毛士明，曹金強(qiáng)，汪萬國(guó)，鄭燦

(枝江市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 枝江 443200)

再灌注損傷是缺血性腦卒中治療過程中的一個(gè)難題，深入探討缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷的機(jī)制對(duì)其治療有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度19～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以與信使RNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[1]。miRNA廣泛表達(dá)于人體各個(gè)組織和器官，在細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞周期、表觀遺傳學(xué)和免疫監(jiān)控中起到重要作用[1]。miR-30e與機(jī)體免疫炎癥損傷密切相關(guān)[2]，可通過調(diào)控凋亡基因Bcl-2影響腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-30e可以通過改善自噬對(duì)心臟IR損傷有一定保護(hù)作用[4]。miR-30e在腦IR損傷中的作用和機(jī)制既往鮮有報(bào)道。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是白三烯生物合成的關(guān)鍵酶，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病有關(guān)[5]。5-LOX過表達(dá)可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致腦IR損傷后神經(jīng)元損傷[6]。本研究采用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析miR-30e與5-LOX的靶向作用關(guān)系，通過大鼠實(shí)驗(yàn)探討miR-30e在腦IR損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 miR-30e 激動(dòng)劑(miR-30e agomir)、miR-30e 激動(dòng)劑對(duì)照試劑、miR-30e 拮抗劑(miR-30e antagomir)、miR-30e 拮抗劑對(duì)照試劑、miR-30e模擬物、miR-30e抑制劑和5-LOX siRNA均購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2倍SYBR Green PCR Mastermix試劑盒均購于美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒均購于北京百奧萊博科技有限公司；5-LOX抗體和羊抗兔抗體購于美國(guó)Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒購于武漢博士德生物有限公司；二甲基亞砜、噻唑蘭(MTT)檢測(cè)試劑盒購于美國(guó)Sigma公司。主要儀器有腦立體定位儀(型號(hào)51700，美國(guó)Stoelting公司)、全自動(dòng)發(fā)光儀(型號(hào)ACCESS2，美國(guó)貝克曼庫爾特公司)、酶標(biāo)儀(型號(hào)SAF-680T，上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司)、流式細(xì)胞儀(型號(hào)FACSCalibur，美國(guó)BD公司)。

1.1.2 細(xì)胞 PC12細(xì)胞購于上海復(fù)祥生物科技有限公司，用含有10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，用0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞后1 000 r·min-1離心10 min，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠70只，體重250～300 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號(hào)SCXK(京)2012-003。將大鼠在溫度為(21±1)℃、濕度為(50±5)%、明暗周期為12 h/12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)，允許自由攝食和飲水。

1.2 大鼠腦IR損傷模型的建立

參照文獻(xiàn)[7]方法建立大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型。用100 g·L-1水合氯醛溶液(3 ml·kg-1)腹腔注射麻醉后分離頸總動(dòng)脈分叉、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈近心端，隨后用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。在頸總動(dòng)脈分叉上2 mm處開一小口，將尼龍線栓緩慢插入頸總動(dòng)脈，調(diào)整頭端方向，感覺有突破感時(shí)說明進(jìn)入顱內(nèi)。繼續(xù)推進(jìn)20 mm，感到有阻力時(shí)停止。將頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的預(yù)留線系緊，剪去線頭。術(shù)畢逐層縫合皮膚。缺血2 h后拔出線栓，若大鼠出現(xiàn)明顯的局灶神經(jīng)功能缺損例如一側(cè)傾倒，說明造模成功。本研究大鼠均造模成功。

1.3 大鼠分組及干預(yù)

將大鼠隨機(jī)分為7組各10只：(1) 假手術(shù)組，僅做頸部切口，無IR損傷;(2) 模型組，建立腦IR損傷模型；(3) 載體組，建立IR損傷模型，用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理水干預(yù)；(4) miR-30e激動(dòng)劑組，建立IR損傷模型，用miR-30e激動(dòng)劑干預(yù)；(5) 激動(dòng)劑對(duì)照組，建立IR損傷模型，用激動(dòng)劑對(duì)照試劑干預(yù)；(6) miR-30e拮抗劑組，建立IR損傷模型，用miR-30e拮抗劑干預(yù)；(7) 拮抗劑對(duì)照組，建立IR損傷模型，用拮抗劑對(duì)照試劑干預(yù)。3～7組大鼠均進(jìn)行側(cè)腦室注射(前囟后1 mm，向右旁1.4 mm，硬腦膜下4.0 mm[8])，將miR-30e激動(dòng)劑、激動(dòng)劑對(duì)照試劑、miR-30e拮抗劑、拮抗劑對(duì)照試劑溶于DEPC處理水中，稀釋至100 μmol·L-1，注射體積為10 μl。干預(yù)24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：無明顯神經(jīng)功能缺損為0分，提尾巴時(shí)動(dòng)物左前肢屈曲不能伸直為1分，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、靜息時(shí)可維持平衡為2分，行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒為3分，無可見活動(dòng)為4分[9]。評(píng)估結(jié)束后處死大鼠。

1.4 大鼠腦梗死體積檢測(cè)

處死大鼠后迅速取腦，用切片機(jī)切成5個(gè)冠狀切片，厚度約2 mm。用2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色30 min，然后浸泡于4%多聚甲醛過夜。梗死組織為白色，正常腦組織為紅色。梗死體積(%)=缺血區(qū)重量/總重量。

1.5 實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

用TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取大鼠皮質(zhì)梗死周圍區(qū)組織中的總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用2倍SYBR Green PCR Mastermix試劑盒檢測(cè)miR-30e與5-LOX mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃、20 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCq法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

用RAPI裂解液提取大鼠皮質(zhì)梗死周圍區(qū)組織中總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗5-LOX(1∶1 000)4 ℃過夜孵育，第2天除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗(羊抗兔，1∶500)，封閉1 h。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，用ECL發(fā)光儀對(duì)蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)半胱氨酸白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLT)和白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算濃度。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用Targetscan和MiRDB軟件預(yù)測(cè)miR-30e和5-LOX的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型(psiCHECKTM-2-5-LOX-wt)和突變型(psiCHECKTM-2-5-LOX-mut)報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，再用miR-30e 模擬物或抑制劑進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為以下7組：(1) 僅將空載體組轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，設(shè)為psiCHECKTM-2組；(2) 將 陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染入含有野生型空載體的293T細(xì)胞中，設(shè)為5-LOX-Wt+NC組；(3) 野生型報(bào)告載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，用miR-30e 模擬物干預(yù)，設(shè)為5-LOX-Wt+mimic組；(4) 野生型報(bào)告載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，用miR-30e 抑制劑干預(yù)，設(shè)為5-LOX-Wt+inhibitor組；(5) 將陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染入含有突變型空載體的293T細(xì)胞中，設(shè)為5-LOX-Mut+NC組；(6) 將突變型報(bào)告載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，用miR-30e 模擬物干預(yù)，設(shè)為5-LOX-Mut+mimic組；(7) 將突變型報(bào)告載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，用miR-30e抑制劑干預(yù)，設(shè)為5-LOX-Mut+inhibitor組。psiCHECKTM-2載體能同時(shí)表達(dá)腎素?zé)晒馑孛负臀灮鹣x熒光素酶。miR-30e與5-LOX-Wt載體的結(jié)合作用可降低腎素?zé)晒馑孛?，而非螢火蟲熒光素酶的表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，用PromegaE1910雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定螢火蟲和腎素?zé)晒馑孛傅幕钚浴?/p>

1.9 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型建立及干預(yù)

轉(zhuǎn)染mimic或inhibitor后，建立缺氧-葡萄糖剝奪和復(fù)氧(oxygen glucose deprivation and reoxygenation，OGDR)損傷模型。將PC12細(xì)胞在缺氧(1%O2、94%N2和5%CO2)室中培養(yǎng)12 h，隨后在正常條件下培養(yǎng)4 h[10]。根據(jù)處理?xiàng)l件不同將細(xì)胞分為以下幾組：(1) 常 氧組，細(xì)胞在正常氧氣條件下培養(yǎng)；(2) OGDR組，建立OGDR損傷模型，但不進(jìn)行干預(yù)；(3) mim-miR-NC組，建立OGDR損傷模型，用miR-30e模擬物對(duì)照試劑干預(yù)；(4) mim-miR-30e組，建立OGDR損傷模型，用30 μmol·L-1miR-30e mimic干預(yù)；(5) mim-miR-30e+si-5-LOX組，建立OGDR損傷模型，用30 μmol·L-1miR-30e mimic和2 μmol·L-1si-5-LOX干預(yù)；(6) inh-miR-NC組，建立OGDR損傷模型，用miR-30e抑制劑對(duì)照試劑進(jìn)行干預(yù)；(7) inh-miR-30e組，建立OGDR損傷模型，用100 nmol·L-1miR-30e inhibitor干預(yù)；(8) inh-miR-30e+si-5-LOX組，建立OGDR損傷模型，用100 μmol·L-1miR-30e inhibitor和2 μmol·L-1si-5-LOX干預(yù)。

1.10 細(xì)胞活力檢測(cè)

用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，PC12細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行如1.9中的細(xì)胞干預(yù)。隨后每孔加入20 μl的MTT液，37 ℃條件下孵育4 h，去除原培養(yǎng)基，在每孔中加入二甲基亞砜(150 μl)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.11 流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行如1.9中的細(xì)胞干預(yù)。加入磷酸鹽緩沖液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)·ml-1。 混合后取1 ml細(xì)胞懸液，100 r·min-1離心10 min后棄上清，加入碘化丙啶和膜聯(lián)蛋白Ⅴ-FITC各5 μl，充分混合，室溫避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-30e激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)IR損傷大鼠神經(jīng)功能和腦梗死的影響

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能障礙及腦梗死；其余6組神經(jīng)功能評(píng)分明梗死體積的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別F=65.321和F=52.109，均P<0.001)；與激動(dòng)劑對(duì)照組比較，miR-30e激動(dòng)組神經(jīng)功能評(píng)分明顯較低、梗死體積明顯較小(均P<0.05)；與拮抗劑對(duì)照組比較，miR-30e拮抗劑組神經(jīng)功能評(píng)分明顯較高、梗死體積明顯較大(均P<0.05)。見圖1。

a 與假手術(shù)組比較，P<0.05；b 與激動(dòng)劑對(duì)照組比較，P<0.05；c 與拮抗劑對(duì)照組比較，P<0.05

2.2 miR-30e激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)IR損傷大鼠5-LOX的影響

7組miR-30e相對(duì)表達(dá)量和 5-LOX蛋白表達(dá)量的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別F=44.240和F=29.002，均P<0.001)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)梗死周圍區(qū)組織miR-30e和5-LOX表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)；與激動(dòng)劑對(duì)照組比較，miR-30e激動(dòng)組miR-30e和5-LOX表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05)；與拮抗劑對(duì)照組比較，miR-30e拮抗劑組miR-30e和5-LOX表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。見圖2。

a 與假手術(shù)組比較，P<0.05；b 與激動(dòng)劑對(duì)照組比較，P<0.05；c 與拮抗劑對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 miR-30e激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)IR損傷大鼠炎癥因子的影響

7組CysLT和LTB4 表達(dá)水平的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別F=23.931和F=30.002，均P<0.001)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)梗死周圍區(qū)組織CysLT和LTB4表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)；與激動(dòng)劑對(duì)照組比較，miR-30e激動(dòng)組CysLT和LTB4表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05)；與拮抗劑對(duì)照組比較，miR-30e拮抗劑組CysLT和LTB4表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。見圖3。

a 與假手術(shù)組比較，P<0.05；b 與激動(dòng)劑對(duì)照組比較，P<0.05；c 與拮抗劑對(duì)照組比較，P<0.05

2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-30e對(duì)5-LOX的靶向作用關(guān)系

用TargetScan在線工具預(yù)測(cè)到5-LOX是miR-30e的候選靶基因。7組腎素/螢火蟲熒光素酶活性比值的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.234，P=0.001)。與5-LOX-Wt+NC組比較，5-LOX-Wt+mimic組的腎素/螢火蟲熒光素酶活性比值明顯降低(P<0.05)，5-LOX-Wt+inhibitor組明顯升高(P<0.05)。當(dāng)miR-30e結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，5-LOX-Mut+mimic組和5-LOX-Mut+inhibitor組的腎素/螢火蟲熒光素酶活性比值均保持在較高水平，見圖4。以上結(jié)果說明，5-LOX是miR-30e的靶基因。

a 與5-LOX-Wt+NC組比較，P<0.05

2.5 miR-30e 模擬物或抑制劑對(duì)OGDR損傷細(xì)胞5-LOX的影響

6組miR-30e相對(duì)表達(dá)量和5-LOX蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別F=11.134和F=9.201，均P<0.01)；與常氧組比較，OGDR組miR-30e和5-LOX表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)；與mim-miR-NC組比較，mim-miR-30e組miR-30e和5-LOX表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)；與inh-miR-NC組比較，inh-miR-30e組miR-30e和5-LOX表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。見圖5。

a 與常氧組比較，P<0.05；b 與mim-miR-NC組比較，P<0.05；c 與inh-miR-NC組比較，P<0.05

2.6 miR-30e模擬物或抑制劑對(duì)OGDR損傷細(xì)胞的活力和凋亡的影響

8組細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞凋亡率的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別F=10.012和F=15.003，均P<0.001)；與常氧組比較，OGDR組細(xì)胞活力明顯下降，而凋亡明顯增加(均P<0.05)；與mim-miR-NC組比較，mim-miR-30e組和mim-miR-30e+si-5-LOX組細(xì)胞活力明顯升高，而凋亡明顯減少(均P<0.05)；與inh-miR-NC組比較，inh-miR-30e組細(xì)胞活力明顯下降，而凋亡明顯增加，inh-miR-30e+si-5-LOX組細(xì)胞活力明顯升高，而凋亡明顯減少(均P<0.05)。見圖6。

a 與常氧組比較，P<0.05；b 與mim-miR-NC組比較，P<0.05；c 與inh-miR-NC組比較，P<0.05

3 討 論

越來越多的研究證實(shí)，miRNA在IR損傷中發(fā)揮重要作用[11]。miR-30e是miR-30家族的重要成員之一，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬和細(xì)胞周期等有關(guān)，可參與癌癥[12]、糖尿病[13]和心臟病[14]等疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-30e在大鼠腦IR損傷后皮質(zhì)梗死周圍區(qū)中顯著升高，并且可能與神經(jīng)炎癥有關(guān)。神經(jīng)炎癥時(shí)腦IR損傷后常見的病理變化與神經(jīng)功能缺損密切相關(guān)[15]。

miR-30e在炎癥損傷中的作用機(jī)制尚未明確，可能通過NLRP3 炎癥小體[2]、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路[16]和Notch信號(hào)通路[17]等發(fā)揮作用。本研究采用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)5-LOX是miR-30e的靶基因。5-LOX是白三烯生物合成的關(guān)鍵酶，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病有關(guān)[5]。本研究中，腦IR損傷后5-LOX、CysLT和LTB4表達(dá)水平明顯升高，miR-30e 激動(dòng)劑明顯降低了其表達(dá)，而miR-30e 拮抗劑又可以上調(diào)其表達(dá)，說明miR-30e在腦IR損傷中起到抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，miR-30e 激動(dòng)劑可減輕腦IR損傷誘發(fā)的神經(jīng)損傷，并縮小梗死面積，而miR-30e 拮抗劑可加重神經(jīng)損傷，說明miR-30e有神經(jīng)保護(hù)作用，本研究體外研究也予以證實(shí)。體外研究顯示，miR-30e可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞活性并抑制細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-30e與5-LOX的關(guān)系，我們用siRNA下調(diào)PC12細(xì)胞中5-LOX的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA可以緩解miR-30e抑制劑對(duì)細(xì)胞的損傷，而miR-30e模擬物可以抵消這種作用。miR-30e抑制劑可以抵消miR-30e對(duì)5-LOX的抑制作用，加重細(xì)胞損傷。然而當(dāng)用miR-30e 模擬物處理細(xì)胞時(shí)，雖然5-LOX表達(dá)明顯下調(diào)，但是5-LOX-siRNA并不能降低5-LOX表達(dá)，說明5-LOX-siRNA并不能緩解miR-30e模擬物導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷。以上結(jié)果說明，5-LOX是miR-30e下游的重要分子。

綜上所述，miR-30e對(duì)大鼠腦IR損傷和OGDR細(xì)胞損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用可能通過5-LOX進(jìn)行介導(dǎo)。miR-30e可能是治療腦IR損傷的潛在靶點(diǎn)。