王軼博，符曉芳，袁 麗，張 婷，辛婷婷

（北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京 100048）

楊梅素（3,5,7,3’,4’,5’-六羥基黃酮，圖1a）是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于茶、水果、草藥等中[1]。作為一種多羥基黃酮，楊梅素具有良好的抗氧化性[2]、消除體內(nèi)自由基等特性，以及降血糖、抗炎、抗腫瘤[3-6]等生物學(xué)活性。這些性質(zhì)除對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域意義重大外，在食品工業(yè)方面也十分重要，可作為食品抗氧化劑和功能補充劑。利用楊梅素的抗氧化特性，可以避免果蔬在貯存過程中，其結(jié)構(gòu)中的酚類物質(zhì)被氧化成黑色素而影響果蔬的外觀及營養(yǎng)、縮短果蔬的貨架期。因此可將其用作良好的果蔬保鮮和防腐劑。由于楊梅素具有較低的水溶性（溶解度為16.60 μg/mL）[7]，阻礙了其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。通過合適的載體包裹提高溶解性及利用度是常用的解決方法。

圖1 楊梅素（a）及β-環(huán)糊精（b）結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of myricetin (a) and β-cyclodextrin (b)

環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵結(jié)合成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，狀似中空圓臺。環(huán)糊精分子外側(cè)親水而內(nèi)側(cè)疏水[8]，利用環(huán)糊精這種性質(zhì)，將疏水分子通過非共價作用包合[9]，可以改變被包合物的水溶性及穩(wěn)定性[10-11]，拓展被包合物的實際應(yīng)用。根據(jù)吡喃葡萄糖單元個數(shù)的不同，環(huán)糊精分為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精（圖1b）和γ-環(huán)糊精。β-環(huán)糊精相較α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精而言，空腔尺寸適中，易形成包合物而被廣泛研究[12]，但β-環(huán)糊精自身的空腔疏水性也限制了其應(yīng)用[13]。β-環(huán)糊精衍生物，如羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-βcyclodextrin，HP-β-CD）和葡萄糖基-β-環(huán)糊精（glucoseβ-cyclodextrin，G-β-CD）等，通過引入修飾基團可以提高環(huán)糊精的水溶性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[14]。

目前，研究人員通常以環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物為主體，楊梅素為客體，制備包合物并通過理論計算或?qū)嶒灧治鲅芯堪衔锏男阅躘9,15-18]。Chakraborty等[9]通過分子模型和量子化學(xué)計算，探索了楊梅素在β-CD空腔中的結(jié)構(gòu)和能量，從理論上分析了楊梅素與β-CD抗氧化性較好的原因。Yao Yashu等[15]制備了楊梅素/HP-β-CD，通過研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)楊梅素/HP-β-CD的生物利用度比游離的楊梅素提高了9.4 倍，因而在生物醫(yī)藥方面有極大的應(yīng)用前景。Cho等[19]則用β-CD二聚物為主體，制備了3 種黃酮類化合物（楊梅素、槲皮素和山柰酚）的包合物。溶解性研究表明，制備出的系列包合物的溶解性相對于游離的黃酮類客體都有不同程度的提高，而楊梅素的溶解性增強了33.6 倍，比槲皮素的12.4 倍和山柰酚的10.5 倍都高。文獻報道中HP-β-CD是使用最多的包合物主體，而G-β-CD則在包合物的制備過程中使用極少。相比HP-β-CD的大量研究，目前國內(nèi)外對G-β-CD的研究較少。與β-CD相比，G-β-CD具有更好的親水性和水溶性，而且具有較好的安全性、乳化性和抗回生作用，同時還可以改善食品的質(zhì)構(gòu)、彈性、咀嚼性等，因而在食品領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值[20]。

本研究目的是改善楊梅素的水溶性，選擇具有更好安全性、水溶性和親水性的G-β-CD為主體，通過冷凍-干燥法制備出楊梅素/G-β-CD包合物，并通過相溶解度法、紅外光譜分析、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）與熱重（thermogravimetry，TG）等手段分析主客體相互作用，并進一步考察楊梅素/G-β-CD包合物的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅素（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；G-β-CD 北京百靈威科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；三氯乙酸、K3Fe(CN)6、FeCl3上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D/MAX2500V/PC XRD儀 德國布魯克公司；Nicolet FT-IR-R330分光光度計 美國賽默飛公司；N-1100V-W(WD)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會社；DTG-60AH 日本島津公司；TESCAN VEGA II SEM儀 捷克Tescan公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅素/G-β-CD包合物的制備

將楊梅素（0.6 mmol/L，190 mg）溶于40 mL乙醇溶液中，389 mg 0.3 mmol/L G-β-CD溶于160 mL去離子水中，再將楊梅素-乙醇溶液緩慢滴加到G-β-CD溶液中，30 ℃磁力攪拌3 d，旋蒸除去有機溶劑后用0.45 μm的濾膜過濾，濾液冷凍干燥即可得到楊梅素/G-β-CD包合物。

1.3.2 楊梅素與G-β-CD的物理混合物

楊梅素與G-β-CD按照物質(zhì)的量比1∶1稱量，于研缽中充分研磨混合均勻，得到楊梅素與G-β-CD的物理混合物。

1.3.3 相溶解度的測定

配制0.01～0.03 mmol/L濃度范圍（梯度間隔為0.005 mmol/L）的系列標(biāo)準(zhǔn)楊梅素乙醇溶液，檢測其在378 nm波長處的吸光度，繪制楊梅素濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝24.824x-0.000 9，R2＝0.994 9，線性相關(guān)性好。配制10 mL不同濃度（0.00～0.01 mol/L）的一系列G-β-CD溶液，分別加入10 mg楊梅素，25 ℃恒溫水浴條件下以120 r/min振蕩48 h，用0.45 μm的濾膜過濾除去不溶物。測定濾液中楊梅素的吸光度后，根據(jù)濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得濾液中楊梅素的含量。以G-β-CD濃度為橫坐標(biāo)，繪制楊梅素的相溶解度曲線，并根據(jù)式（1）[21]計算包合物的締合常數(shù)Ks。

式中：Slope為楊梅素相溶解度曲線的斜率；S0為G-β-CD濃度為0時的楊梅素溶解度。

1.3.4 抗氧化性檢測

1.3.4.1 還原能力的測定

將磷酸二氫鹽緩沖溶液（pH 6.6，0.2 mmol/L，2.0 mL）與K3Fe(CN)6溶液（1h10-2g/mL，2.0 mL）混合均勻后分別加入不同濃度的楊梅素/G-β-CD包合物溶液，50 ℃保溫20 min后迅速冷卻，再加入2.0 mL 0.1 g/mL三氯乙酸溶液。靜置待分層后取上層清液，加入2.0 mL去離子水和0.4 mL 1h10-3g/mL的FeCl3溶液。充分反應(yīng)后，測定樣品在700 nm波長處的吸光度。不同濃度楊梅素溶液還原能力的測定處理相同。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的測定

避光的條件下，將DPPH的乙醇溶液（0.1 mmol/L，2.0 mL）分別與不同濃度的楊梅素/G-β-CD包合物樣品溶液混合均勻，于（30f1）℃保持60 min，檢測517 nm波長處樣品的吸光度。楊梅素溶液的DPPH自由基清除能力的測定方法與此一致。根據(jù)式（2）計算DPPH自由基清除能力[13]：

式中：A0表示DPPH溶液和樣品溶劑的吸光度，Ai表示DPPH溶液和樣品溶液的吸光度，Aj表示樣品溶液和乙醇溶液的吸光度。

1.3.5 紅外光譜分析

采用Nicolet FT-IR-R330紅外光譜儀的KBr壓片法，測定楊梅素、G-β-CD、楊梅素與G-β-CD以及楊梅素/G-β-CD包合物紅外數(shù)據(jù)。測定前，需將以上4 種樣品分別與光譜級KBr混合并充分研磨，再壓制成片放到紅外光路中。用OMNIC操作系統(tǒng)測定紅外光譜，掃描范圍為4 000～650 cm-1。

1.3.6 XRD分析

利用D/MAX2500V/PC XRD儀在室溫下得到楊梅素、G-β-CD、楊梅素與G-β-CD以及楊梅素/G-β-CD包合物的XRD圖譜。測試時采用Cu-K（α）射線照射待測樣品，波長1.540 56 ?，電壓40 kV，電流40 mA，以4 °/min的掃描速率在2θ為5°～50°的范圍掃描。

1.3.7 SEM分析

通過TESCAN VEGA II SEM觀察楊梅素、G-β-CD、楊梅素與G-β-CD以及楊梅素/G-β-CD包合物的形貌。將一小塊雙面膠帶固定在鋁短管上，將研磨后的4 種樣品粉末均勻涂在短管表面，之后放入噴金儀中使待測樣品具有導(dǎo)電性，最后用SEM觀察樣品形貌。

1.3.8 熱穩(wěn)定性分析

楊梅素、G-β-CD、楊梅素與G-β-CD以及楊梅素/G-β-CD包合物的熱穩(wěn)定性通過DTG-60AH儀器分析。托盤一側(cè)放置裝有樣品的密封鋁制小鍋中，另一側(cè)是同樣密封的空鍋作為參照。在70 mL/min流動氮氣的氛圍下，以10 ℃/min的速率將樣品從50 ℃加熱到500 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用SPSS程序軟件進行分析。實驗使用單因素方差分析，用Tukey測試的置信區(qū)間分析3 組平行組之間的差異。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 相溶解度

相溶解度是測定環(huán)糊精包合物對客體分子溶解度影響作用的常用方法。締合常數(shù)體現(xiàn)主體和客體之間的鍵合強度，利用相溶解度法計算出的締合常數(shù)越高，包合物越穩(wěn)定[22]。由圖2可知，楊梅素/G-β-CD包合物在水中的溶解度隨著G-β-CD濃度的增加而增加，且表現(xiàn)出較好的線性相關(guān)性（R＝0.982 8）。相溶解度曲線呈AL型，表明G-β-CD與楊梅素在實驗條件下形成了物質(zhì)的量比為1∶1的包合物[23]。通過計算得出締合常數(shù)為8 594 L/mol，可知包合物的穩(wěn)定性較好。同時，當(dāng)G-β-CD濃度增大到10 mmol/L時，楊梅素的溶解度相比未加G-β-CD時增大了70.24 倍，說明楊梅素經(jīng)過G-β-CD的包合，水溶性得到了顯著提高。

圖2 楊梅素/G-β-CD的相溶解度曲線Fig. 2 Phase-solubility diagram of myricetin/G-β-CD complex

2.2 紅外光譜分析

圖3 楊梅素（a）、G-β-CD（b）、楊梅素與G-β-CD物理混合物（c）、楊梅素/G-β-CD包合物（d）紅外光譜圖Fig. 3 IR spectra of myricetin (a), G-β-CD (b), physical mixture of myricetin and G-β-CD (c), and myricetin/G-β-CD inclusion complex (d)

測定4 000～750 cm-1范圍內(nèi)楊梅素、G-β-CD、楊梅素與G-β-CD物理混合物、楊梅素/G-β-CD包合物的紅外光譜如圖3。楊梅素在3 383 cm-1處出現(xiàn)羥基的特征峰，1 662 cm-1出現(xiàn)羰基的特征峰，1 614、1 585、1 513、1 448 cm-1處是苯環(huán)骨架振動產(chǎn)生的峰（圖3a）；G-β-CD在3 344 cm-1出現(xiàn)羥基伸縮振動峰，2 929 cm-1出現(xiàn)CüH的伸縮振動峰，1 159、1 104、1 024 cm-1是CüH、CüO的伸縮振動（圖3b）；楊梅素與G-β-CD物理混合物的紅外譜圖（圖3c）與楊梅素和G-β-CD的紅外譜圖明顯不同，既包含羥基的吸收峰，又有羰基、苯環(huán)骨架的振動峰，是二者簡單結(jié)合而并未發(fā)生包合作用；楊梅素/G-β-CD包合物（圖3d）與楊梅素的紅外吸收峰明顯不同，沒有楊梅素的500～1 500 cm-1之間的一些小的特征峰，圖譜整體更接近G-β-CD，但包合物的羥基吸收峰明顯變寬，表明羥基的數(shù)量增加，該結(jié)果表明楊梅素進入G-β-CD腔體內(nèi)，并形成包合物。

2.3 XRD分析

圖4 楊梅素（a）、G-β-CD（b）、楊梅素與G-β-CD物理混合物（c）、楊梅素/G-β-CD包合物（d）XRD圖Fig. 4 XRD diagrams of myricetin (a), G-β-CD (b), physical mixture of myricetin G-β-CD (c), and myricetin/G-β-CD inclusion complex (d)

XRD可以表征楊梅素/G-β-CD包合物中主體G-β-CD、客體楊梅素之間的相互作用。楊梅素具有明顯的晶型結(jié)構(gòu)（圖4a）；G-β-CD有2 個明顯的寬峰，為無定型結(jié)構(gòu)（圖4b）；楊梅素與G-β-CD物理混合物的XRD圖顯示只是主客體簡單的混合疊加[24]，表明兩者之間沒有產(chǎn)生化學(xué)鍵合（圖4c）；楊梅素/G-β-CD包合物中，楊梅素的晶型結(jié)構(gòu)消失而出現(xiàn)無定型結(jié)構(gòu)（圖4d），表明主客體間通過化學(xué)作用成功制備出包合物[25]。

2.4 SEM分析

由圖5可以看出，楊梅素的形貌呈條狀；G-β-CD呈非晶球狀；楊梅素與G-β-CD物理混合物中既有條狀結(jié)構(gòu)也有球狀結(jié)構(gòu)，且分離明顯，表明物理混合物二者的物理形貌未發(fā)生變化；楊梅素/G-β-CD包合物則出現(xiàn)了稍長的非晶柱狀，與主客體的形貌都不同，表明已形成了楊梅素/G-β-CD的包合物。

圖5 楊梅素（a）、G-β-CD（b）、楊梅素與G-β-CD物理混合物（c）、楊梅素/G-β-CD包合物（d）SEM圖Fig. 5 SEM photos of myricetin (a), G-β-CD (b), physical mixture of myricetin and G-β-CD (c), and myricetin/G-β-CD inclusion complex (d)

2.5 熱穩(wěn)定性分析

圖6 楊梅素（a）、G-β-CD（b）、楊梅素與G-β-CD物理混合物（c）、楊梅素/G-β-CD包合物（d）DSC圖Fig. 6 DSC diagrams of myricetin (a), G-β-CD (b), physical mixture of myricetin G-β-CD (c), and myricetin/G-β-CD inclusion complex (d)

圖7 楊梅素（a）、G-β-CD（b）、楊梅素與G-β-CD物理混合物（c）、楊梅素/G-β-CD包合物（d）TG圖Fig. 7 TG diagrams of myricetin (a), G-β-CD (b), physical mixture of myricetin , G-β-CD (c), and myricetin/G-β-CD inclusion complex (d)

由圖6可知，楊梅素在246 ℃有1 個尖的吸收峰，隨后有1 個放熱峰；G-β-CD在343、348 ℃有2 個吸熱峰；楊梅素與G-β-CD物理混合物的DSC圖是二者的結(jié)合，但其圖譜近似包合物DSC圖可能是由于主客體在高溫熔融條件下部分形成包合物所致；楊梅素/G-β-CD圖譜基本與G-β-CD的圖譜類似，楊梅素的特征峰消失，表明主客體間形成締合結(jié)構(gòu)，楊梅素/G-β-CD在338 ℃出現(xiàn)吸熱峰，相比楊梅素客體分子分解溫度升高，說明經(jīng)過包合作用，有效提高了客體分子的熱穩(wěn)定性。圖6的DSC曲線與圖7的TG曲線圖類似，同樣證明了主客體之間形成包合物，并經(jīng)過包合作用有效提高了客體分子的熱穩(wěn)定性。

2.6 還原能力

表1 楊梅素、楊梅素/G-β-CD包合物的吸光度（λ＝700 nm）Table 1 Absorbance of myricetin and myricetin/G-β-CD inclusion complex (λ= 700 nm)

物質(zhì)的還原能力與其抗氧化能力線性相關(guān)[26]，因而可以通過測定物質(zhì)的還原能力表征其抗氧化能力的強弱。利用待測物質(zhì)的還原性，將鐵氰化物中Fe3+還原成亞鐵氰化物中Fe2+，F(xiàn)e2+進一步和FeCl3反應(yīng)生成在波長700 nm處有最大吸光度的普魯士藍，因此通過測定體系在波長700 nm的吸光度，可間接反映物質(zhì)的還原能力[27]。楊梅素和楊梅素/G-β-CD包合物的吸光度越高，說明其還原能力越強。環(huán)糊精本身在波長700 nm處對入射光并不會有吸收，因而不會對包合物吸光度測定造成干擾[28]。楊梅素、楊梅素/G-β-CD包合物的吸光度與楊梅素濃度做3 組平行實驗，結(jié)果見表1。隨著楊梅素濃度的增加，楊梅素/G-β-CD包合物在波長700 nm處的吸光度也明顯增加。當(dāng)楊梅素濃度相同時，楊梅素與楊梅素/G-β-CD包合物的吸光度有明顯差異，而且隨著楊梅素濃度從2 mmol/L增加到6 mmol/L時，楊梅素吸光度從0.23f0.004升高到0.46f0.008，楊梅素/G-β-CD包合物的吸光度從0.37f0.003提高到0.87f0.006，二者的吸光度差異越來越大。楊梅素濃度為6 mmol/L時，楊梅素/G-β-CD的吸光度與楊梅素相比提高了89.13%，該結(jié)果說明通過包合作用，可以顯著提高客體分子的還原能力。推測原因可能是包合作用提高了物質(zhì)的水溶性，使其在水中分散良好，有利于與Fe3+的接觸而增大了楊梅素的還原能力[29-30]。

2.7 DPPH自由基清除能力

表2 楊梅素、楊梅素/G-β-CD包合物的DPPH自由基清除率Table 2 DPPH radical scavenging capacity of myricetin and myricetin/G-β-CD inclusion complex

DPPH乙醇溶液在波長517 nm處有強的吸收峰，溶液呈紫色[31]。DPPH自由基的孤電子可以與自由基清除劑提供的電子配對，使其最大吸光度下降而褪色，而且褪色程度與其接受的電子多少相關(guān)，即自由基清除劑的清除自由基能力越強，褪色程度越高，吸光度越小。環(huán)糊精在517 nm波長處無吸收，因而不會對包合物清除DPPH自由基的分析造成干擾[26]。在楊梅素濃度為2～10 mmol/L的范圍內(nèi)，對楊梅素與楊梅素/G-β-CD包合物的DPPH自由基清除能力做3 組平行實驗。隨著楊梅素濃度增加，楊梅素/G-β-CD包合物DPPH自由基清除率隨之增加。由表2可知，在相同的楊梅素濃度下，楊梅素與楊梅素/G-β-CD包合物的清除DPPH自由基能力有明顯不同，且隨著楊梅素濃度增加，這種差異越來越明顯。在測定濃度范圍內(nèi)，楊梅素DPPH自由基清除率從21.75%增加到37.06%，楊梅素/G-β-CD包合物DPPH自由基清除率則從27.14%提高到77.50%，楊梅素濃度為10 mmol/L時，楊梅素/G-β-CD包合物與楊梅素相比，DPPH自由基清除率增大了109.12%，說明通過包合作用，楊梅素的DPPH自由基清除能力顯著提高。推測原因可能是楊梅素被包合到環(huán)糊精腔體內(nèi)后，增大了楊梅素的穩(wěn)定性使其易與DPPH自由基反應(yīng)[32]，而且楊梅素的酚羥基與環(huán)糊精的羥基易形成分子內(nèi)氫鍵，使包合物的羥基化程度增大而提高了包合物的抗氧化能力[33]。

3 結(jié) 論

本實驗采用冷凍干燥法制備了楊梅素/G-β-CD包合物。利用XRD、紅外光譜、SEM等分析方法對楊梅素/G-β-CD包合物的結(jié)構(gòu)進行了表征。相溶解度法分析結(jié)果表明包合物的包合比為1∶1，締合常數(shù)為8 594 L/mol，說明包合物穩(wěn)定性好。還原能力與DPPH自由基清除能力實驗表明：隨著楊梅素濃度增加，楊梅素/G-β-CD包合物的還原能力與DPPH自由基清除能力增加，且測試濃度范圍內(nèi)的最高濃度時，與未包合前的楊梅素相比，楊梅素/G-β-CD包合物的還原能力提高了89.13%，DPPH自由基清除能力增大了109.12%。楊梅素/G-β-CD包合物具有良好的水溶性、熱穩(wěn)定性和抗氧化性，可作為保健食品的原料。