陳敏燕，楊 剛，吳飛華，原永芳

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011)

絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino]為我國(guó)常用的藥食同源品，可以起到保護(hù)心腦血管、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用，因其獨(dú)特的功效，在醫(yī)藥、食品、保健品中被廣泛應(yīng)用。絞股藍(lán)的主要活性成分是絞股藍(lán)皂苷[1]，與其他皂苷類成分一樣，絞股藍(lán)皂苷性質(zhì)不穩(wěn)定，在腸內(nèi)菌作用下被代謝成多種代謝產(chǎn)物，在胃液中也容易被降解[2]；另外，較差的水溶性和脂溶性也影響其生物利用度[3]。目前，市售制劑主要有絞股藍(lán)含片、絞股藍(lán)總苷膠囊、絞股藍(lán)口服液以及復(fù)方絞股藍(lán)等。為改善其生物利用度，國(guó)內(nèi)外研究人員還將其制備成微囊、脂質(zhì)體等制劑[4-5]。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers，NLCs)是繼固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLNs)之后的二代脂質(zhì)體系，與SLNs不同之處在于，它是采用混合類脂為載體材料，將液態(tài)脂質(zhì)混合到固體脂質(zhì)中制備而得，載體中具有較高的晶體缺陷，可以容納更多的藥物分子，使其具有更高的載藥能力[6]。同時(shí)，NLCs還保留了SLNs緩釋、生物相容性好、易制備的優(yōu)點(diǎn)，且增強(qiáng)了穩(wěn)定性[7]。與微囊和脂質(zhì)體等劑型相比，NLCs具有載藥量高、生物穩(wěn)定性好、緩釋效果顯著等優(yōu)勢(shì)。高壓均質(zhì)法是目前報(bào)道的制備NLCs的主要方法，該方法操作簡(jiǎn)便，易于控制，且可避免使用對(duì)人體有害的附加有機(jī)溶劑[8]。本文采用高壓均質(zhì)法制備載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(GPS-NLCs)，并對(duì)其體外釋放行為進(jìn)行了考察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

1.1 儀器 高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司)；RC-806溶出度儀(天津因賽科技發(fā)展有限公司)；NS1001L高壓均質(zhì)機(jī) (意大利GEA Niro Soavi公司)；Nano ZS 90激光粒度儀(英國(guó)Malvern公司)；D8 Advance X射線衍射儀(德國(guó)布魯克公司)；Q2000差示掃描量熱儀(美國(guó)TA公司)；T25高度分散儀(德國(guó)IKA公司)；超濾離心管(美國(guó)Pall公司)。

1.2 藥品和試劑 絞股藍(lán)皂苷對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)112033-201701，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；絞股藍(lán)皂苷原料藥(純度≥95%，批號(hào) S31402-5g，上海源葉生物科技有限公司)；單硬脂酸甘油酯 (國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；單亞油酸甘油酯(Maisine 35-1)和油?；垡叶ジ视王?Labrafil M1944 CS)由法國(guó)Gattefossé公司提供；大豆磷脂(Lipoid S 100，德國(guó)Lipoid公司)；吐溫-80 (美國(guó)Sigma公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)皂苷分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(35∶65)；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。在該色譜條件下，絞股藍(lán)皂苷峰的理論塔板數(shù)≥10 000，分離度>1.5。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取絞股藍(lán)皂苷對(duì)照品適量溶于甲醇，分別配制成濃度為2、12、30、60、90、150 μg/ml的絞股藍(lán)皂苷對(duì)照溶液，分別吸取20 μl,注入高效液相色譜儀,記錄峰面積值(A),以濃度(c)對(duì)A作線性回歸，得到回歸方程為：A=9.249c+21.253(r=0.999 4)。結(jié)果表明，在2～150 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 GPS-NLCs及GPS-SLNs的制備 (1)GPS-NLCs的制備：采用高壓均質(zhì)法制備GPS-NLCs。將處方量的混合脂質(zhì)(固體脂質(zhì)為單硬脂酸甘油酯，液態(tài)脂質(zhì)為單亞油酸甘油酯和油?；垡叶几视王?水浴加熱至65 ℃，攪拌條件下充分混合，熔融得到油相；將處方量的絞股藍(lán)皂苷和乳化劑(大豆磷脂∶吐溫-80=1∶1)置于燒杯中混合后，加適量蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓⒓訜嶂劣拖嗟臏囟?，即得到水相。在T25高度分散儀高速分散下，將水相加入到油相中，持續(xù)攪拌一段時(shí)間，得到初分散體系，再經(jīng)高壓乳勻，即得GPS-NLCs。以粒徑和多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)為指標(biāo)，對(duì)分散儀的攪拌功率、攪拌時(shí)間、均質(zhì)壓力以及均質(zhì)次數(shù)這4個(gè)參數(shù)進(jìn)行篩選。工藝參數(shù)的設(shè)置以及各參數(shù)下制備的GPS-NLCs的粒徑和PDI見表1。由表1可知，攪拌功率對(duì)粒徑和PDI的影響均較小，隨著攪拌時(shí)間、均質(zhì)壓力以及均質(zhì)次數(shù)的增加，粒徑呈先減小后增大的趨勢(shì)?？紤]到均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致體系溫度升高，粒徑減小，故確定工藝參數(shù)如下：攪拌功率6000 W，攪拌時(shí)間6 min，均質(zhì)壓力80 MPa(800 bar)，均質(zhì)次數(shù)8次。 (2)GPS-SLNs的制備：僅以固態(tài)脂質(zhì)替代液態(tài)脂質(zhì)，其余組分與GPS-NLCs處方相同，采用高壓均質(zhì)法以同樣的工藝制備GPS-SLNs。

表1 高壓均質(zhì)法制備GPS-NLCs的工藝參數(shù)優(yōu)化Table 1 Optimization of the process parameters of GPS-NLCs prepared by high-pressure homogenization method

2.3 理化性質(zhì)考察

2.3.1 粒徑及zeta電位的測(cè)定 將制備好的GPS-NLCs用適量去離子水稀釋后，測(cè)定粒徑及zeta電位。GPS-NLCs的平均粒徑為(159.6±6.6) nm，PDI為(0.221±0.009)，其粒徑分布較窄，為60～200 nm，GPS-NLCs的zeta電位為(-31.1±1.3) mV，表明制得的納米粒表面帶負(fù)電荷，穩(wěn)定性較好。

2.3.2 包封率及載藥量的測(cè)定 采用超濾法測(cè)定GPS-NLCs的包封率(entrapment efficiency,EE)及載藥量(drug loading,DL)。精密移取0.5 ml制得的GPS-NLCs混懸液，加入適量乙腈破乳，超聲(功率500 W)30 min后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用HPLC法測(cè)定GPS濃度，計(jì)算總藥量(W總)。另取0.5 ml GPS-NLCs置超濾離心管中(截留分子量10 ku)，以相對(duì)離心力2.795×103×g離心15 min，取濾液，經(jīng)HPLC法測(cè)定，計(jì)算游離指標(biāo)性成分的含量(W游離)。參照下列公式分別計(jì)算包封率和載藥量：EE=(W總-W游離)/W總×100%，DL=(W總-W游離)/W脂質(zhì)×100%，其中W脂質(zhì)為制劑中加入的脂質(zhì)材料的質(zhì)量。測(cè)得GPS-NLCs的包封率和載藥量分別為(74.30±3.17)%和(4.91±0.39)%(n=3)，表明NLCs對(duì)藥物有較好的包裹和裝載能力。

2.3.3 形態(tài)觀察 利用透射電鏡(transmission electron microscopy)對(duì)GPS-NLCs的外觀形態(tài)進(jìn)行觀察。將GPS-NLCs分散于適量去離子水中，取適量滴加至銅網(wǎng)上自然干燥，約20 min后形成薄膜，再滴加2%磷鎢酸負(fù)染10 min，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸除多余液體，晾干后放至透射電鏡下進(jìn)行觀察。GPS-NLCs的透射電鏡觀察結(jié)果見圖1。由圖1可見，納米粒近球形，分布較均勻。

圖1 GPS-NLCs的透射電鏡圖Figure 1 Transmission electron micrograph of GPS-NLCsGPS-NLCs：載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體

2.4 體外溶出實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證 NLCs 在提高藥物溶出度上的優(yōu)勢(shì)，將其與絞股藍(lán)皂苷原藥粉混懸液以及初代脂質(zhì)體系SLNs進(jìn)行比較，采用透析袋法對(duì)各制劑的體外溶出行為進(jìn)行考察。將制備好的GPS-NLCs、GPS-SLNs以及絞股藍(lán)皂苷混懸液各5 ml加至處理好的透析袋內(nèi)，透析袋兩端用醫(yī)用編織線扎緊，用橡皮筋固定在攪拌漿上，浸沒在100 ml溶出介質(zhì)[PEG 400的生理鹽水溶液，PEG 400∶生理鹽水=1∶4(V/V)]中，恒溫(37±0.5) ℃，攪拌速度為120 r/min，采用槳法。分別于特定時(shí)間點(diǎn)吸取溶液1 ml，同時(shí)補(bǔ)充等體積空白溶出介質(zhì)，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，經(jīng)HPLC法測(cè)定GPS濃度。每種制劑做3份平行操作。

釋藥曲線如圖2所示，絞股藍(lán)皂苷原藥粉的溶出速率要高于SLNs組和NLCs組，在30 min內(nèi)就達(dá)到了溶解平衡。SLNs組和NLCs組則在40 h后才達(dá)到溶解平衡，這是由于藥物要通過脂質(zhì)層才得以釋放。同時(shí)，SLNs組和NLCs組的體外累積溶出度均明顯高于原藥粉組。推測(cè)原因可能是因?yàn)榻?jīng)高壓均質(zhì)制成SLNs和NLCs后，藥物可能以無定型狀態(tài)存在于載體中[9]。此外，NLCs組在48 h內(nèi)的體外累積溶出度要高于SLNs組，可能是由于液態(tài)脂質(zhì)的加入打亂了納米粒的有序結(jié)構(gòu)排列，使得NLCs具有更高的體外累積溶出度[10]。因此，NLCs能夠顯著改善絞股藍(lán)皂苷原藥粉的溶出度。與SLNs相比，NLCs在改善藥物溶出度上也具有一定的優(yōu)勢(shì)。

圖2 GPS的釋藥曲線Figure 2 Drug release profiles of GPS○:GPS混懸液；●：GPS-SLNs；△：GPS-NLCs；GPS：絞股藍(lán)皂苷；GPS-SLNs：載絞股藍(lán)皂苷固體脂質(zhì)納米粒；GPS-NLCs：載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；

3 討 論

絞股藍(lán)皂苷水溶性差，性質(zhì)不穩(wěn)定，限制了其在臨床的應(yīng)用。本研究采用高壓均質(zhì)法將其制成GPS-NLCs，提高了其體外釋放，且GPS-NLCs釋藥特點(diǎn)是前期快速釋放，后期緩慢釋藥，具有明顯的緩釋效果。GPS-NLCs體外釋放顯著提高的原因可能是降低了制劑的粒徑，增大了其比表面積。從藥物學(xué)來說，藥物的溶出速率與藥物顆粒的比表面積成正比，而比表面積與粒徑成反比。因此，藥物的粒徑越小，其比表面積越大，接觸周圍介質(zhì)的面積愈大，越有助于藥物有效成分的溶出[11]。GPS-NLCs粒徑約為160 nm，降低粒徑后增大了比表面積和藥物飽和溶解度，從而提高了藥物的釋放量。GPS-NLCs的生物利用度有待通過藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步研究，期望本研究能為絞股藍(lán)新型制劑的研究和開發(fā)提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。