董 睿 朱 瓊 馮 爽 朱賢勝 高順記 劉 政

深靜脈血栓形成是一種常見的外周血管血栓性疾病，血栓脫落可引起肺動脈栓塞、腦梗死等嚴重并發(fā)癥。下肢深靜脈血栓即使接受規(guī)范的抗凝治療，仍有30%～50%患者發(fā)展為血栓后綜合征，出現患肢腫脹、靜脈性跛行等［1］。超聲溶栓是超聲空化治療技術的應用之一，其通過超聲發(fā)射產生的空化效應增強藥物溶栓的療效［2-4］。研究［5-6］顯示微泡作為一種有效的空化核，可增強誘導超聲空化效應，提高超聲溶栓效果。EKOS?超聲導管是一種經血管腔內的新型超聲溶栓方法，在不聯合微泡的情況下，該超聲導管應用于臨床治療肺動脈栓塞和靜脈血栓等已取得肯定的效果［7-8］。本實驗通過經EKOS?超聲導管血栓內注射微泡和尿激酶進行體外溶栓，旨在探討EKOS?超聲導管聯合血栓內注射微泡增強尿激酶體外溶栓治療效果。

材料與方法

一、主要實驗試劑與儀器

1.實驗試劑：無菌抗凝新生牛血、無水氯化鈣、4%組織細胞固定液（北京索萊寶科技有限公司）；牛血漿（鄭州九龍生物制品有限公司）；注射用尿激酶（麗珠集團麗珠制藥廠）；注射用全氟丁烷微球（1.2×109/ml，Sonazoid?，GE 醫(yī)療，挪威）；PBS 緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）。

2. 儀器：EKOS?超聲導管系統(tǒng)（MACH4，美國EKOS 公司），配備多側孔給藥鞘管、多陣元超聲發(fā)射軸芯和EkoSonic 控制單元，其軸芯在治療區(qū)有12個微型超聲換能器，發(fā)射頻率2.2 MHz。針式水聽器（HNC-0400，美國ONDA 公司）；微量蠕動泵（BT-100E，重慶杰恒蠕動泵有限公司）；恒溫水浴箱（德國HUBER公司）；雙通道微量輸液泵（上海藍德醫(yī)療機械有限公司）；電子天平（UTP-313，上海花潮電器有限公司）；熒光顯微鏡（BX3-CBH，日本OLYMPUS公司）。

3.體外循環(huán)裝置：由微量蠕動泵和自制模擬體循環(huán)的管道組成，在管道的入口處以三通管連接另一管道入口用于插入EKOS?超聲導管，血栓樣品池兩端設有管道以模擬人體血栓形成時開放的側支循環(huán)，置整個循環(huán)管道于37℃恒溫水浴箱中。見圖1。循環(huán)液為含10%牛血漿的PBS液，蠕動泵以60 r/min工作。

二、實驗方法

1.EKOS?超聲導管聲學參數測量：應用HNC-0400針式水聽器（靈敏度為1.228×10-7），分別于換能器晶片距水聽器1、2、3、4、5 mm處，測量峰值負壓并記錄。

圖1 體外溶栓實驗循環(huán)裝置示意圖

2.血栓制備：取無菌抗凝新生牛血制備血栓90份，每份8 ml，置于預先加入5%氯化鈣溶液（33 μl/ml）的圓底EP管中，于37℃恒溫水浴箱中溫育3 h后取出，去除血清，PBS 液沖洗3 次，濾紙吸干血栓表面液體后應用電子天平稱量血栓的初始質量（W0）。

3.實驗分組及步驟：采用Excel隨機數字表法將前期制備的90份同質血栓樣本隨機分為6組，每組15份，分別為：超聲+微泡+尿激酶聯合組（聯合組）、超聲+尿激酶組（US+UK 組）、超聲+微泡組（US+MB 組）、超聲組（US 組）、尿激酶組（UK 組）和對照組。各實驗組血栓栓齡相同，具有可比性。

將10 萬U 尿激酶和/或0.02 ml Sonazoid?造影劑以0.9%無菌生理鹽水稀釋至5.0 ml（微泡濃度為4.8×106/ml），并全部吸入微量輸液泵Ⅰ通道的注射器中，然后與EKOS?超聲導管的Drug端口連接；輸液泵Ⅱ通道放置充滿50.0 ml 0.9%無菌生理鹽水的注射器，并以100 ml/h 的速度向EKOS?超聲導管的Coolant 端口注入，以擴散超聲傳感器產生的熱能。聯合組采用經EKOS?超聲導管勻速（10 ml/h）向血栓內注入10 萬U尿激酶和0.02 ml Sonazoid?造影劑稀釋液；US+UK 組和UK 組以同樣方法注入10 萬U 尿激酶稀釋液；US+MB 組注入0.02 ml Sonazoid?造影劑稀釋液；US 組和對照組注入5.0 ml無菌生理鹽水。同時根據分組情況，對聯合組、US+UK 組、US+MB 組和US組采用經EKOS?超聲導管進行超聲輻照，UK 組和對照組不予超聲輻照，各組處理時間均為30 min。然后取出血栓，以PBS液沖洗3次，用濾紙吸干血栓表面液體，再次應用電子天平稱量血栓質量（Wt）。

三、評價和觀測指標

計算各組血栓溶栓率，公式為：溶栓率=（W0-W1）/W0×100%。將溶栓處理后血栓置于4%組織細胞固定液中固定，制成石蠟切片，并進行HE 染色。于熒光顯微鏡下觀察各組血栓中紅細胞和纖維蛋白的分布情況。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、EKOS?超聲導管聲學參數測量結果

導管換能器占空比為24.86%，峰值負壓范圍為0.4～6.4 MPa，呈無規(guī)律動態(tài)變化。

二、各組血栓樣本W0和溶栓率比較

各組血栓樣本W0、溶栓率比較情況見表1和圖2。各組血栓樣本W0比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=10.033，P=0.074）。聯合組溶栓率與US+UK 組溶栓率相近，均顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。US+MB 組溶栓率與UK 組溶栓率相近，均高于US組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 各組溶栓前后血栓質量和溶栓率比較

圖2 各組溶栓率比較柱狀圖和散點圖

三、組織學表現

光鏡觀察結果顯示，聯合組和US+UK組與EKOS?超聲導管接觸處的血栓可見較多崩解，紅細胞分布較其余各組更稀疏；UK 組血栓可見少量溶解灶，紅細胞分布較稀疏；余各組血栓仍較致密，未見明顯血栓溶解區(qū)。見圖3。

討 論

近年來，超聲溶栓已成為治療深靜脈血栓的一種新方法。超聲波作為一種機械波，一方面可以機械性地破壞血栓，同時也可以激勵空化核產生空化效應，其釋放的聲輻射、微射流、沖擊波等機械能量進一步使血栓裂解，產生更多的孔隙，利于溶栓藥物的滲透，進而提高溶栓效率［2，9］。微泡作為一種有效的空化核，是誘導超聲空化效應的關鍵，可顯著降低發(fā)生空化效應的聲壓閾值［10］。研究［11-13］結果表明在適合微泡空化的條件下，超聲聯合微泡可顯著提高溶栓效果。EKOS?超聲導管結合了導管介入溶栓和高頻超聲，可通過超聲能量使纖維蛋白鏈可逆性分解，允許更多地暴露血栓內纖溶酶原受體位點，同時經多側孔超聲導管使溶栓藥物直接作用于血栓內部，使血栓局部藥物濃度增高，作用增強，從而減少了溶栓藥物的用量和治療時間［14-15］。該導管系統(tǒng)的換能器發(fā)射頻率為2.2 MHz。研究［16］表明2.2 MHz 的超聲頻率與載尿激酶的微泡聯合使用可產生最優(yōu)的再通率，部分原因可能是超聲頻率與微泡的振動頻率相似，可引起微泡諧振產生最佳的溶栓效果。本實驗應用EKOS?超聲導管聯合血栓內注射微泡和尿激酶的方法，對體外牛血血栓進行溶栓實驗，旨在探討EKOS?超聲導管聯合微泡增強尿激酶溶栓效果。

圖3 各組治療后血栓病理圖（HE染色）

本實驗結果顯示，US+UK 組的溶栓率為（42.0±3.3）%，高于UK 組的溶栓率（27.8±3.1）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明EKOS?超聲導管產生的空化效應和機械效應有助于血栓溶解，并與HE 染色光鏡觀察結果相符。US+MB 組的溶栓率為（28.4±3.3）%，高于US 組的溶栓率（23.9±3.0）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但聯合組的溶栓率（41.9±4.5）%與US+UK組的溶栓率相近，表明在超聲和尿激酶兩者作用的基礎上，微泡的加入并未進一步提高溶栓率。分析其原因，一方面可能是由于EKOS?超聲導管的頻率為2.2 MHz，聲壓在0.4～6.4 MPa，呈無規(guī)律動態(tài)變化，高聲壓的超聲能量瞬間擊破微泡，產生粒徑更小的空化核，而2.2 MHz 的頻率不能與該小粒徑的微泡產生較好的諧振，從而削弱了超聲空化效應；加之血栓較致密，微泡在導管側孔兩側不能及時彌散，導致微泡大量堆積形成微泡層，阻擋了超聲能量的穿透，從而導致溶栓效率有限。另一方面，在未應用尿激酶時，微泡介導的超聲溶栓率較單純的超聲溶栓率有所提高，應用尿激酶后，超聲和尿激酶兩者聯合作用產生的溶栓效果已經很顯著，EKOS?超聲導管激勵微泡增加的有限的溶栓效果可能被超聲聯合尿激酶產生的溶栓效果掩蓋，故聯合組的溶栓率較US+UK 組無明顯變化。此外，有研究［17］發(fā)現，在微泡介入的情況下，由于微射流、自由基生成、聲流和剪切應力的增加，致使酶失活、變性或斷裂，最終導致溶栓藥物的活性降低。本實驗采用的EKOS?超聲導管其聲壓最大可達6.4 MPa，誘導產生劇烈的瞬態(tài)空化，也有可能使尿激酶活性下降。本實驗US+MB組的溶栓率與UK組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明超聲聯合微泡溶栓與單純使用尿激酶溶栓具有相似的溶栓效果。

本實驗的局限：作為EKOS?超聲導管聯合微泡和尿激酶進行溶栓實驗的初步研究，本實驗在體外采用抗凝牛血人工誘導形成的新鮮血栓上進行，未能在動物實驗中進一步驗證其有效性。此外，本實驗未說明因延長血栓形成時間及延長或縮短治療時間而導致的血栓質量減少的差異，有待后續(xù)進一步完善。

綜上所述，EKOS?超聲導管可明顯增強尿激酶的體外溶栓效果，但在此基礎上，增加微泡對溶栓率的提高并不明顯。結合對EKOS?超聲導管的聲學參數測量可發(fā)現該導管的設計制作并不利于微泡發(fā)生空化效應，但EKOS?超聲導管聯合尿激酶是治療深靜脈血栓形成的一種很有前途的方法。