Silvany Simone Sanches TAVARES，張淼，祝曉陽，顧寧

(東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009)

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。與傳統(tǒng)治療方法相比，胰島移植技術(shù)可以更好地模擬生理性的胰島素分泌，為患者提供了一種風(fēng)險較小且療效更好的替代療法[1-2]。目前由于缺乏有效、無創(chuàng)傷的胰島移植物監(jiān)測技術(shù)，移植物移植入體內(nèi)后難以在活體狀態(tài)下評價細(xì)胞的分布、增殖和遷移等，也導(dǎo)致了胰島移植效率及療效不理想等問題[3]，制約了胰島細(xì)胞用于移植治療糖尿病的臨床應(yīng)用。磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)因其高空間分辨率、多方位成像而成為理想的移植細(xì)胞活體示蹤手段。超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs) 是目前移植細(xì)胞示蹤較為理想的標(biāo)記物，尤其在干細(xì)胞移植領(lǐng)域的應(yīng)用表現(xiàn)突出[4]。其優(yōu)勢為粒徑小，弛豫率高，生物相容性和生物可降解性好，并且進入體內(nèi)后可被細(xì)胞代謝。通過對細(xì)胞進行磁標(biāo)記，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)成功地進行了腦和心臟等部位磁標(biāo)記干細(xì)胞的體外成像及活體示蹤[5]。近期對微囊化胰島β細(xì)胞移植的MRI示蹤也成為新的研究熱點[6]。另外研究發(fā)現(xiàn)，將SPIONs與正電荷轉(zhuǎn)染劑多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)結(jié)合，使納米粒子更容易穿越帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)，可以提高標(biāo)記率且使MR顯像更為敏感，并已證明其對細(xì)胞無毒性[7]。本課題組在生物醫(yī)用磁性納米材料的研究與應(yīng)用方面已有多年的深厚積累，自制的超順磁性氧化鐵納米粒子Ferumoxytol作為補鐵劑與磁共振造影劑，其生物安全性超越其他研究所使用的磁性納米顆粒[8]，并且Ferumoxytol也是目前唯一獲批可在臨床上單獨應(yīng)用的SPIONs。本研究以Ferumoxytol作為對照，研究PLL修飾的Ferumoxytol體外標(biāo)記小鼠胰島β細(xì)胞系MIN6的可行性，對細(xì)胞的標(biāo)記效率以及對細(xì)胞活力、增殖、胰島素合成與分泌功能等的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MIN6細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省人類功能基因組學(xué)重點實驗室提供，細(xì)胞用含20%牛血清(Gibco，南美)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma)，于37 ℃、5%CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，待到70%～80%融合后以1∶2方式傳代。

1.2 體外標(biāo)記MIN6細(xì)胞

將MIN6細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上，將制備的Ferumoxytol或PLL-Ferumoxytol分別以200、500和800 μg·ml-1的濃度加入培養(yǎng)基與細(xì)胞共孵育，分別培養(yǎng)24、48、72 h；同時設(shè)置正常培養(yǎng)組為對照。

1.3 細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性檢測

使用細(xì)胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)進行細(xì)胞增殖分析。將MIN6細(xì)胞接種到96孔板中，生長24 h后替換成含200、500和800 μg·ml-1的Ferumoxytol或PLL-Ferumoxytol的新鮮培養(yǎng)基，分別孵育24、48、72 h后，將培養(yǎng)板用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，添加10 μl CCK-8溶液后培養(yǎng)3 h，然后使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。為了進一步分析細(xì)胞活性，進行LIVE/DEAD染色，待細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%后，將其接種到24孔板中(每孔0.05×106個細(xì)胞)，在24 h的培養(yǎng)時間內(nèi)向培養(yǎng)基中加入不同濃度的納米顆粒，用PBS洗滌細(xì)胞，并按照LIVE/DEAD試劑盒指示進行染色操作。

1.4 肌動蛋白纖維及細(xì)胞核染色

當(dāng)融合達(dá)到70%～80%后，將細(xì)胞接種到96孔板中(每孔1.25×104個細(xì)胞)，與含有不同濃度Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol的新鮮培養(yǎng)基共孵育24 h。吸棄PBS，加入3.7%甲醛固定30 min。PBS沖洗3次后，加FITC-鬼筆環(huán)肽(Alexa Fluor 488)孵育30 min，吸棄后用PBS洗3次。其中 Hoechst 33342被用作核染色的復(fù)染色。

1.5 Perl的普魯士藍(lán)染色法

將細(xì)胞接種到24孔板中(每孔5×104個細(xì)胞)，與納米顆粒(PLL-Ferumoxytol或Ferumoxytol)共培養(yǎng)24 h。24 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌，并用4%甲醛固定。使用普魯士藍(lán)染色液進行染色測定以確定IONP的存在，最后觀察細(xì)胞并使用顯微鏡(TS100/TS100-F,Nikon Co. Ltd.,日本) 進行成像。

1.6 透射電鏡(TEM)觀察

使用TEM觀察MIN6細(xì)胞內(nèi)部氧化鐵納米顆粒的存在。 MIN6細(xì)胞分別與Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol在200、500和800 μg·ml-1濃度下共培養(yǎng)24 h。PBS洗3次后，使用2.5%的戊二醛溶液在4 ℃環(huán)境下固定過夜。重復(fù)脫水后，將樣品與環(huán)氧乙烷和環(huán)氧樹脂共培養(yǎng)過夜，并用新鮮的環(huán)氧樹脂滲透3次。用超薄切片機切片，通過醋酸鈾水溶液和檸檬酸鉛溶液進行雙染色，用FEI Tecnai F30顯微鏡觀察細(xì)胞并對其成像。

1.7 葡萄糖刺激下的胰島素分泌試驗(GSIS)

將細(xì)胞與不同濃度的Ferumoxytol和PLL-Feru-moxytol分別共孵育24、48、72 h后，接種到48孔板中(每孔1.25×104個細(xì)胞)。將細(xì)胞置于含2 mmol·L-1葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(KRBH：125 mmol·L-1NaCl、1.2 mmol·L-1MgSO4、1.2 mmol·L-1CaCl2、22 mmol·L-1NaHCO3、10 mmol·L-1HEPES、1.19 mmol·L-1KH2PO4)溶液中1 h，然后換成含20 mmol·L-1葡萄糖的KRBH 溶液中反應(yīng)1 h。分別收取上清液，用ELISA試劑盒測定其中胰島素濃度，以檢測細(xì)胞的胰島素分泌功能。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進行分析，兩組間比較采用雙因素方差分析，多組間比較采用Dunnett-t檢驗法。P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MIN6細(xì)胞形態(tài)評估

使用相差顯微鏡評估納米顆粒存在情況下的細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果(圖1)顯示，與Ferumoxytol或PLL-Ferumoxytol共培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。為了更好地了解納米顆粒對MIN6細(xì)胞形態(tài)的影響，我們單獨測試了不同濃度PLL的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)較高濃度(19 μg·ml-1)的PLL對細(xì)胞具有明顯毒性。

圖1 MIN6細(xì)胞形貌表征 對照組、800 μg·ml-1 Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol標(biāo)記MIN6細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài)

2.2 細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力檢測結(jié)果

將細(xì)胞暴露于不同濃度(200、500和800 μg·ml-1)的Ferumoxytol中，通過CCK-8法和LIVE/DEAD細(xì)胞染色測定法檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，與Ferumoxytol、PLL-Ferumoxytol共孵育24、48、72 h后，對細(xì)胞增殖沒有顯著影響(圖2)。并且LIVE/DEAD染色結(jié)果(圖3)顯示，對照組與實驗組(Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol組)細(xì)胞均保持了較高的活性，而純PLL(濃度分別為2、11、19 μg·ml-1)則會抑制細(xì)胞增殖和生存。因此，我們認(rèn)為本研究中使用的Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol具有良好的生物相容性。

圖2 MIN6細(xì)胞增殖檢測 CCK-8法檢測與納米粒子共孵育24、48、72 h后對MIN6細(xì)胞增殖的影響。n=9，細(xì)胞與200 μg·ml-1 PLL-Ferumoxytol共孵育24 h后，細(xì)胞增殖率高于對照組(a P<0.05)

圖3 MIN6細(xì)胞活性表征 與Ferumoxytol、PLL-Ferumoxytol(800 μg·ml-1)共培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞活性分析，染綠色為活細(xì)胞，染紅色為死細(xì)胞(標(biāo)尺：50 μm)

2.3 F-肌動蛋白絲和細(xì)胞核染色

與對照組相比，納米顆粒處理的細(xì)胞進行鬼筆環(huán)肽染色后，未顯示出其F-肌動蛋白細(xì)胞骨架特性具有顯著差異。因此我們認(rèn)為，納米顆?？梢员Ｗo并幫助維持MIN6細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。用Hoechst 33342染色法觀察納米顆粒處理后細(xì)胞的核形態(tài)變化和核濃縮，結(jié)果(圖4)顯示，核呈圓形，無核濃縮，表明沒有凋亡細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞攝取和普魯士藍(lán)染色

將MIN6細(xì)胞與Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol(濃度分別為200、500、800 μg·ml-1)共孵育24 h，對細(xì)胞進行普魯士藍(lán)染色(圖5A)檢驗細(xì)胞的鐵攝取。結(jié)果顯示，與PLL-Ferumoxytol共培養(yǎng)的細(xì)胞被染成藍(lán)色，而與Ferumoxytol共培養(yǎng)的細(xì)胞則沒有表現(xiàn)出對鐵納米粒子的攝取，說明僅與Ferumoxytol共孵育24 h不足以標(biāo)記細(xì)胞。此外，TEM觀察結(jié)果證實，MIN6細(xì)胞內(nèi)部存在氧化鐵納米顆粒。 在不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中都能發(fā)現(xiàn)納米顆粒，主要在溶酶體中觀察到較多納米顆粒，其余能夠觀察到納米顆粒附著在細(xì)胞膜上或被困在細(xì)胞之間(圖5B、C、D)。

圖5 普魯士藍(lán)染色及TEM表征 將MIN6細(xì)胞分別與Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol(800 μg·ml-1)在24孔中共培養(yǎng)24 h，然后用Perl的普魯士藍(lán)染色法進行染色 (標(biāo)尺：50 μm),孵育24 h后，MIN6細(xì)胞的TEM圖像(A)；箭頭指向含有納米顆粒的溶酶體(B)、胰島素囊泡(C)及附著在細(xì)胞膜和溶酶體上的納米顆粒(D)(標(biāo)尺：0.5 μm)

2.5 GSIS結(jié)果分析

分別培養(yǎng)24、48、72 h后，通過在低糖基礎(chǔ)條件(2 mmol·L-1)和高糖刺激條件(20 mmol·L-1)下培養(yǎng)樣品，研究響應(yīng)葡萄糖刺激的MIN6細(xì)胞胰島素分泌。結(jié)果表明，在刺激性高濃度葡萄糖條件下，與200 μg·ml-1PLL-Ferumoxytol共培養(yǎng)的細(xì)胞釋放的胰島素量顯著增加(P<0.05，圖6A)。并且涂覆PLL和未涂覆PLL的納米顆粒處理的細(xì)胞之間胰島素合成量沒有顯著差異(圖6B)。上述結(jié)果表明，與納米顆粒共培養(yǎng)后，MIN6細(xì)胞仍然對葡萄糖具有響應(yīng)性。

圖6 GSIS及合成量檢測 分別與200、500、800 μg·ml-1 Ferumoxytol和PLL-Ferumoxytol共孵育24、48、72 h 后，對MIN6細(xì)胞進行GSIS和胰島素抽提實驗，低糖及高糖處理組胰島素分泌量(A)及胰島素合成量(B)比較(n=9)，高糖(20 mmol·L-1)處理組胰島素分泌量高于低糖(2 mmol·L-1)處理組(a P<0.05；b P<0.01)

3 討 論

目前，糖尿病的傳統(tǒng)治療方案主要為終身注射胰島素以及服用口服降糖藥物，但是由于血糖水平難以控制，胰島素劑量或者藥物使用不當(dāng)，不能完全達(dá)到理想的治療效果[9]。胰島移植技術(shù)為患者提供了一種風(fēng)險較小且療效更好的替代療法。對移植物進行有效、無創(chuàng)的活體示蹤是胰島移植成功的保障。在胰島中，胰島β細(xì)胞是已知的產(chǎn)生胰島素的唯一內(nèi)分泌細(xì)胞，胰島β細(xì)胞功能障礙甚至被認(rèn)為是糖尿病發(fā)生的根本原因[10]。因此，本研究中我們將MIN6細(xì)胞與Ferumoxytol納米顆粒共培養(yǎng)，然后評估納米顆粒與細(xì)胞之間的相互作用，并對細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PLL作為轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)并增強了PLL-Ferumoxytol對MIN6細(xì)胞的標(biāo)記效率。實驗結(jié)果表明，PLL-Ferumoxytol具有良好的生物相容性。通常，納米顆粒在不同類型細(xì)胞中的內(nèi)化具有時間依賴性，并且達(dá)到最大飽和點時攝取會趨于平穩(wěn)，進行納米顆粒攝取后細(xì)胞的活力預(yù)計也會隨著時間而降低[11]。已有研究說明SPIO標(biāo)記對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的功能作用，并表明帶有或不帶有TA的SPIO標(biāo)記不會顯著影響充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的分化或活性[12]。

肌動蛋白的細(xì)胞骨架是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，會根據(jù)響應(yīng)信號的變化而被重塑。在胰島β細(xì)胞中，F(xiàn)-肌動蛋白排列為質(zhì)膜下的致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)葡萄糖刺激胰島素分泌后，其迅速解聚[13]。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中的F-肌動蛋白絲是調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞形態(tài)完整性的必要因素，因此，任何結(jié)構(gòu)上的破壞都可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的改變。基因芯片分析顯示，人類原代成纖維細(xì)胞暴露于氧化鐵納米顆粒48 h后，可以上調(diào)與肌動蛋白重塑相關(guān)基因的表達(dá)[14]。此外，氧化鐵納米顆粒也被報道可以促進細(xì)胞信號相關(guān)基因(包括整聯(lián)蛋白亞基、酪氨酸激酶和蛋白激酶C家族成員)的表達(dá)增加，表明氧化鐵納米顆粒也可以影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]。與對照組相比，將氧化鐵納米顆粒處理的細(xì)胞F-肌動蛋白絲染色后，其F-肌動蛋白細(xì)胞骨架沒有顯著差異。但是，PLL會對細(xì)胞相互作用有關(guān)的基因下調(diào)產(chǎn)生某些影響，從而影響細(xì)胞的運動，因此必須對顯著增加的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白進行定量以確定其基質(zhì)的重組。

用不同濃度的納米顆粒處理細(xì)胞后，細(xì)胞對PLL-Ferumoxytol內(nèi)吞表明納米顆粒可能與分泌胰島素的囊泡有一些相互作用。典型的普魯士藍(lán)染色能夠證明鐵在β細(xì)胞以及其他類型細(xì)胞中的堆積，鐵的吸收主要與幾種類型細(xì)胞的內(nèi)吞作用有關(guān)。最近有文獻(xiàn)報道，商業(yè)化的Resovist(羧基葡聚糖包被的SPION)處理胰島細(xì)胞可以作為MRI造影劑。納米粒子標(biāo)記對MIN6細(xì)胞的胰島素合成與分泌功能無顯著影響，證明了其良好的生物安全性[16]。鐵的超負(fù)荷可能影響胰島素的分泌，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)的表達(dá)水平對促進葡萄糖擴散很重要[13]。攝取鐵氧化物納米顆粒的主要機制是內(nèi)吞作用，而胰島素則通過胞吐作用分泌[17]，因此可以猜測胰島素分泌也可能會受納米顆粒的代謝與胰島素囊泡之間的相互作用影響，這需要進一步進行研究。

SPIONs作為較為理想的細(xì)胞磁標(biāo)記物，在對移植物的移植后活體示蹤領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究中將PLL與Ferumoxytol結(jié)合，制備的PLL-Ferumoxytol具有良好的生物相容性及生物安全性，對于MIN6細(xì)胞的形貌、活性、增殖和胰島素合成與分泌功能沒有顯著影響，并且相較單純的Ferumoxytol具有更高的細(xì)胞標(biāo)記率。