進上述細胞的終末髓系分化并抑制AML細胞的增殖，揭示了m6A在急性髓系白血病的發(fā)病機制中的重要作用。

在神經(jīng)干細胞中，m6A多在與轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)發(fā)育、細胞周期和神經(jīng)元分化有關的mRNA上富集。Yoon等[39]發(fā)現(xiàn)無論敲除胚胎小鼠大腦中的Mettl3還是Mettl14，均會降低大腦內(nèi)m6A水平并延長放射狀膠質(zhì)細胞的細胞周期。Li等[40]發(fā)現(xiàn)FTO缺乏會抑制小鼠體內(nèi)成年神經(jīng)干細胞的增殖和分化，可能是由于m6A標記的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子通路的幾個關鍵因子的表達發(fā)生改變。Wang等[41]敲除小鼠胚胎神經(jīng)干細胞內(nèi)Mettl14后，神經(jīng)干細胞增殖受到抑制以及分化提前，即m6A可促進胚胎神經(jīng)干細胞的增殖并預防其過早分化，從而保障神經(jīng)干細胞的儲備。值得一提的是，該團隊還首次提出m6A可通過影響組蛋白H3賴氨酸27乙酰化、組蛋白H3賴氨酸27三甲基化、組蛋白H3賴氨酸4三甲基化在內(nèi)的部分組蛋白修飾而調(diào)節(jié)基因的表達。Chen等[42]發(fā)現(xiàn)，敲除成年神經(jīng)干細胞內(nèi)的Mettl3，會抑制其增殖并導致其更傾向于分化為膠質(zhì)狀細胞。同時，敲除Mettl3減少了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Zeste基因增強子同源物（enhancer of Zeste homolog，Ezh）2和賴氨酸27三甲基化組蛋白H3的表達，而Ezh2的過表達可以恢復神經(jīng)干細胞的正常增殖與分化，再次揭示m6A與組蛋白修飾在調(diào)控神經(jīng)干細胞增殖、分化方面存在著緊密聯(lián)系。

此外，m6A mRNA修飾與膠質(zhì)母細胞瘤干細胞（glioblastoma stem cell）的自我更新和腫瘤發(fā)生緊密相關。抑制METTL3或METTL14可顯著促進人膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的生長、自我更新與腫瘤發(fā)生；相反，METTL3的過表達或FTO的抑制則會抑制膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的生長和自我更新。同時，將缺乏FTO的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞移植到小鼠體內(nèi)，能減慢腫瘤進展并延長小鼠壽命，為治療膠質(zhì)母細胞瘤提供了一個潛在的靶點[32]。

2 RNA m6A調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的機制

關于RNA腺嘌呤6-甲基化修飾在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化過程中發(fā)揮的作用，目前的研究主要局限于甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3以及去甲基化酶FTO。總體來說，在骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)，METTL3可促進其成骨向分化，而FTO的表達上調(diào)則會抑制其成骨向分化，促進其成脂向分化。其他與RNA m6A形成相關的因素在此過程中發(fā)揮的作用仍有待進一步研究。

2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3

METTL3廣泛存在于小鼠骨細胞以及骨髓中，然而極少見于生長板的軟骨區(qū)域[43]。體外誘導小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的過程伴隨著Mettl3在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達的增加，提示m6A可能與骨髓間充質(zhì)干細胞譜系分化密切相關[44]。條件性敲除小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)Mettl3基因（Prx1-Cre;Mettl3fl/fl）后，骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)m6A的豐度降低，小鼠出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松的病理表型（骨量減少，骨質(zhì)變?nèi)跻约肮撬柚窘M織沉積增加）。同時，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠體內(nèi)破骨細胞狀態(tài)更為活躍。與前述發(fā)現(xiàn)相符的是，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠生長板的生長發(fā)育幾乎不受影響[43]。

體外細胞學實驗解釋了這種現(xiàn)象：相比于對照組小鼠，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化受到抑制，成脂向分化則更加活躍。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在Lepr-Cre;Mettl3fl/fl小鼠身上，表明Mettl3對成體骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化同樣不可或缺。RNA測序結(jié)果進一步證實，Mettl3參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的譜系分化：Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠體內(nèi)Dlx5、Sp7、Alpl、Bglap等成骨相關基因表達受到抑制，而成脂相關基因Pparg、Plin1、Fabp4的表達上調(diào)[43]。

Mettl3的過表達能在一定程度上緩解雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)敲入Mettl3基因（Prx1-Cre;Mettl3KI/KI），相比于僅行卵巢切除術的對照組來說，成骨細胞數(shù)目增加，骨小梁密度和骨量的減少與骨髓脂肪組織沉積的程度均有所降低。值得注意的是，不同于敲除Mettl3基因，敲入Mettl3基因并未影響破骨細胞的活性[43]。

上述實驗結(jié)果提示，METTL3介導的m6A水平上升促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化，抑制了其成脂向分化。對于具體的分子機制，不同研究者得出了不同的結(jié)論。

Wu等[43]認為，甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）/甲狀旁腺素1受體（parathyroid hormone-1 receptor，PTH1R）信號軸是m6A調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞分化的重要下游通路。分析發(fā)現(xiàn)，在PTH1R翻譯終止密碼子附近有高富集和特異性的m6A峰，敲除Mettl3不影響Pth1r的轉(zhuǎn)錄，但大大降低了PTH1R的翻譯效率。PTH1R作為PTH的受體，對于PTH調(diào)節(jié)骨代謝必不可少[45-46]。在正常生理狀態(tài)下，小劑量間歇性的PTH可促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化，并抑制其成脂向分化[47-48]。不同于對照組，Prx1-Cre;Mettl3fl/fl小鼠對小劑量間歇性的PTH并不敏感，但這種情況可通過腺病毒介導的PTH1R過表達有所緩解，進一步證實了m6A可通過影響PTH/PTH1R信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的分化方向。值得注意的是，過表達PTH1R只能部分緩解癥狀，提示甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3除了Pth1r外，還可能存在其他的作用靶點[43]。

Tian等[44]認為，m6A可通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein-kinase B，PKB/AKT）參與骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化。PI3K-AKT通路作為細胞內(nèi)十分常見的信號通路，已被廣泛證實對于調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞譜系分化、維持骨代謝平衡具有重要意義[49-52]。在利用短發(fā)夾RNA（shorthairpin RNA，shRNA）下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)Mettl3表達后，骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化以及礦化潛能受到抑制。利用Kyoto基因與基因組數(shù)據(jù)庫分析在此過程中下調(diào)的細胞通路，結(jié)果顯示與成骨分化最為相關的為PI3K-AKT通路。蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，敲除Mettl3之后，AKT的磷酸化程度降低，與RNA測序結(jié)果一致，進一步證實PI3KAKT信號軸是Mettl3調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的重要下游通路。

此外，METTL3可通過選擇性剪接血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA，影響VEGF的表達，從而參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化。VEGF作為血管生成最有效的誘導因子之一，通過促進局部微循環(huán)和增加血管密度促進骨組織發(fā)育[53-54]。早前研究[55]發(fā)現(xiàn)，Vegfa-164 mRNA和Vegfa-188 mRNA參與調(diào)控間充質(zhì)干細胞的增殖、分化。敲除Mettl3可顯著降低Vegfa-164 mRNA和Vegfa-188 mRNA的水平，為m6A選擇性剪接Vegfa mRNA從而參與骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化提供新的證據(jù)。

Yao等[52]發(fā)現(xiàn)，METTL3通過催化Janus激酶（Janus kinase，JAK）1的mRNA形成m6A，隨后讀取蛋白YTHDF2通過識別m6A促進JAK1降解，下調(diào)JAK1/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）5/CCAAT增強子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein，C/EBP）β信號通路的表達，從而抑制脂肪形成早期骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂向分化。遺憾的是，該通路對于骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的具體作用還有待進一步研究。

2.2 甲基化酶FTO

早期研究[18]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO通過調(diào)控m6A豐度選擇性剪接成脂調(diào)控因子Runt相關轉(zhuǎn)錄因子（Runtrelated transcription factor）1的mRNA，從而在調(diào)節(jié)脂肪生成中發(fā)揮重要作用。研究者[56]通過分析人與小鼠的血清樣本發(fā)現(xiàn)，相比于年輕和正常組，年長和骨質(zhì)疏松組的血清中FTO含量更高，m6A的含量更低；同時，在體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成脂向分化的過程中，F(xiàn)TO的含量增加，而成骨向分化的過程則伴隨著FTO含量的減少，為探究FTO對于骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的具體影響提供了線索。

Shen等[56]研究發(fā)現(xiàn)，生長發(fā)育因子（growth differentiation factor，GDF）11-FTO-過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR）γ信號軸可以促進骨髓間充質(zhì)細胞的成脂向分化，抑制其成骨向分化。GDF11是屬于TGF-β超家族的一種蛋白質(zhì)，早前的研究[57]表明其能促進骨吸收并抑制成骨細胞分化。體外實驗發(fā)現(xiàn)，GDF11可通過C/EBPα促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)FTO的表達，降低RNA m6A的豐度，并且FTO與RNA m6A變化的程度與GDF11的使用劑量呈正比。同時，GDF11促進骨髓間充質(zhì)干細胞成脂向分化、抑制其成骨向分化作用的正常發(fā)揮有賴于FTO的正常酶活性。之前的研究[19,58]已證明，PPARγ可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂向分化而抑制其成骨向分化，同時作為FTO的下游分子介導脂肪前體細胞的分化。Shen等發(fā)現(xiàn)， PPARγ可作為GDF11-FTO通路的下游分子，對于GDF11與FTO調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞分化方向不可或缺。GDF11-FTO通過結(jié)合并去甲基化修飾PpargmRNA，影響PpargmRNA的翻譯效率，導致后者的表達增加，從而抑制了骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化。此外，體內(nèi)實驗表明，特異性敲除小鼠成骨細胞內(nèi)Fto可以抑制PPARγ、脂聯(lián)素（adiponectin）的表達，促進Osterix的表達，并在一定程度上緩解了小鼠的骨量減少的癥狀。

3 展望

隨著近年來表觀遺傳領域的不斷發(fā)展，表觀遺傳學修飾調(diào)控干細胞分化的具體機制也逐漸成為學界關注的熱點。近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，m6A在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化過程中發(fā)揮了重要的作用，為研究m6A在骨骼健康和疾病中的關鍵調(diào)控作用提供了一個新的視角。然而，目前的研究還不足以對m6A調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞命運決定的具體機制進行較為清楚的闡釋。一方面，m6A在骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)的具體位點還不夠清楚；另一方面，甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化修飾酶以及m6A讀取蛋白三者在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化過程中發(fā)揮的具體作用也有待進一步研究。同時，隨著研究的深入以及相關檢測技術的進步，比如miCLIP技術的出現(xiàn)，意味著可以定位細胞內(nèi)mRNA的單個m6A位點 ，有理由相信RNA腺嘌呤6-甲基化修飾調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的具體機制將得到更為深入的闡釋，為相關的基礎研究以及臨床應用帶來重要的啟發(fā)。