戴研平 高曉勤 秦海霞

（1 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004；2 遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563006；3 岳陽(yáng)市岳陽(yáng)樓區(qū)人民醫(yī)院，岳陽(yáng) 414000；4 烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校人體 解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，烏蘭察布 012000）

近年來(lái)關(guān)于砷毒性在雄性生殖方面的研究越來(lái)越多。砷能大量積累在睪丸，通過(guò)血睪屏障對(duì)男性生殖細(xì)胞產(chǎn)生損害[1-2]。水通道蛋白（aquaporin，AQP）廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞膜上，是選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異通道，在維持機(jī)體水分子平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[3]。AQP9 主要表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞、輸出小管的上皮及附睪頭部[4]，睪酮可以下調(diào)AQP9 的表達(dá)[5]。AQP9 被認(rèn)為在調(diào)節(jié)砷的入胞中扮演了重要角色[6-8]，過(guò)量的砷可損傷生精細(xì)胞和精子[9-10]。AQP9是砷進(jìn)入細(xì)胞的主要通道，這些通道蛋白的表達(dá)水平直接關(guān)聯(lián)著砷在細(xì)胞內(nèi)的蓄積和毒性。目前關(guān)于不同濃度砷對(duì)睪丸中水通道蛋白的影響少有報(bào)道，闡明砷對(duì)水通道蛋白的影響，對(duì)于砷的防治或臨床應(yīng)用具有重要意義。本研究通過(guò)建立亞慢性砷中毒大鼠模型，探討砷致生殖系統(tǒng)損害的機(jī)制和途徑，進(jìn)而尋找控制砷生殖毒性的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立

健康清潔級(jí)雄性SD 大 鼠40 只，體質(zhì)量160～200 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及本課題組的前期研究[11-12]，SD大鼠隨機(jī)分為低（0.4 mg·kg-1·d-1）、中（2.0 mg·kg-1·d-1）、高（10.0 mg·kg-1·d-1）劑量砷染毒組和對(duì)照（蒸餾水）組，每組10 只，采用經(jīng)口自由飲用方式進(jìn)行連續(xù)染毒14 周。

1.2 主要試劑

亞砷酸鈉（分析純，北京化工廠）；AQP9 兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 標(biāo)本采集

大鼠乙醚麻醉，立即暴露雙側(cè)睪丸沿橫軸剪為兩半，經(jīng)Bouin 液固定24 h 后，制作成4～7 μm的睪丸組織石蠟切片，右側(cè)用于免疫組織化學(xué)顯色，左側(cè)用于H-E 染色。

1.4 血漿及睪丸中砷濃度測(cè)定

砷濃度采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定（ICP 法），由貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分析測(cè)試中心完成檢測(cè)。

1.5 睪丸組織中AQP9 的表達(dá)檢測(cè)

右側(cè)睪丸切片脫蠟，下行至水；進(jìn)行抗原修復(fù)5 min×3 次；消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性（3 %過(guò)氧化氫5 min）；正常血清室溫濕盒內(nèi)孵育20 min，甩掉血清，不洗；滴加適當(dāng)稀釋的AQP9 抗體，4 ℃孵育過(guò)一夜；室溫復(fù)溫0.5 h；加羊抗兔IgG 抗體-HRP 多聚體二抗，室溫20 min。DAB 顯色，在顯微鏡下控制顯色程度；蘇木精復(fù)染20 s，酸乙醇分色，氨乙醇藍(lán)化，95 %乙醇脫水，切片放入 37 ℃烤箱30 min；二甲苯透明0.5 h，中性樹(shù)膠封片。

采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)大鼠睪丸陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行半定量分析，每組隨機(jī)選取3 張，40 倍目鏡下連續(xù)觀察5 個(gè)視野，計(jì)算平均灰度值。

1.6 ELISA 法測(cè)血清中睪酮的濃度

大鼠股動(dòng)脈采血，EP 管收集血液標(biāo)本，3000 r/min（半徑10 cm）離心8 min，取上清液后，保存于-20 ℃冰箱，備送貴州醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室用ELISA 法測(cè)血清睪酮的濃度。

1.7 HE 染色觀察睪丸組織一般形態(tài)

切片常規(guī)脫蠟至水；蘇木精室溫下染色約 15 min，酸乙醇脫色；氨乙醇藍(lán)化；室溫下染伊紅2～3 min；上行脫水、透明；中性樹(shù)膠封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血漿砷及睪丸砷濃度

隨著染毒組染砷劑量增加，血漿砷濃度逐漸升高，中、高劑量組與對(duì)照組之間的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。睪丸砷濃度逐漸升高，低、中和高劑量組與對(duì)照組之間的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠血漿砷及睪丸砷平均濃度（n=10，±s）Tab 1 Arsenic concentration in plasma and testis of rats in each group（n=10，±s）

表1 各組大鼠血漿砷及睪丸砷平均濃度（n=10，±s）Tab 1 Arsenic concentration in plasma and testis of rats in each group（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Plasma（mg/L）Testis（μg /g dry weight）Control group 0.0613±0.0186 1.3470±0.1682 Low-dose group 0.0740±0.0212 1.5080±0.1234*Middle-dose group 0.1080±0.0323* 1.5810±0.1426*High-dose group 0.1640±0.0375* 1.7200±0.1627*

2.2 大鼠睪丸組織中AQP9 表達(dá)

光鏡下，各組大鼠均可見(jiàn)到AQP9 免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，呈棕黃色或棕褐色。中、高劑量染砷組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低、中、高染砷組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9 陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2，圖1）。

表2 各組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 和平均灰度值（n=10，±s）Tab 2 AQP9 positive cell counts and mean grey value of Leydig cells in each group（n=10，±s）

表2 各組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 和平均灰度值（n=10，±s）Tab 2 AQP9 positive cell counts and mean grey value of Leydig cells in each group（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Number of positive cells（number/field）Average grey value Control group 4.40±1.65 119.80±6.46 Low-dose group 5.70±1.16 122.40±5.17*Middle-dose group 8.90±1.52* 127.80±4.66*High-dose group 9.60±1.17* 135.40±6.05*

2.3 睪丸組織光鏡觀察

光鏡下，對(duì)照組睪丸組織生精小管排列緊密，睪丸間質(zhì)無(wú)滲出。低劑量組生精小管排列基本規(guī)則，睪丸間質(zhì)改變不明顯。中劑量組生精小管之間的間隙增大，排列不緊密，間質(zhì)可見(jiàn)出血和滲出的細(xì)胞。高劑量組示生精上皮細(xì)胞和睪丸間質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整，間質(zhì)內(nèi)大片彌漫的出血滲出物（圖2）。

2.4 大鼠血清中睪酮的濃度檢測(cè)

隨著染毒組染砷劑量增加，血清睪酮濃度（pg/ml）逐漸降低，中、高劑量組血清睪酮濃度依次 為2.145 2±0.531 2、1.800 0±0.527 5，與對(duì)照組的濃度（3.082 3±0.653 0）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組的濃度（2.806 9±0.415 5）與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9 蛋白的表達(dá)，DAB，×400。A：對(duì)照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組.Fig 1 Expression of AQP9 protein in testicular Leydig cells detected by immunohistochemistry，×400.A：Control group；B：Low-dose group；C：Middle-dose group；D：High-dose group

圖2 H-E 染色觀察大鼠睪丸組織病理學(xué)變化，×100。A：對(duì)照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組.Fig 2 Histopathological changes of testicular tissues of rats by H-E staining，×100.A：Control group；B：Low-dose group；C：Middle-dose group；D：High-dose group

3 討論

砷進(jìn)入細(xì)胞是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵步驟，闡明砷對(duì)水通道蛋白的影響對(duì)于慢性砷中毒的防治或臨床應(yīng)用具有重要意義[13]。自然界中的砷以3 價(jià)的無(wú)機(jī)砷毒性最高。而在哺乳動(dòng)物中，AQP9 被認(rèn)為在調(diào)節(jié)砷的入胞中扮演了重要角色[14-16]。研究表明AQP9 能促進(jìn)As（Ⅲ）的攝取[17]。本研究結(jié)果顯示，AQP9 蛋白主要表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，隨著染砷劑量的增加，AQP9 蛋白的表達(dá)升高。

睪酮主要是由睪丸內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌。睪酮分泌后一部分進(jìn)入血液，作用于遠(yuǎn)方的靶組織，參與對(duì)行為的調(diào)節(jié)和雄性第二性征的維持；另一部分局部作用于生精上皮，參與對(duì)精子發(fā)生的調(diào)節(jié)。Miura 等[18]研究表明砷能破壞生殖細(xì)胞，對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞有直接毒性，能降低睪酮的水平。本研究結(jié)果顯示，隨著砷濃度的增加，血清睪酮濃度下降。大多研究者認(rèn)為高砷引起血清睪酮下降的原因是高砷破壞了睪丸組織結(jié)構(gòu)，影響間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的功能。

評(píng)價(jià)某化學(xué)物質(zhì)是否對(duì)精子的發(fā)生產(chǎn)生有害作用主要參考睪丸形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)和精子發(fā)生的功能評(píng)價(jià)[19]。本研究H-E染色結(jié)果顯示，正常睪丸組織生精上皮內(nèi)生精細(xì)胞排列緊密，間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，而中、高劑量組部分生精細(xì)胞和間質(zhì)出現(xiàn)了損害，生精小管之間的間隙增大，間質(zhì)內(nèi)有出血滲出。說(shuō)明砷化物可直接損害睪丸間質(zhì)的毛細(xì)血管或作用于血管舒縮中樞，使血管平滑肌麻痹，毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管通透性改變[21]。一方面可導(dǎo)致睪丸間質(zhì)有充血，滲出。另一方面，毛細(xì)血管受損，則砷可能通過(guò)血睪屏障直接作用于支持細(xì)胞，使精子生成受阻。本研究結(jié)果顯示，隨著染砷劑量的升高，睪丸和血漿砷濃度升高，睪丸間質(zhì)細(xì)胞損害逐漸加重，睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9 的表達(dá)逐漸升高，血清睪酮逐漸下降。原因可能為砷通過(guò)影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞AQP9 的表達(dá)，改變了間質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，使睪酮分泌減少，精子發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致雄性生育能力下降。

綜上所述，雄性大鼠通過(guò)亞慢性的砷暴露可致血漿及睪丸砷含量增加，對(duì)AQP9的蛋白和睪酮的分泌產(chǎn)生影響，引起明顯的睪丸組織病理性損傷，進(jìn)而影響精子發(fā)生，可能是其導(dǎo)致男性不育的病因之一。