聶述琳，朱鋒 ,孟翔峰，聶蓉蓉

[南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院(南京市口腔醫(yī)院) 1.修復(fù)科，2. 頜面外科，江蘇 南京 210008]

外傷脫位牙是指牙齒因?yàn)橥鈧麖难啦酃侵型耆摮觯亲顕?yán)重的牙病之一。牙脫位造成神經(jīng)血管供應(yīng)受損，人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts, hPDLFs)喪失和牙髓壞死[1]。即刻牙再植被認(rèn)為是一種有效的治療外傷脫位牙的方法，但這往往難以做到，牙再植術(shù)成功的關(guān)鍵是術(shù)前最大限度保存牙根表面hPDLFs活力。如果牙根表面hPDLFs數(shù)量較少，再植后則會(huì)導(dǎo)致牙周膜愈合不良，發(fā)生骨性粘連或牙根外吸收。因此學(xué)者們建議，如果不能立即行脫位牙再植術(shù)，則應(yīng)將撕脫的牙齒保存在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中以保持生存能力，特別是細(xì)胞增殖能力[2-3]。

本研究旨在通過體外細(xì)胞培養(yǎng)模擬牙脫位保存模型，研究不同保存介質(zhì)和保存溫度對(duì)hPDLFs活性和增殖能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

本研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，編號(hào)2014NL-025(KS)。

選擇南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院頜面外科門診因正畸需拔除的青少年的健康雙尖牙進(jìn)行牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)液，含10%胎牛血清(Gibco)、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺、100 IU·ml-1青霉素和100 μg·ml-1鏈霉素(Invitrogen)。培養(yǎng)瓶置于37 ℃恒溫孵箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、100%濕度。

細(xì)胞培養(yǎng)至第4代進(jìn)行角蛋白和波形絲蛋白染色鑒定，0.3% Triton X-100 (Sigma)對(duì)細(xì)胞作用5 min后用5%牛血清白蛋白(Sigma)封閉1 h。樣品洗滌后，在37 ℃下用熒光標(biāo)記的二抗(Invitrogen)孵育1 h，細(xì)胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) (Sigma)染色。圖像由共聚焦熒光顯微鏡(Olympus)拍攝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將第5代細(xì)胞消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·ml-1，96孔板(Thermo Fisher Scientific)每孔接種100 μl 細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合到80%左右時(shí)去除原培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗兩遍后分別加入PBS、全脂牛奶(光明)、唾液和純凈水4種保存介質(zhì)，每組100 μl，其中加入PBS的為對(duì)照組，其余3種為實(shí)驗(yàn)組。唾液采用0.22 μm除菌過濾器過濾滅菌。選擇兩個(gè)實(shí)驗(yàn)條件(4 ℃和室溫)，放置1 h，然后去除對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗兩遍。

1.2.1 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷 (5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)實(shí)驗(yàn) 漂洗后每孔加入含10 μmol·L-1EdU的DMEM培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞；多聚甲醛固定后加入含Alexa FluorTM488熒光染料的EdU反應(yīng)液，室溫孵育30 min；PBS漂洗細(xì)胞后采用DAPI染料染色細(xì)胞核，甘油封片后采用激光共聚焦顯微鏡觀察具有綠色熒光的細(xì)胞密度。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)實(shí)驗(yàn) 漂洗后每孔重新加入DMEM培養(yǎng)基100 μl，孵育24 h后棄除原培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍后分別加入含10%CCK-8(Dojindo Laboratories)的DMEM培養(yǎng)基100 μl，放置培養(yǎng)箱中保存2 h后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值(OD值)，對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)為了分析不同保存介質(zhì)對(duì)hPDLFs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，我們按照上述方法連續(xù)檢測(cè)24、48和72 h的OD值，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相同溫度下不同保存介質(zhì)之間采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，同種保存介質(zhì)不同溫度條件之間采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人牙周膜細(xì)胞鑒定

對(duì)分離純化后的第4代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定結(jié)果(圖1)顯示：該細(xì)胞表達(dá)波形蛋白(圖1C)，不表達(dá)角蛋白(圖1B)，符合hPDLFs特征。

圖1 人牙周膜細(xì)胞的鑒定

2.2 EdU實(shí)驗(yàn)

EdU實(shí)驗(yàn)顯示：在相同的保存溫度下，牛奶處理hPDLFs 1 h后，EdU陽(yáng)性細(xì)胞(綠色)約占總細(xì)胞的50.9%(4 ℃)和41%(室溫)，表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；采用唾液處理hPDLFs 1 h后，EdU陽(yáng)性細(xì)胞(綠色)約占總細(xì)胞的36.56%(4 ℃)和27.33%(室溫)，表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)；當(dāng)采用純凈水處理細(xì)胞后，細(xì)胞大量死亡，存活數(shù)量極少(圖2)。當(dāng)選擇相同的保存介質(zhì)時(shí)，細(xì)胞保存在4 ℃環(huán)境下EdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于室溫保存的細(xì)胞。上述結(jié)果提示，細(xì)胞保存于牛奶和低溫環(huán)境中更有利于維持其增殖活性。

a、b、c、d相同字母間比較，P>0.05；不同字母間比較，P<0.05

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

為了明確不同保存介質(zhì)和溫度對(duì)hPDLFs 細(xì)胞活力的影響，采用CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同的保存介質(zhì)干預(yù)hPDLFs 1 h后，以PBS 4 ℃為對(duì)照組基數(shù)(100%)，4 ℃下牛奶、唾液、純凈水中hPDLFs活力依次約為62.8%、17.8%、3.3%，室溫下則依次為56.2%、15.2%、0.7%(圖3)，不同處理組間CCK-8檢測(cè)OD值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果提示，細(xì)胞保存于牛奶和低溫環(huán)境中更有利于維持其活力。

a、b、c、d相同字母間比較，P>0.05；不同字母間比較，P<0.05

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

為了進(jìn)一步探討不同保存介質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，hPDLFs經(jīng)過不同保存介質(zhì)和溫度預(yù)處理1 h后更換完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。CCK-8檢測(cè)顯示，細(xì)胞保存于4 ℃牛奶中的生長(zhǎng)曲線最接近于正常對(duì)照，而保存于唾液和純凈水中的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，與牛奶保存相比，細(xì)胞增殖速率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在室溫條件保存，細(xì)胞雖然在48 h表現(xiàn)出與4 ℃組類似的增殖活性，但是在72 h 時(shí)，牛奶組的增殖活性低于4 ℃組，唾液和純凈水則出現(xiàn)了增殖遲緩甚至減少的趨勢(shì)(圖4)。上述結(jié)果表明，細(xì)胞保存于牛奶和低溫環(huán)境中更有利于維持其原有的生長(zhǎng)狀態(tài)。

a、b、c、d相同字母間比較，P>0.05；不同字母間比較，P<0.05

3 討 論

3.1 暴露時(shí)間和實(shí)驗(yàn)方法的選擇

如何為外傷脫位牙找到最合適的存儲(chǔ)介質(zhì)，是口腔創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)。在以往的研究中，各種類型的存儲(chǔ)介質(zhì)在體外維持hPDLFs生存能力的有效性，主要是將存儲(chǔ)介質(zhì)作為培養(yǎng)基作用在培養(yǎng)的hPDLFs上進(jìn)行測(cè)試，或?qū)⑻崛〉难例X直接浸入測(cè)試介質(zhì)中，然后對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行定量[4-5]。本研究選擇的是前者，也就是在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上使用不同的存儲(chǔ)液，主要是考慮充足的細(xì)胞量能夠保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。本研究選取的暴露時(shí)間也就是脫位牙需要使用存儲(chǔ)介質(zhì)的時(shí)間是1 h，因?yàn)橐话闱闆r下，牙齒脫位后患者基本能在1 h左右趕往醫(yī)院急診進(jìn)行再植手術(shù)，所以我們的研究方案是將牙根表面牙周膜細(xì)胞先在儲(chǔ)存介質(zhì)中保存1 h，然后檢測(cè)更換為正常培養(yǎng)基后24、48、72 h細(xì)胞的活力和增殖能力，以此模擬脫位牙再植后牙根表面牙周膜細(xì)胞的一個(gè)生存狀態(tài)。

3.2 保存介質(zhì)的影響

已經(jīng)有很多研究就牛奶、橄欖油、蜂膠、椰子水、Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)及多種培養(yǎng)基作為脫位牙保存介質(zhì)，對(duì)hPDLF增殖活力的影響進(jìn)行過研究，盡管多數(shù)認(rèn)為HBSS是一種最適合用作外傷脫位牙保存的媒介，但在日常生活中難以即刻獲得[6]。本研究主要從保存液獲取的難易程度上考慮，選擇了民眾最容易立即得到的牛奶、唾液、純凈水3種保存液。從研究結(jié)果我們看到，以牛奶作為培養(yǎng)介質(zhì)的hPDLFs，細(xì)胞活性最好，48和72 h細(xì)胞持續(xù)增長(zhǎng)。本研究結(jié)果也符合美國(guó)牙髓病學(xué)協(xié)會(huì)建議將牛奶作為脫位牙保存介質(zhì)的指導(dǎo)意見。

牛奶作為儲(chǔ)存介質(zhì)的有效性可能是其具有適宜的生理pH值和滲透壓，同時(shí)牛奶里含有一些營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin like growth factor，IGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)、 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)，這些都能促使細(xì)胞更好地增殖[7]。唾液是一種生理保存液，尤其是在牙外傷時(shí)，因環(huán)境條件等限制，它可認(rèn)為是保存脫位牙方便而快捷的介質(zhì)。因?yàn)橥僖旱臐B透壓較低且存有細(xì)菌，所以進(jìn)行牙再植術(shù)前，應(yīng)用生理鹽水將脫位牙根面因外傷所致的細(xì)胞溶解物、殘?jiān)屯僖褐械募?xì)菌洗凈，以保證再植牙的成功[8]。純凈水是一種易于獲得的保存介質(zhì)，但是由于純凈水的pH值、低滲透壓可以導(dǎo)致細(xì)胞裂解，它在一定程度上可以作為陰性對(duì)照[9-10]。

3.3 溫度的影響

溫度對(duì)貯藏溶液維持細(xì)胞增殖能力的影響也需要進(jìn)一步研究。系統(tǒng)性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，大部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，4 ℃時(shí)hPDLFs的活力比20 ℃時(shí)更高，這些保存介質(zhì)包括了牛奶、椰汁、蜂膠、蛋清、水；但HBSS卻相反，研究結(jié)果顯示，20 ℃保存條件下hPDLFs的活力更好[5]。也有研究認(rèn)為，只要hPDLFs儲(chǔ)存在合適的培養(yǎng)基如HBSS、DMEM或牛奶中，溫度起的作用很小[11-12]。然而本研究的結(jié)果與Sigalas等[13]的發(fā)現(xiàn)相同，細(xì)胞在4 ℃ 的低溫作用下，雖然對(duì)后期增殖能力有所影響，但48、72 h后其增殖能力是逐漸恢復(fù)的。所以我們認(rèn)為低溫介質(zhì)更適合于保護(hù)hPDLFs的增殖能力。

雖然本研究結(jié)果認(rèn)為低溫牛奶是保存外傷脫位牙最為方便有效的保存介質(zhì)，但值得注意的是實(shí)驗(yàn)室研究和真正臨床病例的差異性，我們還需要結(jié)合更多的其他細(xì)胞代謝測(cè)定方法，才能得出最終的結(jié)論。