閔 瓊，曾海榮，陸翠燕，張夏炎*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200062；3.上海市普陀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，上海 200062)

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在2018年全球惡性腫瘤中分別占5.7%和8.2%，分別位于第5位和第3位[1]。我國(guó)是胃癌高發(fā)病國(guó)家，胃癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)約占全球一半，胃癌也是重點(diǎn)防治的癌種之一[2]。胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，而大多數(shù)胃癌在確診時(shí)已發(fā)展至中晚期，發(fā)生轉(zhuǎn)移，這也成為胃癌防治的瓶頸問(wèn)題[3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial mesenchymal transition,EMT)在腫瘤的進(jìn)展，尤其是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[4]。在胃癌的發(fā)展進(jìn)程中，胃癌細(xì)胞逐漸失去其上皮特性，獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性，即發(fā)生EMT，從而使胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。目前，胃癌的防治主要以手術(shù)和化療為主，雖然近年來(lái)靶向治療和免疫治療也越來(lái)越受到重視，但由于價(jià)格昂貴，在臨床的使用受到限制[5]。因此，尋找高效、低毒、價(jià)格實(shí)惠的胃癌化療新藥物具有重要意義。廣藿香醇是從唇形科刺蕊草屬植物廣藿香[Pogostemoncablin(Blance) Benth.]中提取的揮發(fā)油，具有保護(hù)胃腸道、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)吐止咳、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香醇對(duì)以應(yīng)激性腹瀉為主要癥狀的腸易激綜合征有抑制作用[6]，體外對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞具有抗腫瘤活性[7]。因此，本研究觀察了不同濃度廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、侵襲和遷移的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速低溫離心機(jī)和多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)FACS Calibur,Becton Dickinson公司)。

1.2 試藥和細(xì)胞 廣藿香醇(純度>98%，批號(hào)MUST-17073111，成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；Immobilon ECL發(fā)光液、Pierce BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)；一抗E-cadherin、N-cadherin、β-Catenin、Vimentin、β-Actin(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；Transwell 小室(美國(guó)Corning公司)。人胃癌細(xì)胞株HGC-27(批號(hào) 153255，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株HGC-27用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%即可，用 0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞平均2～3 d 傳代一次。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液以100 μl/孔接種于96孔板上，每組 3個(gè)復(fù)孔，外圍一圈邊緣孔用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基換成含不同濃度廣藿香醇(0、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)基。分別于加藥24和48 h后加入MTT溶液(終濃度為5 mg/mL)，4 h后棄去上清液，加入150 μl的DMSO，振蕩10 min溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算抑制率和IC50值。抑制率=[1-(藥物干預(yù)組吸光度/對(duì)照組吸光度)]×100%。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/ml，將2 ml細(xì)胞懸液接種于6孔板，待細(xì)胞鋪滿孔底，用黃槍頭在6孔板里豎著劃痕，然后用無(wú)菌PBS清洗2遍，除去細(xì)胞碎片。分別加入廣藿香醇 (20、40 μmol/L)，于0、24、48 h在顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞愈合情況。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力 細(xì)胞經(jīng)不同濃度廣藿香醇作用24 h后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸成單個(gè)細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于Transwell上室，下室加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，上室細(xì)胞用棉簽輕輕擦去，下室放入4%多聚甲醛溶液中固定15 min，再用1%結(jié)晶紫染色10 min。取出小室，在清水中蕩洗，空氣中晾干。用顯微鏡拍照觀察，并用Image J進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)需要先對(duì)小室用Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行包被，將Matrigel基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱取出，放4 ℃冰箱過(guò)夜融化，然后將Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶6進(jìn)行稀釋，吸取100 μl加入小室上層，于37 ℃放置2～3 h。待Matrigel基質(zhì)膠凝固后，棄去殘余液體，其他操作步驟與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力操作步驟相同。

1.7 用Western印跡法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá) 收集經(jīng)廣藿香醇 (20、40 μmol/L)處理 48 h的細(xì)胞，在冰上用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，在4 ℃以相對(duì)離心力8 000×g離心 10 min，收取上清液。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，100 ℃ 金屬浴10 min使蛋白變性。冷卻后經(jīng)SDS-PA凝膠電泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，將膜用洗膜液清洗，然后用5%脫脂奶粉封閉，室溫下放置1 h。一抗 4 ℃孵育，過(guò)夜，用洗膜液洗3次，每次10 min。二抗室溫下孵育1 h，用洗膜液充分洗滌后，ECL顯影液進(jìn)行顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用灰度分析軟件對(duì)各條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27增殖的影響 不同濃度廣藿香醇作用24和48 h對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27的生長(zhǎng)抑制率見(jiàn)圖1。廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27具有增殖抑制作用， 且呈現(xiàn)一定的時(shí)間和濃度依賴性。不同濃度的廣藿香醇 (0、1、5、10、20、50、100 μmol/L)作用于細(xì)胞24和48 h后，隨著藥物濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制率也增強(qiáng)。廣藿香醇作用24 和48 h的IC50分別為38.9和18.9 μmol/L。根據(jù)MTT法測(cè)定結(jié)果，選擇廣藿香醇濃度為20和40 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度廣藿香醇作用24和48 h對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27的生長(zhǎng)抑制率Figure 1 Inhibitory rates of different concentrations of patchouli alcohol on the growth of human gastric cancer cells HGC-27 at 24 and 48 h○：作用24 h；●：作用

2.2 廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)考察不同濃度的廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27遷移的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2，20和40 μmol/L的廣藿香醇作用于胃癌細(xì)胞HGC-27 24和48 h后能夠顯著抑制細(xì)胞遷移，減少劃痕的愈合面積。Transwell遷移結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可見(jiàn)，與空白組比較，廣藿香醇(20和40 μmol/L)作用48 h后，細(xì)胞的遷移數(shù)量顯著減少(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，廣藿香醇能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞HGC-27的遷移。

2.3 廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 廣藿香醇能夠明顯降低胃癌細(xì)胞HGC-27的侵襲能力， 抑制胃癌細(xì)胞HGC-27的轉(zhuǎn)移。 與對(duì)照組比較， 20和40 μmol/L的廣藿香醇作用于細(xì)胞48 h后， 細(xì)胞的侵襲數(shù)量顯著減少(P<0.05)。 見(jiàn)圖4。

2.4 廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western印跡法結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5可見(jiàn)，廣藿香醇(20和40 μmol/L)分別作用于人胃癌細(xì)胞HGC-27 48 h后，上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著升高，與對(duì)照組相比，分別升高至1.33倍和1.48倍，具有顯著性差異(P<0.05)；上皮間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、β-Catenin、Vimentin的蛋白表達(dá)均下降，其中N-cadherin分別下降至原水平的0.75%和0.53%，β-Catenin分別下降至原水平的0.58%和0.32%，Vimentin分別下降至原水平的0.69%和0.47%，具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)中不同濃度的廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27遷移的影響Figure 2 The effects of different concentrations of patchouli alcohol on the migration of human gastric cancer cell HGC-27 by scratch testA：對(duì)照組(作用0 h)；B：對(duì)照組(作用24 h)；C：對(duì)照組(作用48 h)；D：20 μmol/L廣藿香醇組(作用0 h)；E：20 μmol/L廣藿香醇組(作用24 h)；F：20 μmol/L廣藿香醇組(作用48 h)；G：40 μmol/L廣藿香醇組(作用0 h)；H：40 μmol/L廣藿香醇組(作用24 h)；I：40 μmol/L廣藿香醇組(作用48 h)

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)中不同濃度的廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27遷移能力的影響Figure 3 The effects of different concentrations of patchouli alcohol on the migration of human gastric cancer cell HGC-27 by Transwell testA：對(duì)照組；B：20 μmol/L廣藿香醇組；C：40 μmol/L廣藿香醇組；D：遷移細(xì)胞數(shù)量；*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)中不同濃度的廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27侵襲能力的影響Figure 4 The effects of different concentrations of patchouli alcohol on the invasion of human gastric cancer cell HGC-27 by Transwell testA：對(duì)照組；B：20 μmol/L廣藿香醇組；C：40 μmol/L廣藿香醇組；D：侵襲細(xì)胞數(shù)量；**P<0.01，與對(duì)照組比較

圖5 不同濃度廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of different concentrations of patchoulil alcohol on expression of EMT-related proteins in human gastric cancer cell HGC-27

3 討 論

廣藿香醇是從廣藿香植物中分離得到的一種三環(huán)倍半萜類化合物，生理活性較強(qiáng)，能夠調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，保護(hù)腸黏膜屏障，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用，對(duì)消化道疾病具有很好的療效，以廣藿香為原料的藥品在臨床上廣泛使用。研究顯示，廣藿香醇能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW480[7]及前列腺癌細(xì)胞DU145[8]的生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤作用，但其確切的作用機(jī)制尚不明確。本研究考察了廣藿香醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，MTT檢測(cè)結(jié)果表明，廣藿香醇能抑制HGC-27細(xì)胞增殖；劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，廣藿香醇能抑制HGC-27細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，提示廣藿香醇對(duì)胃癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有潛在療效。

EMT是腫瘤研究的熱點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞從病灶部位脫落是發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的第一步，脫落的細(xì)胞穿過(guò)血管，隨血液運(yùn)行，轉(zhuǎn)移到其他部位；穿透血管是其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的第二步，而穿過(guò)血管的能力依賴于細(xì)胞發(fā)生EMT[9]。EMT是以上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)減少而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin等表達(dá)增多為特點(diǎn)的過(guò)程，期間細(xì)胞發(fā)生形態(tài)、黏附力及活力改變，有助于細(xì)胞脫落，穿透血管，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。

有研究報(bào)道，廣藿香醇可能通過(guò)抑制M2型丙酮酸激酶(PKM2)磷酸化和核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)而誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞MV4-11凋亡[11]。與其機(jī)制不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香醇在抑制HGC-27細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的同時(shí)，可降低E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)升高N-cadherin、β-Catenin和Vimentin的表達(dá)，提示廣藿香醇能夠抑制HGC-27細(xì)胞發(fā)生EMT，從而抑制HGC-27細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞中調(diào)控EMT的信號(hào)通路有多種，包括Hedgehog信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Wnt3a/β-Catenin信號(hào)通路、Ras/EMK信號(hào)通路以及 PI3K/AKT信號(hào)通路等。激活A(yù)KT可以使細(xì)胞間黏附力降低、極性降低、運(yùn)動(dòng)能力增加，使上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和分布發(fā)生變化[12]。茆文莉等[13]研究認(rèn)為，薯蕷皂苷可能通過(guò)調(diào)控 PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制PI3K、AKT的表達(dá)及其磷酸化，從而抑制人肺腺癌細(xì)胞 H1299的EMT。本研究中，廣藿香醇通過(guò)調(diào)控EMT而抑制胃癌細(xì)胞HGC-27發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，但是具體的作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。