劉麟文 周雅春 姚俊巖

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院麻醉科，上海 200080）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血再灌注損傷，包括缺血性腦梗塞和脊髓缺血再灌注損傷，其后果嚴(yán)重，不僅導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能缺失如偏癱、截癱，甚至引起死亡[1-4]。近年的流行病學(xué)研究結(jié)果表明，全球缺血性腦血管疾病的發(fā)病率和病死率逐年上升，且呈現(xiàn)出年輕化發(fā)展的趨勢(shì)[5，6]，如何減輕神經(jīng)缺血再灌注損傷日益受到重視。眾多學(xué)者力求采取低溫、缺血預(yù)處理后處理等措施保護(hù)缺血的神經(jīng)系統(tǒng)，但效果有限[7-10]。藥物保護(hù)措施因具備可行性高、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景，但目前尚缺乏公認(rèn)有效的神經(jīng)保護(hù)藥物。[D-Ala2，D-Leu5]enkephalin（DADLE）是一種人工合成的 δ 阿片受體（δ opioid receptor，DOR）激動(dòng)劑，DADLE 可誘發(fā)冬眠，保護(hù)外周器官，促進(jìn)細(xì)胞生存，這種保護(hù)作用在心、肝和腎等器官均有所體現(xiàn)[11-12]。但δ 阿片受體激動(dòng)劑能否減輕神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷，目前研究尚少。且臨床上應(yīng)用大劑量阿片受體激動(dòng)劑將帶來呼吸抑制等嚴(yán)重副作用，因此如何更好地利用其保護(hù)作用，減少或避免副作用值得深入探討。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞是神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域普遍采用的工具細(xì)胞，本研究采用體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的缺氧，復(fù)制神經(jīng)細(xì)胞不同程度的缺氧復(fù)氧損傷，繼而在缺氧過程中給予不同濃度的DADLE，探討其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有無(wú)保護(hù)作用，且該作用是否具有劑量效應(yīng)關(guān)系，確定其最佳保護(hù)劑量。

1 材料和方法

1.1 試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞來源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；高糖DMEM 培養(yǎng)基、無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)MTT（3-[4，5-dimethyl-2-thiazolyl]-2，5-diphenyl-2Htetrazolium bromide）和DMSO 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素加鏈霉素）的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、鋪板等操作，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將上述細(xì)胞隨機(jī)分為以下5 組：缺氧0 h 組，即無(wú)缺氧對(duì)照組；缺氧6 h 組；缺氧12 h 組；缺氧24 h 組；缺氧48 h 組。將4 組中的正常細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基，并置于37℃自制恒溫缺氧罐中，使缺氧罐中逐漸充滿5%CO2和95%N2混合氣，直至達(dá)到無(wú)氧狀態(tài)。將上述細(xì)胞按照分組條件，置于無(wú)氧罐中分別行缺氧6、12、24 h 和48 h 后取出，更換高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧4 h。缺氧0 h 組組細(xì)胞則于其余各組細(xì)胞缺氧開始及結(jié)束兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，相應(yīng)更換2 次正常培養(yǎng)基，并全程置于正常CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中使細(xì)胞正常生長(zhǎng)，未行缺氧和復(fù)氧操作。分別于缺氧即刻及復(fù)氧后，將各組細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，了解并記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生存率

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將上述96 孔板中每孔接種 5 000 個(gè)細(xì)胞，每孔100 μL 細(xì)胞懸液。待缺氧6、12、24 h 和48 h 各組細(xì)胞分別缺氧6、12、24 h或48 h 后，吸去無(wú)糖培養(yǎng)基，加入無(wú)酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基100 μL，同時(shí)進(jìn)行復(fù)氧，此時(shí)每孔細(xì)胞加入MTT 溶液20 μL，小心操作避免污染，繼續(xù)避光孵育4 h 后終止復(fù)氧。缺氧0h組細(xì)胞僅更換2 次正常培養(yǎng)基。各組細(xì)胞均予400 g×3 min 離心后吸取上清液，每孔再加入150 μL DMSO 溶液，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，繼而在酶標(biāo)儀上選擇490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各組細(xì)胞光吸收值，以缺氧時(shí)間為橫坐標(biāo)，生存率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。生存率計(jì)算公式為細(xì)胞生存率% =（缺氧組細(xì)胞吸光度值-調(diào)零孔吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-調(diào)零組吸光度值）×100%。

1.4 評(píng)估缺氧和復(fù)氧4 h 對(duì)細(xì)胞的損傷程度。

首先將SH-SY5Y 單細(xì)胞懸液稀釋為5×104/mL，于96 孔板中種板，使得每孔含100 μL 細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為缺氧對(duì)照組、PBS 對(duì)照組和DADLE藥物處理組3 組。將上述3 組細(xì)胞分別加入等量無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃恒溫的5% CO2和95% N2缺氧罐中同步缺氧12 h。缺氧期間，缺氧對(duì)照組僅給予單純?nèi)毖跆幚聿唤o予任何藥物；而DADLE藥物處理組細(xì)胞每孔加入1 μL 濃度為100 pmol/L的DADLE 藥物進(jìn)行孵育；PBS 對(duì)照組細(xì)胞每孔按照等容原則給予PBS 1 μL。缺氧12 h 結(jié)束后，從缺氧罐中取出3 組細(xì)胞，吸去無(wú)糖培養(yǎng)基，更換為高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧，同時(shí)給予MTT 孵育4 h，復(fù)氧結(jié)束后采用MTT 法測(cè)定細(xì)胞生存率。

另選SH-SY5Y細(xì)胞研究其保護(hù)作用有無(wú)量效關(guān)系。即將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為6 組：D0 組：?jiǎn)渭內(nèi)毖踅M；D1 組：DADLE 10 pmol/L 組；D2組：DADLE 100 pmol/L 組；D3 組：DADLE 1 nmol/L 組；D4 組：DADLE 10 nmol/L 組；D5 組：DADLE 100 nmol/L 組。將上述6 組細(xì)胞同步缺氧12 h，缺氧期間，D0 組細(xì)胞僅給予單純?nèi)毖跆幚?，不加入任何藥物孵育；而D1、D2、D3、D4 和D5組則加入等容量（每孔1 μL）分別含有10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 或100 nmol/L的DADLE 溶液進(jìn)行處理。缺氧12 h 結(jié)束后，各組細(xì)胞同時(shí)復(fù)氧，并給予MTT 試劑孵育4 h 后檢測(cè)細(xì)胞生存率。

采用SPSS 24 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，各組間整體比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)

結(jié)果顯示（圖1），可見正常SH-SY5Y細(xì)胞呈棒狀、桿狀或梭狀，有較短的或者中等長(zhǎng)度的放射狀神經(jīng)突起，細(xì)胞核粗大。

圖1 正常SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)，×200Fig 1 Normal SH-SY5Y cell morphology，×200

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞缺氧不同時(shí)間的顯微鏡下形態(tài)變化

光鏡下（圖2）可見：缺氧6 h后，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞間連接不再緊密。絕大部分細(xì)胞離開底壁，折光度變差。而復(fù)氧4 h后，部分細(xì)胞重新貼壁，但細(xì)胞狀態(tài)仍無(wú)法恢復(fù)正常。缺氧12 h后，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞失去正常形態(tài)，變圓、腫脹，聚集成團(tuán)，全部細(xì)胞均脫離底壁，而復(fù)氧4 h后，細(xì)胞仍不能貼壁，仍保持懸浮于培養(yǎng)液中。

2.3 SH-SY5Y細(xì)胞缺氧不同時(shí)間和復(fù)氧4 h 的生存率

無(wú)缺氧對(duì)照組的細(xì)胞生存率為100%。缺氧6 h 后復(fù)氧4 h 組細(xì)胞生存率為（68.1±4.3）%；缺氧12 h 后復(fù)氧4 h 組細(xì)胞生存率為（52.6±2.8）%；缺 氧24 h 后復(fù)氧4 h 組細(xì)胞生存率為（26.7± 1.5）%；而缺氧48 h 后復(fù)氧4 h 組細(xì)胞生存率為（3.5±1.7）%。缺氧6、12、24 h 和48 h 組與無(wú)缺氧對(duì)照組比較，細(xì)胞生存率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生存率逐漸降低（P＜0.05）。說明SH-SY5Y細(xì)胞體外缺氧6、12、24 h 或48 h，復(fù)氧4 h 后可導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞損傷。

圖2 缺氧及復(fù)氧后的細(xì)胞形態(tài)，×200Fig 2 Cell morphology of SH-SY5Y after hypoxia and reoxygenation，×200

2.4 給藥DADLE 100 pmol/l 后細(xì)胞生存率變化

與單純?nèi)毖踅M比較，SH-SY5Y細(xì)胞缺氧12 h 期間給予DADLE100 pmol/L 處理可使細(xì)胞生存率上升到（58.7±0.5）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而溶媒PBS 對(duì)照組細(xì)胞生存率無(wú)明顯增高（P＞0.05），說明用于溶解DADLE 的溶媒無(wú)作用，該保護(hù)作用是由DADLE 藥物本身產(chǎn)生。DADLE 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧12 h 復(fù)氧4 h生存率的影響如圖3 所示。

圖3 DADLE 100 pmol/L 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧復(fù)氧后 生存率的影響與缺氧對(duì)照組比較Fig 3 The effect of DADLE 100 pmol/L on the survival rate of SH-SY5Y cells after hypoxia-reoxygenation

2.5 不同濃度DADLE 對(duì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響結(jié)果

結(jié)果顯示DADLE 10 pmol/L和100 pmol/L 2 個(gè)藥物劑量使神經(jīng)細(xì)胞生存率分別上升為（61.2±2.4）%和（58.7±0.5）%，與單純?nèi)毖鯇?duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而 DADLE 1、10 nmol/L 和100 nmol/L 3 個(gè)劑量組的細(xì)胞生存率與單純?nèi)毖踅M比較，未見明顯上升（P＞0.05）。DADLE 對(duì)SH-SY5Y 缺氧復(fù)氧保護(hù)作用的量效關(guān)系如圖4 所示?？梢奃ADLE 藥物的保護(hù)作用與DADLE 劑量密切相關(guān)，并呈現(xiàn)出小劑量的效果優(yōu)于大劑量的效果。隨著劑量的增加，其保護(hù)作用反而減弱。

3 討論

建立穩(wěn)定性高、可重復(fù)性強(qiáng)的神經(jīng)損傷模型是研究藥物神經(jīng)保護(hù)效果的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)所采用的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)室中常用的研究神經(jīng)功能的工具細(xì)胞，可較好反映神經(jīng)細(xì)胞的一般特征。建立缺血再灌注損傷的缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型有多種方法，目前應(yīng)用廣泛的方法是物理缺氧復(fù)氧法和化學(xué)缺氧復(fù)氧法。本研究使用的混合氣體培養(yǎng)法是目前建立體外細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型最常用的方法[13]，其具體方案是將95%N2和5%CO2組成的混合氣體通入一個(gè)自制密閉盒子，制造無(wú)氧環(huán)境，將細(xì)胞在無(wú)氧環(huán)境培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后再置于正常環(huán)境中培養(yǎng)，造成缺氧復(fù)氧損傷，從而模擬在體模型中的缺血再灌注損傷。

圖4 DADLE 對(duì)SH-SY5Y 缺氧復(fù)氧保護(hù)作用的量效關(guān)系Fig 4 The dose-effect relationship of DADLE on SH-SY5Y hypoxia-reoxygenation

本研究成功采用混合氣體培養(yǎng)法建立了SHSY5Y細(xì)胞體外缺氧復(fù)氧損傷模型。研究結(jié)果表明，缺氧12 h 后，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為細(xì)胞失去正常形態(tài)，變圓、腫脹，聚集成團(tuán)，全部細(xì)胞均脫離底壁，證明缺氧12 h 已經(jīng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)產(chǎn)生一定損害；而再?gòu)?fù)氧4 h 后，細(xì)胞仍不能貼壁，保持懸浮于培養(yǎng)液中，進(jìn)一步說明缺氧12 h后復(fù)氧4 h 對(duì)細(xì)胞造成了明確損傷。同時(shí)MTT 檢測(cè)結(jié)果提示，缺氧12 h 后復(fù)氧4 h 可使細(xì)胞生存率降低至（52.6±2.8）%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞生存率在30%～60%范圍內(nèi)，更有利于神經(jīng)保護(hù)藥物是否有效的評(píng)估[14]。而在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，因SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)快、倍增時(shí)間短，缺氧后如復(fù)氧時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞可能恢復(fù)生長(zhǎng)，將影響最終生存率的正確判斷。因此，本研究確定缺氧12 h 后復(fù)氧4 h 可使細(xì)胞生存率維持在50%左右，可滿足藥物作用效果的實(shí)驗(yàn)要求，可作為建立穩(wěn)定的體外SHSY5Y細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的條件。

阿片系統(tǒng)主要由多種阿片肽及其相應(yīng)受體組成，其中阿片受體主要包括κ 阿片受體（KOR），μ 阿片受體（MOR）和δ 阿片受體（DOR），其中DOR 廣泛分布于心、肝、肺、腎等組織器官中，在神經(jīng)系統(tǒng)中的腦和脊髓均有一定分布[15-16]。在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型中的研究發(fā)現(xiàn)，DOR 的激活可對(duì)缺血后的腦細(xì)胞產(chǎn)生一定的神經(jīng)保護(hù)作用[17-18]。DADLE 是一種人工合成的δ 阿片受體激動(dòng)劑，近年來，因其能誘導(dǎo)冬眠，延長(zhǎng)外周和中樞組織細(xì)胞存活時(shí)間而受到關(guān)注[15]。據(jù)報(bào)道，DADLE可通過MEK-ERK 途徑促進(jìn)細(xì)胞存活。同時(shí)DADLE 還可促進(jìn)大鼠空間認(rèn)知功能的恢復(fù)，并調(diào)節(jié)缺血后的神經(jīng)發(fā)生[19]。本研究首先選擇DADLE 100 pmol/L 探討DADLE 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷有無(wú)保護(hù)作用，結(jié)果與單純?nèi)毖踅M比較，缺氧期間給予DADLE 100 pmmol/L 處理可使細(xì)胞生存率上升到（58.7±0.5）%；而其溶媒對(duì)照PBS 并無(wú)保護(hù)作用。上述結(jié)果提示DADLE 可減輕神經(jīng)細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致。

有研究表明，DADLE能降低大鼠海馬神經(jīng)元的死亡，改善其學(xué)習(xí)記憶能力和運(yùn)動(dòng)功能，作用與劑量有相關(guān)性[20]。因此，本研究在確認(rèn)DADLE 100 pmol/L有明確保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了缺氧期間給予其他不同劑量DADLE，使細(xì)胞孵育液的DADLE濃度變?yōu)楦〉?0 pmol/L和更大的1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)10 pmol/L和100 pmol/L 2個(gè)劑量對(duì)細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，而1、10 nmol/L和 100 nmol/L對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用反而減弱甚至消失，該結(jié)果說明DADLE的神經(jīng)保護(hù)作用存在劑量依賴效應(yīng)，呈現(xiàn)出較小劑量的保護(hù)作用優(yōu)于較大劑量。推測(cè)DADLE的該種量效關(guān)系可能與DADLE在較大劑量和較小劑量時(shí)激活的機(jī)制不同有關(guān)，如分別激活依賴于阿片受體或不依賴于阿片受體兩種完全不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而產(chǎn)生不同的作用。其次，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著藥物劑量增大，DADLE的神經(jīng)保護(hù)作用反而消失，這也可能是由于較大劑量的DADLE產(chǎn)生了毒副作用，反而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷所致。關(guān)于DADLE 減輕SH-SY5Y細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的具體作用機(jī)制尚有待下一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上，本研究表明SH-SY5Y細(xì)胞體外缺氧6、12、24 h 或48 h，復(fù)氧4 h 后可導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)細(xì)胞損傷，而缺氧期間給予DADLE 可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生明確的保護(hù)作用，且該保護(hù)作用與DADLE 劑量存在效應(yīng)關(guān)系，呈現(xiàn)出10 pmol/L 和100 pmol/L 兩個(gè)較小劑量的保護(hù)效果優(yōu)于1、10 nmol/L 和 100 nmol/L 3 個(gè)較大劑量。本研究為采用阿片受體激動(dòng)劑作為神經(jīng)缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。