秦寶山，郭云霞，韓莉

(鄭州人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,河南 鄭州 450000)

結(jié)腸癌的發(fā)生受多種分子通路的調(diào)控[1]。真核細(xì)胞翻譯起始因子2a(eIF2a)是近年關(guān)注到的與腫瘤進(jìn)展有關(guān)的因子，其不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞的翻譯，還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移[2-3]。近年學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中存在多種微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)[4]。miRNA是非編碼RNA，通過多種方式、在多個(gè)層面調(diào)控DNA構(gòu)象的改變、RNA的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的翻譯，主要作用特征是對(duì)靶基因的調(diào)控。我們應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)影響結(jié)腸癌進(jìn)展的miRNA進(jìn)行篩選，選擇在結(jié)腸癌中罕見報(bào)道的微小RNA-215-5p(miR-215-5p)進(jìn)行研究[3]，并應(yīng)用TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因，篩選出與miR-215-5p具有結(jié)合位點(diǎn)的eIF2a進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖1)[5]，并基于此開展研究，關(guān)注miR-215-5p與eIF2a的靶向關(guān)系，探討其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的調(diào)控。

圖1 TargetScan顯示的miR-215-5p與eIF2a的結(jié)合位點(diǎn)

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年4月至2015年3月期間確診為結(jié)腸癌并行根治手術(shù)的患者55例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 有明確的病理診斷，符合WHO中的標(biāo)準(zhǔn)；(2) 為首診患者；(3) 臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 伴有風(fēng)濕免疫性疾病或遺傳性疾病者；(2) 有林奇綜合征者；(3) 術(shù)前行放、化療者。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣>5 cm的正常結(jié)腸黏膜組織作為對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞系

選擇人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系(購于上海中喬新舟生物公司)復(fù)蘇，在37 ℃、5%的CO2完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 d傳1代，在細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞密度約為5 000個(gè)·cm-2。

1.3 方法

1.3.1 miR-215-5p的檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)miR-215-5p的表達(dá)。首先提取總RNA。引物由上海碧云天生物公司合成。miR-215-5p上游5′-TCACTGTGTGAACCGGACGTGTGTG-3′，下游5′-GCTAGCGTGGTTTTAAATCCGGT-3′。以U6作為內(nèi)參，引物上游5′-GGCAGAAACGTGGAACCGGC-3′，下游5′-TTGGAACAGTGGGCAAATTCCG-3′。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)后進(jìn)行延伸。于60 ℃采集信號(hào)。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結(jié)果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-Ct對(duì)照(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct對(duì)照(校正樣品)]。

1.3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 帶有eIF2a的野生型、突變型3′-UTR的質(zhì)粒由吉瑪公司(中國，上海)合成。共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及miR-215-5p mimics，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)，觀察miR-215-5p與eIF2a的3′-UTR結(jié)合情況。

1.3.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、miR-215-5p轉(zhuǎn)染組、miR-215-5p與eIF2a共轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)eIF2a、Ki67的表達(dá)。試劑購自上海碧云天生物公司。以GAPDH作為內(nèi)參。依次進(jìn)行蛋白提取、濃度測(cè)定、變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)及免疫雜交，取出膜加入發(fā)光液 3 min后顯影。以目的蛋白與GAPDH的比值作為相對(duì)量進(jìn)行分析，應(yīng)用Image J分析完成。嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)質(zhì)控。

1.3.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) Ki67和eIF2a濃縮液均購自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)腸癌中eIF2a(1∶150稀釋)、Ki67(1∶200)的表達(dá)?；谑灠窠M織，切取4 μm切片，按實(shí)驗(yàn)步驟滴加一抗、二抗后行DAB顯色。切片由病理科醫(yī)師判讀，應(yīng)用盲法，eIF2a陽性部位是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，Ki67陽性部位是細(xì)胞核，以棕褐色為陽性。觀察切片中所有腫瘤組織的染色，在同一放大倍數(shù)(400倍)下隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞在同一視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞的比例，取平均值作為陽性率。Ki67的陽性率亦稱為增殖指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS 6.12進(jìn)行分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(SNK法行兩兩比較)，率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)分析應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，生存比較應(yīng)用K-M生存分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料的特征

結(jié)腸癌患者共55例。男28例，女27例，年齡33～84歲，中位年齡61歲；高分化21例，中分化28例，低分化6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；有脈管癌栓10例，無脈管癌栓45例?；颊呓Y(jié)腸癌及癌旁組織的病理學(xué)改變?nèi)鐖D2。

圖2 結(jié)腸癌病理組織學(xué)改變

2.2 結(jié)腸癌組織中miR-215-5p表達(dá)變化

與對(duì)照組相比，觀察組組織中miR-215-5p的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.54±0.53vs3.02±0.34,t=6.554,P<0.05)，見圖3。

圖3 結(jié)腸癌患者腸組織中miR-215-5p的表達(dá)(qPCR法) A. 擴(kuò)增曲線(qPCR法);B.結(jié)腸癌患者腸組織中miR-215-5p表達(dá)比較的柱狀圖

2.3 結(jié)腸癌不同臨床病理特征者miR-215-5p表達(dá)的比較

MiR-215-5p表達(dá)在不同腫瘤最大徑和浸潤深度組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 結(jié)腸癌不同臨床病理特征者miR-215-5p表達(dá)的比較

2.4 miR-215-5p表達(dá)的生存分析

術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行了5年隨訪，截止時(shí)間點(diǎn)為2020年1月31日。共生存25例，死亡26例，失訪4例。死亡患者術(shù)后生存時(shí)間為11～60個(gè)月，中位生存時(shí)間為45個(gè)月。K-M生存分析顯示，miR-215-5p的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)(臨界值為2.54，χ2=6.33，P=0.006)。見圖4、表2。

2.5 觀察組miR-215-5p與eIF2a、Ki67的相關(guān)性

免疫組化檢測(cè)eIF2a陽性率為15%～85%，平均56.3%，相關(guān)分析顯示，miR-215-5p與eIF2a呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.61，P=0.023)。Ki67陽性率為10%～95%，平均55.3%。相關(guān)分析顯示，miR-215-5p與Ki67呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.60，P=0.032)。見圖5。

圖5 觀察組miR-215-5p與eIF2a、Ki67的相關(guān)性

2.6 eIF2a mRNA的3′UTR是miR-215-5p的直接靶點(diǎn)

構(gòu)建含有野生型 mRNA 3′-UTR序列的pGL3-basic質(zhì)粒(pGL3-eIF2a-WT)和miR-215-5p結(jié)合位點(diǎn)缺失的突變型eIF2a mRNA 3′-UTR序列的質(zhì)粒(pGL3-eIF2a-MT)，分別與空載體轉(zhuǎn)染組、miR-215-5p轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-215-5p轉(zhuǎn)染組能引起轉(zhuǎn)染pGL3-eIF2a-WT的熒光素酶活性降低，而pGL3-eIF2a-MT的熒光素酶活性無明顯影響，即eIF2a mRNA的3′UTR是miR-215-5p的靶點(diǎn)。見圖6。

a P<0.05

2.7 miR-215-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系中eIF2a和Ki67表達(dá)的影響

應(yīng)用qPCR對(duì)各組細(xì)胞系中miR-215-5p的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)eIF2a和Ki67的表達(dá)，與空白對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組比較，miR-215-5p轉(zhuǎn)染組的eIF2a、Ki67表達(dá)下降，共轉(zhuǎn)染組能逆轉(zhuǎn)上述改變。見表3、圖7。

表3 不同組別細(xì)胞系中miR-215-5p和Ki67表達(dá)的比較

圖7 miR-215-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系中eIF2a和Ki67表達(dá)的影響

3 討 論

結(jié)腸癌臨床生物學(xué)進(jìn)展較為復(fù)雜，部分患者對(duì)治療的反應(yīng)性差。目前其發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制不清楚。進(jìn)一步探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移過程的機(jī)制[6]，尋找評(píng)價(jià)其進(jìn)展的生物學(xué)指標(biāo)，可能對(duì)尋找結(jié)腸癌治療的靶點(diǎn)有重要價(jià)值[7]。miRNAs的異常表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌的進(jìn)展有重要促進(jìn)作用[8]，其不同亞型作用可能不同[9]。EIF2a分子質(zhì)量為38 kDa[10]，由兩個(gè)相互移動(dòng)的結(jié)構(gòu)域組成，即N端為具有S1型寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊子(OB)結(jié)構(gòu)域和α螺旋結(jié)構(gòu)域，C端為α折疊結(jié)構(gòu)域[11-12]。α亞基為調(diào)節(jié)亞基和功能位點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。EIF2a可能是結(jié)腸癌形成和進(jìn)展時(shí)調(diào)控的關(guān)鍵因子，其常受控于多種上游的miRNA，活化后對(duì)下游多種信號(hào)起調(diào)控作用[13-14]。本研究應(yīng)用Ki67作為標(biāo)記增殖指標(biāo)的因子，效果理想，能客觀反映其所標(biāo)記細(xì)胞的特征。

本研究結(jié)果顯示，miR-215-5p在正常結(jié)腸黏膜中有一定的表達(dá)量，在結(jié)腸癌中的表達(dá)下降，提示miR-215-5p低表達(dá)是結(jié)腸癌形成的分子事件，miR-215-5p可能具有抑癌基因樣的作用。本研究miR-215-5p在不同腫瘤最大徑及浸潤深度組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-215-5p低表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲具有一定的促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)了miR-215-5p與eIF2a的靶向關(guān)系，提示二者具有通路作用，也證實(shí)了生物信息分析中二者結(jié)合位點(diǎn)的有效性。MiR-215-5p/eIF2a是結(jié)腸癌調(diào)控的關(guān)鍵分子[15]。本研究證實(shí)了此通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)結(jié)腸癌標(biāo)本的組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，miR-215-5p及Ki67與腫瘤最大徑的大小呈負(fù)相關(guān)，也提示了其對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。MiR-215-5p作為抑癌因子，miR-215-5p低表達(dá)預(yù)示著腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲作用及較高的臨床分期，也預(yù)示著較高的淋巴道轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[16]。MiR-215-5p對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控與對(duì)細(xì)胞周期的作用有關(guān)。有研究認(rèn)為，miR-215-5p可能對(duì)調(diào)節(jié)G0/G1期有一定作用，使腫瘤細(xì)胞增殖速度加快[17]。MiR-215-5p/eIF2a通路中，miR-215-5p可能是上游因子，調(diào)控eIF2a發(fā)揮細(xì)胞增殖的作用[18]。本研究證實(shí)了在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中eIF2a可能對(duì)Ki67起到了一定的調(diào)控作用，并認(rèn)為eIF2a是預(yù)測(cè)結(jié)腸癌惡性程度的重要指標(biāo)[19]。當(dāng)eIF2α被激活時(shí)，通過對(duì)Ki67標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞和相關(guān)蛋白的影響[20-21]，有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，但是其具體的作用途徑有待進(jìn)一步研究。miR-215-5p對(duì)幼稚上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可能有一定調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-215-5p的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)，提示檢測(cè)miR-215-5p的表達(dá)對(duì)判斷預(yù)后可能有幫助，即miR-215-5p低表達(dá)患者的預(yù)后差，但是miR-215-5p的臨界值尚需要進(jìn)行大檢本、多因素分析后明確。

總之，miR-215-5p靶向eIF2a負(fù)向調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，miR-215-5p低表達(dá)是腫瘤形成和進(jìn)展的重要事件，miR-215-5p的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)。基于miR-215-5p/eIF2a通路進(jìn)行多種生物學(xué)調(diào)控的研究有助于進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制。