張明敏 李耀富 季達(dá)峰 吳輝群 謝童瑤 韓夢嬌 呂廣明△

（1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，2 教務(wù)處，3 醫(yī)學(xué)院生物信息學(xué)系，南通 226001）

依靠計算機輔助的三維重建可視化技術(shù)，逐漸廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-2]。將體視學(xué)方法與三維重建可視化技術(shù)相結(jié)合，更好地對神經(jīng)科學(xué)研究的重要內(nèi)容之一就是多種神經(jīng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究[3]。將SD 大鼠腦干冰凍切片后進(jìn)行焦油紫染色，利用軟件重建出大鼠海馬結(jié)構(gòu)，并且可以計算重建海馬各區(qū)的體積[4]。通過運用無偏體視學(xué)方法和電子顯微鏡技術(shù)定量研究了年齡變化對大鼠皮質(zhì)、胼胝體中有髓鞘纖維的皮質(zhì)體積、總體積、總長度和平均直徑的影響[5-6]。師曉燕等[7]采用光學(xué)分合法建立了定量研究海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)神經(jīng)元和突觸數(shù)目的研究方法。壁虎（Gecko）隸屬爬行綱、晰蝎目、晰蝎亞目、壁虎下目、壁虎科、壁虎屬。常見的有多疣壁虎、無蹼壁虎、蹼趾壁虎與大壁虎。大壁虎的定位腦圖譜已經(jīng)構(gòu)建完成及其三維重建有了初步研究[8]。而多疣壁虎（Gekko japonicus）作為再生能力很強的脊椎動物，成為神經(jīng)生物學(xué)研究的模型動物[9-10]。沈宓等[11]將壁虎脊髓切片行尼氏染色，重建了壁虎脊髓頸膨大至頸3 節(jié)段。目前壁虎頭頸部的整體重建未見報道，本研究分別基于尼氏（Nissl's）染色和固藍(lán)（Luxol fast blue，LFB）染色法對壁虎頭頸部和軀干作整體三維立體結(jié)構(gòu)重建，并運用體視學(xué)方法對壁虎顱骨容積、全腦、端腦、大腦皮層、小腦、海馬體積和脊髓頸膨大、腰骶膨大及其灰質(zhì)和白質(zhì)的平均面積進(jìn)行定量測量，以期為壁虎腦和脊髓內(nèi)實驗和立體定向研究提供三維解剖學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

正常成年多疣壁虎20 只，雌雄不限（由南通大學(xué)動物實驗中心提供），體質(zhì)量（4.92±0.58）g，頭體長（吻端至泄殖腔的距離）為（6.57±0.10）cm。飼養(yǎng)在22℃～25℃、飽和濕度的空調(diào)房，自由取食黃粉蟲和水。

1.2 Nissl 染色和LFB 染色

將壁虎放冰袋上冰凍麻醉，然后取頭部和頸部，4%的甲醛溶液進(jìn)行固定，2 d 后對標(biāo)本進(jìn)行梯度脫水，標(biāo)本沉底后進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，片厚40μm。

將壁虎頭頸部切片進(jìn)行常規(guī)Nissl 染色，切片依次在下列制劑中浸沒5 min：二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，100%乙醇Ⅰ，100%乙醇Ⅱ，95%乙醇，70%乙醇，在蒸餾水中浸泡后置入1%焦油紫15 ～30 min，清水漂洗。常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片。

將壁虎頭軀干切片LFB 染色，先將切片放入無水乙醇：氯仿1∶1 混合溶液中8 h，然后轉(zhuǎn)入95%乙醇5 min，在0.1%LFB 液56 ℃過夜，再將標(biāo)本移入95%乙醇溶液5 min，轉(zhuǎn)入70%乙醇 3 min，此時標(biāo)本呈墨綠色，灰質(zhì)、白質(zhì)尚不能分清。蒸餾水清洗標(biāo)本3 min，置于0.05%碳酸鋰溶液中分化5 min，70%乙醇溶液分化30 s，蒸餾水洗片。鏡下觀察腦核團(tuán)、白質(zhì)邊界和脊髓灰質(zhì)與白質(zhì)邊界清晰后將標(biāo)本放入雙蒸水洗片。常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片。

1.3 圖像攝取和二維處理

將標(biāo)本依次置于Leica 光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，拍攝物鏡為2.5 倍，目鏡為10 倍。拍攝完圖像后利用Photoshop 7.0 對切片進(jìn)行拼接，將4 個不同區(qū)的視野拼接成1 張圖片，如圖1 所示。另選1 只壁虎作1 個正中縱切面，作為圖像配準(zhǔn)的參照，如圖2。軀干部位的配準(zhǔn)則以脊髓中央管中點為坐標(biāo)點，如圖3 所示。

1.4 三維重建

利用Photoshop 7.0 對所有圖片調(diào)整和定位好后，打開3D-Doctor 4.0，導(dǎo)入圖片，定義需要重建的結(jié)構(gòu)并設(shè)定其描記的顏色。如圖4 所示。對所有圖片進(jìn)行分割處理后，點擊“3D Rendering → Surface Rendering → Simple Surface”進(jìn)行表面三維重建，并對重建后的結(jié)果進(jìn)行觀察、切割和測量。

1.5 體視學(xué)測量

用體視學(xué)方法測量計算器官或組織體積的實現(xiàn)過程如圖5A 所示，先將所要測量的組織等距隨機切成若干片，間距為T，則第4 片組織片的體積≈組織片的，因此整個組織的體積為V=ΣAi*T。計算面積A 則用點計數(shù)法實現(xiàn)，如圖5B 所示。點計數(shù)法就是把事先制作的關(guān)聯(lián)測格疊加于切片圖像上，然后記錄落在切片圖像上的測點數(shù)。在關(guān)聯(lián)測格中，若d 為一方格的邊長時，被觀察物圖像內(nèi)的測點數(shù)為p，則觀察物測面的面積為：A=d2，如圖6 所示。

2 結(jié)果

2.1 三維重建

三維重建模型能夠自由旋轉(zhuǎn)、縮放，并從任意角度觀測顱骨與頭部、腦與顱骨，以及視神經(jīng)與腦的結(jié)構(gòu)關(guān)系，較好地反映眾多復(fù)雜結(jié)構(gòu)的外形和立體結(jié)構(gòu)（圖7）。通過重建模型可以看出壁虎的大腦表面光滑不存在溝回結(jié)構(gòu)，而且壁虎小腦比較小，從重建模型中可以看到小腦在延髓上部體積較小。從重建模型中可以看出壁虎從頸到泄殖腔間有29個椎骨，脊髓充滿整個椎管，也明顯出現(xiàn)頸膨大和腰骶膨大，而且腰骶膨大比頸膨大粗大。

2.2 體視學(xué)測量

本實驗運用體視學(xué)方法測量壁虎顱骨容積為（25.83±1.46）mm3，全腦體積為（19.99± 2.15）mm3，端腦體積為（7.53±0.33）mm3，一側(cè)大腦皮層體積為（0.19±0.02）mm3，小腦體積為（0.22±0.01）mm3，海馬體積（0.16±0.02）mm3，脊髓頸膨大的平均面積、灰質(zhì)面積和白質(zhì)面積分別為（0.70±0.02）mm2、（0.28±0.01）mm2、（0.36±0.01）mm2，頸膨大灰質(zhì)與白質(zhì)面積比是0.78，腰骶膨大的平均面積為（0.75±0.01）mm2，灰質(zhì)面積（0.36±0.01）mm2，白質(zhì)面積為（0.38±0.01）mm2，腰骶膨大灰質(zhì)與白質(zhì)面積比是0.95。

圖1 顯微鏡分區(qū)拍攝后，拼接4 個視野的圖像。A、C ：頭部和頸部4 個視野；B、D：拼接圖.Fig 1 Stitching the images of four fields after the sectorized shooting of the microscope.A，C： The four fields of view of the head and neck slices；B，D： Stitched pictures.

圖2 壁虎頭部的正中矢狀切面。A：端腦；B：間腦；C：中腦；D：小腦；E：延髓；F：嗅腦；G：視神經(jīng)；H：大腦皮層；I：冠狀縫.Fig 2 The median sagittal section of the head of Gecko.A：Telencephalon；B.Diencephalon；C.Mesencephalon；D.Cerebellum；E.Medulla oblongata；F.Rhinencephalon；G.Optic nerve；H.Cerebral cortex；I.Coronal suture.

圖3 X 軸和Y 軸的定位.Fig 3 Positioning of X-axis and Y-axis.

圖4 體表、顱骨、腦、視神經(jīng)、脊髓、灰質(zhì)和椎骨的分割。A：未分割的頭頸部切片圖像；B：3D-Doctor 分割體表、顱骨、腦和視神經(jīng)，其邊緣顏色分別顯示為綠色、灰色、紅色和橙色；C：未分割的軀體切片圖像；D：3D-Doctor 分割體表、脊髓、灰質(zhì)、椎骨，其邊緣顏色分別為綠色、紅色、黃色和粉色.Fig 4 Segmentation of body surface，skull，brain，optic nerve，spinal cord，gray matter and vertebrae.A：An undivided image of the head and neck slice；B：The 3D-Doctor partitions of the body surface，the skull，the brain and the optic nerve，and its boundary color was shown as green，gray，red and orange，respectively；C：An undivided slice image of the body；D：3D-Doctor partitions of the body surface，spinal cord，gray matter，and vertebrae，and its boundary color was shown as green，red，yellow，and pink.

圖5 組織等距切片和面積測量。A：組織等距切片；B：點計算法計算切片面積.Fig 5 Tissue isometric slice and area measurement.A：Tissue isometric slices；B：Slice area was calculated by point calculation method.

圖6 點計數(shù)測格測量切片面積。A：本實驗所用測點系統(tǒng)。B：測點系統(tǒng)測量顱腔、腦、新皮質(zhì)和端腦切片面積示意圖；①：端腦；②：大腦皮質(zhì)。C：測量海馬切片面積示意圖；③：海馬。D：測量脊髓和灰質(zhì)面積示意圖.Fig 6 Point counting grid to measure the slice area.A：The measurement point system in this experiment.B：The measurement of the area of cranial cavity，brain，neocortex；①：Telencephalon；②：Cerebral cortex.C：The measurement of the area of hippocampus；③：Hippocampus.D：The measurement of the area of spinal cord and gray matter.

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)中某些結(jié)構(gòu)的三維重建，為神經(jīng)示蹤實驗提供直觀、準(zhǔn)確的空間解剖定位，進(jìn)一步理解腦的特定部位的功能[12]。利用 3D-Doctor 軟件對大鼠腦干連續(xù)冰凍切片進(jìn)行三維重建，觀察一氧化氮合酶陽性神經(jīng)核團(tuán)在腦干中的三維分布[13]。臨床上將CT 掃描所得的DICOM 數(shù)據(jù)，運用3D-slicer 建立腦內(nèi)血腫及顱骨等結(jié)構(gòu)關(guān)系的三維模型，設(shè)計虛擬手術(shù)路（測定穿刺角度及深度），可顯著提高對血腫中心區(qū)穿刺置[14]。

本研究在三維重建過程中需要考慮到一個重要影響因素是連續(xù)圖片之間的配準(zhǔn)，配準(zhǔn)即確定圖像像素點在空間的位置，從而將二維圖像合成三維圖像，圖片間配準(zhǔn)是否準(zhǔn)確，一致直接影響重建的效果。目前解決的方法主要是利用外配準(zhǔn)和內(nèi)配準(zhǔn)的方法[15]，外配準(zhǔn)法一般是在制作切片前，用各種方法在組織塊上或附近作標(biāo)記來進(jìn)行定位，通常是利用細(xì)針、激光或微電極穿孔。內(nèi)配準(zhǔn)法是指根據(jù)生物組織的解剖學(xué)特點，在切片圖像中尋找特定的定位結(jié)構(gòu)來進(jìn)行定位。在本實驗用觀察縱切面并結(jié)合內(nèi)配準(zhǔn)法對圖像進(jìn)行配準(zhǔn)，取得較理想的結(jié)果。因此，本次實驗結(jié)果基本能呈現(xiàn)活體腦組織原有結(jié)構(gòu)和位置。由于本實驗是對顱骨、腦、視神經(jīng)、外耳道、軀體、椎骨、脊髓和灰質(zhì)進(jìn)行三維重建，這些結(jié)構(gòu)在切片上邊緣清晰連貫，所以在圖像分割上并不用費力，只要耐心將需要重建的結(jié)構(gòu)用不同顏色線條勾勒出來即可。

本研究用體視學(xué)的方法對壁虎的大腦皮層和海馬體積進(jìn)行測量，對于了解爬行動物行為、神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化，尤其大腦的進(jìn)化有著重要的意義[16]。本研究結(jié)果顯示，壁虎脊髓腰骶膨大比頸膨大的平均橫截面面積要大，另外腰骶膨大的灰、白質(zhì)面積比是0.95，而頸膨大的灰、白質(zhì)面積比是0.78，說明腰骶膨大的灰質(zhì)與白質(zhì)面積基本相等，而脊髓頸膨大中灰質(zhì)面積比白質(zhì)明顯小。

本實驗對多疣壁虎頭頸部連續(xù)Nissl 染色切片和頭軀干整體連續(xù)LFB 染色切片成功重建出壁虎的頭頸部、顱骨、全腦、視神經(jīng)、椎骨、脊髓的三維模型，同時反映出壁虎腦結(jié)構(gòu)和顱骨的空間位置關(guān)系，為壁虎腦內(nèi)實驗和立體定向提供了三維解剖學(xué)依據(jù)。