徐主恩 章 波 黎 榮 洪家旺 陳 亮 吳永剛

（上海市浦東醫(yī)院急診科，上海 201300）

隨著科技發(fā)展和社會進步，心血管藥物及器械取得突破性的進展，但心肌梗死死亡率仍然居高不下。近年來，干細胞為基礎(chǔ)的細胞治療成為心肌梗死研究的熱點，其機制主要為旁分泌效應(yīng)[1]。雖然干細胞治療心肌梗死安全可行，但是細胞移植后在損傷區(qū)域分布的數(shù)量較少，且細胞在移植后凋亡較快，是否致瘤也不明確[2-4]。因此，尋找新的靶點和方法實施干細胞對心梗的治療具有重要意義。外泌體是一種直徑在30～120 nm 有膜結(jié)構(gòu)的納米囊泡，形成于細胞小體，并被釋放到細胞外周，能夠通過傳遞蛋白、microRNA 等介導(dǎo)細胞間的信號。研究報道，干細胞來源的外泌體在心保護方面作用顯著，其能夠抑制心肌細胞凋亡、促進新生血管生成、改善心肌梗死后功能[5-9]。但是脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose tissue-derived stromal cell，ADSCs）來源的外泌體及其對心肌梗死的治療，卻鮮有報道。本研究擬將ADSCs 來源的外泌體，通過免疫印跡和透射電鏡的方法進行鑒定，并用純化后的外泌體處理缺血缺氧24 h 后H9C2 細胞，觀察其凋亡和增殖的變化，從而確定ADSCs 來源的外泌體對心肌梗死后心肌細胞的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

3～4 周雄性SD 大鼠（50～60 g），由第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。培養(yǎng)基DMEM/F12、培養(yǎng)基1640 和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海漢恒生物公司；CCK8 試劑盒購自浙江碧云天生物公司；外泌體提取試劑盒購自上海領(lǐng)科生物；CD9、CD63、CD81 抗體購自美國Abcam 公司；山羊抗小鼠IgG二抗購自英國Invitrogen 公司。

1.2 ADSCs 的分離、培養(yǎng)

大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后，取大鼠腹股溝處脂肪并用無菌刀片切碎成糊狀，用0.15%的Ⅳ型膠原酶在37℃消化45 min，1 500 r/min 離心5 min，去除懸浮的上清液和脂肪，加入培養(yǎng)液：DMEM/F12+15% FBS+1% penicillin/streptomycin，將 細胞重懸，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置入37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后換液，去除未貼壁細胞。當細胞融合達80%～90%時，進行細胞1：2 傳代，傳至第4 代待用。

1.3 ADSCs 外泌體的提取

第4 代ADSCs 無血清無氧培養(yǎng)48 h，收集細胞上清液，在4℃條件下，2 000 r/min 離心20 min，除去殘渣；轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/3 體積的外泌體分離液；顛倒直至完全混勻，放4℃過夜。4℃過夜后可見白色渾濁形成；4℃，5 000 r/min，離心30 min 棄上清，再次重復(fù)以上離心。剩余的沉淀即為外泌體。

1.4 外泌體電鏡觀察

取分離純化外泌體 8 μL，加入等體積平衡鹽PBS 溶液稀釋后滴加于2 mm 的載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1 min，用濾紙吸去多余液體，用3%（w/v）磷鎢酸鈉溶液（pH6.8）室溫負染5 min，用雙蒸水洗后室溫晾干，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 免疫印跡檢測

將提取的外泌體用0.1 mol/L PBS 清洗后加Radio-Immunoprecipitation Assay（RIPA）buffer進行細胞裂解。取上清液，用Bradford 法測蛋白濃度，于100℃水中煮5 min，離心備用。制備分離膠，加樣，SDS-PAGE 電泳，取出膠板進行轉(zhuǎn)膜，染膜，然后用一抗CD9（1∶1 000）、CD63（1∶1 000），CD81（1∶2 000），4℃孵育過夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。取膜后TBST 漂洗，用保鮮膜包好PVDF 膜，暗室中用X 膠片感光、顯影、定影。

1.6 H9C2 細胞凋亡檢測

分別取24 孔板中單獨培養(yǎng)和10 μg 外泌體處理48 h 的H9C2 細胞。用4%多聚甲醛固定10 min，用0.3% Triton X-100 通透10 min，每孔加100 μL TUNEL 檢測試劑，37℃避光孵育60 min，PBS 洗滌 3 次，用DAPI 染色5 min，用PBS 洗滌3 次后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 H9C2 細胞增殖能力檢測

分別取單獨培養(yǎng)（外泌體處理0 h）和外泌體處理（20 μg/mL）24 h、48 h 和72 h 的H9C2細胞。分別經(jīng)胰酶消化制成單細胞懸液，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，濃度為3×103細胞/孔，待細胞貼壁后，分別用10 μg ADSC-exosome 處理，每孔加 5 μL CCK8，反應(yīng)3 h 后，用酶標儀進行檢測，450 nm 波長處測定96 孔板上每個孔的吸光度值（OD）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組之間的差異采用單因素方差分析（one-way，ANONA）。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs 形態(tài)特征

細胞接種24 h 后，將培養(yǎng)基棄掉，并反復(fù)用PBS 清洗后，可見瓶底有零星的貼壁細胞，形態(tài)呈多角形或梭形即為ADSCs。培養(yǎng)3 d 后，ADSCs 呈團簇狀聚集生長。傳代后，細胞呈長梭形，兩端有較長突起，均勻分布生長。傳至第4 代時，細胞純度可達99%以上。第1 代至第4 代細胞形態(tài)變化不明顯（圖1）。

圖1 ADSCs 形態(tài)特征，標尺=50 μmFig 1 Morphology of ADSCs，bar=50 μm

2.2 外泌體的形態(tài)和表形特征

透射電鏡下ADSC 外泌體呈圓形或橢圓形，直徑30～120 nm，有完整胞膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)（圖2）。免疫印跡結(jié)果證實其表達外泌體表面標志CD9、CD63 和CD81（圖3）。

2.3 H9C2 細胞的凋亡檢測

在缺血缺氧24 h 又經(jīng)ADSCs 外泌體處理48 h之后，TUNEL 檢測結(jié)果顯示H9C2 細胞凋亡的數(shù)量相比于未處理組有明顯的下降（圖4）。在光鏡下可見經(jīng)過外泌體處理后的H9C2 細胞，其細胞狀態(tài)相對更好。以上結(jié)果提示ADSCs 外泌體抑制缺血缺氧H9C2 細胞的凋亡。

圖2 ADSCs 外泌體的透射電鏡觀察Fig 2 Electron micrographs of ADSCs-derived exosomes

圖3 ADSCs 外泌體表達CD9、CD63、CD81 標記蛋白Fig 3 Exosomes secreted from ADSCs were identified by protein marker CD9，CD63，and CD81

2.4 H9C2 細胞的增殖檢測

CCK8 檢測結(jié)果提示H9C2 細胞在經(jīng)過ADSCs處理24 、48 h 和72 h 后，其增殖能力相較于對照組有明顯的增強（圖5）。說明ADSCs 外泌體促進缺血缺氧H9C2 細胞的增殖。

3 討論

多種干細胞可用于治療心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病。ADSCs 可從皮下脂肪獲得，取材方法更為簡單，容易被患者所接受[10]，而且受年齡影響比較小，年長患者依然可以獲得活力較好的ADSCs[11-12]。脂肪干細胞的增殖能力很強，可在短時間內(nèi)獲得大量活力較好的細胞。ADSCs 在基礎(chǔ)研究和臨床移植中取得了較好治療效果[13]。但是仍面臨一些障礙：細胞在損傷區(qū)滯留率比較低，細胞植入體內(nèi)后存活率也比較低，雖早期有一定作用，但長期保護作用卻未知[14-15]。

圖4 H9C2 細胞經(jīng)ADSCs 外泌體處理48 h 后（圖B），相比于未處理組（圖A），細胞凋亡數(shù)量明顯減少，bar=25 μmFig 4 The apoptosis of H9C2 cells was significantly reduced after 48 h exosomes treatment（B）with comparison to no treatment（A），bar=25 μm

圖5 H9C2 細胞的增殖能力Fig 5 Proliferation of H9C2 cells

而ADSCs 外泌體既可以起到對心的保護作用，又可避免以上問題，所以成為新的研究熱點。實際上，外泌體確實可以通過生長因子、趨化因子、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、基因和RNA 起到一定作用。作為一種膜囊泡，外泌體不僅有裝載大量貨物的能力，但也能保護蛋白質(zhì)和RNA 等物質(zhì)的降解酶或化學(xué)物質(zhì)[16]。而且，外泌體可以減少心肌細胞的凋亡，影響心重構(gòu)，改善心肌功能。

本實驗用對H9C2 細胞進行缺血缺氧的培養(yǎng)方式在體外建立心梗模型。ADSCs 外泌體對H9C2 細胞處理后，顯示其凋亡減少，增殖能力變強。所以，ADSCs 外泌體對心肌梗死有保護作用，是治療心肌梗死的新方法。