王 亞,高紅波,隋海霞,仇 凱,*,鐘其頂,呂曉玲*
(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457;2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015;3.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,北京 100015;4.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心,北京 100022)
脂肪酸氯丙醇酯(簡稱氯丙醇酯)污染是近年來國際上的食品安全研究熱點(diǎn)。氯丙醇酯按照氯丙醇種類的不同主要分為4 種[1],其中污染水平最高的是3-氯丙醇酯(3-monochloropropane-1,2-diol esters,3-MCPDE)[2]。3-MCPDE的毒性至今仍不清楚,可能引起健康風(fēng)險(xiǎn)的主要原因是3-MCPDE在加熱、酸性等條件下會(huì)水解成游離的3-氯-1,2-丙二醇(3-monochloropropane-1,2-diol,3-MCPD)[3],聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑委員會(huì)指出3-MCPD是一種具有腎臟、生殖和神經(jīng)毒性的致癌物[4-5],同時(shí)3-MCPD也被國際癌癥組織劃分為2B類致癌物[6]。縮水甘油酯(glycidol esters,GEs)是縮水甘油和游離脂肪酸的酯化產(chǎn)物,同時(shí)也是一種新型的油脂危害物。2010年,德國聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所通過毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GEs本身并不具有致癌性,但其進(jìn)入人體代謝后所產(chǎn)生的縮水甘油具有遺傳毒性[5]。GEs被國際癌癥組織定義為人類2A級(jí)致癌物[7],同時(shí)它也被德國油脂科學(xué)協(xié)會(huì)定義為2類致癌物[5]。2018年,歐盟委員會(huì)條例規(guī)定截止至2019年6月30日,嬰幼兒配方奶粉、較大嬰兒配方奶粉和嬰幼兒特殊醫(yī)用食品(粉狀)中GEs的最高限量為75 μg/kg,從2019年7月1日起,其GEs的最高限量為50 μg/kg。
目前關(guān)于食品中氯丙醇酯的檢測(cè)方法主要分為直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法,如直接檢測(cè)法中的高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜[8-9],間接檢測(cè)法中的氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用[10-12]。現(xiàn)行的GB 5009.191ü2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測(cè)定》第三法食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的測(cè)定GC-MS法,也是一種間接檢測(cè)法,該方法多用于食用植物油中氯丙醇酯的測(cè)定[13-14]。GEs具有一定的熱不穩(wěn)定性,因此對(duì)其檢測(cè)也有一定的難度。目前關(guān)于食品中GEs的檢測(cè)分為直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法,如直接檢測(cè)法中的雙固相萃取-三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜直接測(cè)定[15],間接檢測(cè)法中的GC或GC-MS[16-21]。對(duì)比2 種物質(zhì)的直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法,直接檢測(cè)法的測(cè)定時(shí)間短,但所需的標(biāo)準(zhǔn)品多,價(jià)格昂貴,而間接檢測(cè)法所需的標(biāo)準(zhǔn)品少,測(cè)定的靈敏度高,多用于常規(guī)測(cè)定。
嬰幼兒配方粉是非母乳喂養(yǎng)嬰兒的主要營養(yǎng)素?cái)z入來源,3-MCPDE與GEs是嬰幼兒食品中潛在的危害物質(zhì),歐盟已建立相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),我國尚未建立相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),因此建立嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的檢測(cè)方法對(duì)于開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及標(biāo)準(zhǔn)制定具有重要意義。目前有關(guān)食品中3-MCPDE和GEs同時(shí)測(cè)定的間接檢測(cè)方法較少[22],被檢測(cè)的樣品也以食用油為主,關(guān)于嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs同時(shí)測(cè)定的檢測(cè)方法以及這2 種物質(zhì)的污染源解析和健康風(fēng)險(xiǎn)研究幾乎處于空白階段,本研究以嬰幼兒配方粉為研究對(duì)象,建立一種同時(shí)測(cè)定3-MCPDE和GEs含量的間接檢測(cè)法,樣品經(jīng)提取、轉(zhuǎn)化、堿性水解、苯硼酸衍生化4 步前處理,最終經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀測(cè)定,并采用該方法對(duì)我國市售部分嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行檢測(cè)。本研究擬為嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs檢測(cè)方法的完善和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考,為嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的污染源解析和健康風(fēng)險(xiǎn)研究提供新的解決辦法。
市購嬰幼兒配方粉樣品:20 個(gè)品牌共30 種嬰幼兒配方粉樣品,其中包括I段嬰幼兒配方粉樣品24 種,II段嬰幼兒配方粉樣品4 種,III段嬰幼兒配方粉樣品2 種。
順式-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯(簡稱3-MCPD棕櫚酸二酯,純度98.0%)、棕櫚酸縮水甘油酯(純度98.0%)、順式-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸單酯-D5(簡稱D5-3-MCPD棕櫚酸單酯,純度99.0%)、3-MCPD(純度98.0%)、3-甲氧基丙烷-1,2-二醇(3-methoxypropane-1,2-diol,3-MPD,純度98.0%)、3-氯-1,2-丙二醇-D5(3-MCPD-D5,純度97.0%)、甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE,純度99.0%)、苯基硼酸(phenylboronic acid,PBA,純度98.0%)、甲醇鈉(純度99.0%) 北京百靈威科技有限公司;丙酮(純度99.8%)、正己烷(純度95.0%)、甲醇(純度99.9%)、乙酸乙酯(純度99.9%) 韓國Duksan Pure Chemicals公司;無水硫酸鈉(純度99.0%)、硫酸(純度98%)、氯化鈉(純度99.5%)、冰醋酸(純度99.5%)(均為分析純) 北京化工廠;實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。
2010 Plus-QP 2020 GC-MS儀 日本島津公司;XS205電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MX-S渦旋振蕩器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司;HC-3518高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
D5-3-MCPD棕櫚酸單酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L,以對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇計(jì)):準(zhǔn)確稱取D5-3-MCPD棕櫚酸單酯標(biāo)準(zhǔn)品30.60 mg(精確到0.01 mg)用乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,混勻。
3-MCPD棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L,以對(duì)應(yīng)的氯丙醇計(jì)):準(zhǔn)確稱取3-MCPD棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)品53.10 mg(精確到0.01 mg)用乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,混勻。
棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L):準(zhǔn)確稱取棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg(精確至0.01 mg),用乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,混勻。
3-MCPD-D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L):準(zhǔn)確稱取3-MCPD-D5標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg(精確至0.01 mg),用乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,混勻。
3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L):準(zhǔn)確稱取3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg(精確至0.01 mg),用乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,混勻。
3-MPD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L):準(zhǔn)確稱取3-MPD標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg(精確至0.01 mg),用無水乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用無水乙醇定容至刻度,混勻。
標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 0 m g/L):移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L)0.1 mL于10 mL容量瓶中,用MTBE定容至刻度線,混勻,得到所需的各種標(biāo)準(zhǔn)工作液。
系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液:分別吸取3-MCPD和3-MPD混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mL于10 mL離心管中,加入0.15 mL的3-MCPD-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液,加20%的NaCl溶液至2 mL,混勻,臨用現(xiàn)配。
1.3.2 樣品前處理
1.3.2.1 樣品提取
準(zhǔn)確稱取奶粉樣品1.00 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加入6 mL 65 ℃溫水勻漿后,再加入0.15 mL的D5-3-MCPD棕櫚酸單酯標(biāo)準(zhǔn)工作液?;靹蚝蠹尤?0 mL MTBE與乙酸乙酯混合溶液(8∶2,V/V)提取,渦旋振蕩5 min,8 000 r/min離心5 min取上清液。按上述步驟提取3 次,將3 次上清液合并,于45 ℃條件下氮吹濃縮至溶液體積約為2 mL。
1.3.2.2 GEs的轉(zhuǎn)化
向上述2 mL提取液中加入1 mL 1%硫酸-甲醇溶液,將混合溶液充分混勻后在50 ℃水浴中加熱30 min。
1.3.2.3 酯類水解
將上述混合溶液冷卻至室溫后加入200 μL甲醇鈉-甲醇溶液(0.25 g/mL)裂解3-MCPDE和3-甲氧基丙烷-1,2-二醇酯。密閉條件下,將混合溶液充分振蕩。反應(yīng)60 s后,加入200 μL冰醋酸和2 mL 20%的NaCl溶液終止反應(yīng)。充分振蕩完成分析物的提取,待兩相分離后,棄去上層有機(jī)相。
1.3.2.4 衍生化反應(yīng)
將200 μL衍生化試劑PBA加入水層中,充分振蕩。在室溫下反應(yīng)15 min后,加入2 mL正己烷渦旋振蕩1 min。取正己烷層,加入0.3 g無水硫酸鈉,將脫水后的正己烷溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中,供GC-MS測(cè)定分析。同時(shí)做系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液的衍生化反應(yīng)。
1.3.3 GC-MS測(cè)定條件
G C條件:S H-R x i-5 m s毛細(xì)管色譜柱(30 mh0.25 mm,0.25 μm);程序升溫:初始溫度50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min升溫至210 ℃,再以30 ℃/min升溫至300 ℃,保持5 min;總采集時(shí)間25 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣為超純級(jí)氦氣,流速0.7 mL/min;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量2 μL。
MS條件:電子電離源;電離能量70 eV;離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度280 ℃;采用選擇離子監(jiān)測(cè)方式。
1.3.4 有機(jī)溶劑提取率的計(jì)算
移取0.1 mL 3-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)中間液,加入0.9 mL有機(jī)溶劑,充分振蕩后,加入無水硫酸鈉吸水干燥,將溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中,供GC測(cè)定分析,記其目標(biāo)化合物的響應(yīng)值為A1;移取0.1 mL 3-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)中間液于0.5 mL溫水混勻后的嬰幼兒配方粉樣品溶液中,加入0.9 mL有機(jī)溶劑,充分振蕩后分離有機(jī)層,再經(jīng)上述相同的操作后,記其目標(biāo)化合物的響應(yīng)值為A2。提取率計(jì)算如下式所示:
式中:A為嬰幼兒配方粉樣品中3-MCPDE的本底值。
利用島津GC Solution軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集,使用Origin 8.0軟件繪圖。
2.1.1 3 種衍生物的定性分析
經(jīng)苯硼酸衍生后3 種目標(biāo)化合物的衍生物可以通過SH-Rxi-5 ms毛細(xì)管色譜柱實(shí)現(xiàn)分離,且目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、峰形均良好,可以達(dá)到很好的分離效果。在最優(yōu)的色譜條件下,3 種目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖如圖1所示,保留時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子對(duì)如表1所示。3-MPD、3-MCPD衍生物的m/z147和3-MCPD-D5衍生物的m/z150靈敏度最高,因此選擇m/z147作為3-MPD、3-MCPD衍生物的定量離子,選擇m/z150作為3-MCPD-D5衍生物的定量離子,其他離子作為各目標(biāo)化合物的定性離子。
圖1 3-MCPD和3-MPD衍生物及內(nèi)標(biāo)衍生物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of derivatives of 3-MCPD,3-MPD and internal standard
表1 目標(biāo)化合物的色譜及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for target compounds
2.1.2 提取溶劑的選擇
目標(biāo)化合物的提取是嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs檢測(cè)的前提。采用GB 5009.191ü2016第三法食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的測(cè)定GC-MS法中的提取方法,經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證,正己烷的提取效率較低。本研究對(duì)比正己烷[1,23]、MTBE[24]、乙酸乙酯[1]以及MTBE-乙酸乙酯的混合溶液(8∶2,V/V)[25]的提取效果,結(jié)果如表2所示,選用MTBE與乙酸乙酯的混合溶液作為提取劑最佳。因此采用MTBE和乙酸乙酯的混合溶液作為本實(shí)驗(yàn)的提取試劑。
表2 不同有機(jī)溶劑的提取率Table 2 Extraction efficiencies with different organic solvents
2.1.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
圖2 實(shí)驗(yàn)過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化流程圖Fig. 2 Flow chart of material conversion during the experiment
圖3 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig. 3 Effect of conversion time on response value of target compounds
在酯交換過程中甲醇鈉通過分子內(nèi)的親核取代使R-鹵代醇,即3-MCPD轉(zhuǎn)化成大量的縮水甘油,從而導(dǎo)致3-MCPD的含量減少而縮水甘油的含量增加[26-28],為避免副反應(yīng)的產(chǎn)生,本實(shí)驗(yàn)采用酸性醇解實(shí)現(xiàn)3-MCPDE和GEs的明顯區(qū)分(圖2),并通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量??s水甘油與硫酸-甲醇溶液的開環(huán)反應(yīng)有高度的區(qū)域選擇性,主要形成3-MPD,且反應(yīng)具有良好的再現(xiàn)性[24]。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3-MPD作為參比化合物,發(fā)現(xiàn)酸性醇解實(shí)現(xiàn)了3-MCPDE和GEs的明顯區(qū)分。文獻(xiàn)[24]提出50 ℃為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最佳溫度,更高的溫度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低且有大量副反應(yīng)產(chǎn)生,為提高轉(zhuǎn)化率,本研究以10、20、30、40、50、60 min 6 個(gè)時(shí)間水平為變化因素,以目標(biāo)化合物的響應(yīng)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn),如圖3所示。10~30 min時(shí),目標(biāo)化合物峰面積增大,縮水甘油開環(huán)逐漸轉(zhuǎn)化為3-MPD;30 min后,目標(biāo)化合物峰面積減小,轉(zhuǎn)化率降低,故采用30 min作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的時(shí)間。
2.1.4 水解時(shí)間的確定
由于3-MCPD在堿性介質(zhì)中容易降解,故水解時(shí)間對(duì)該方法的靈敏度具有很大影響[29]。為減少副反應(yīng)的產(chǎn)生,在保證酯類完全水解的基礎(chǔ)上,應(yīng)使水解反應(yīng)的時(shí)間盡可能短[24]。以水解時(shí)間40、50、60、70、80 s和90 s進(jìn)行水解反應(yīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,結(jié)果如圖4所示。40~60 s,目標(biāo)化合物峰面積增大,酯類逐漸水解,且在水解過程中3-MPD單酯的水解速率與3-MCPD雙酯的水解速率相比較快。60 s之后,目標(biāo)化合物峰面積減小,3-MCPD在堿性條件下降解,且二者的降解速率趨于一致。酯類完全裂解且副反應(yīng)最少的反應(yīng)時(shí)間為60 s,故本實(shí)驗(yàn)采用60 s作為水解時(shí)間。
圖4 水解時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on response value of target compounds
表3 目標(biāo)化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限Table 3 Standard curves, linear ranges, correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of target compounds
分別以3-MCPD衍生物色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物的色譜峰面積之比為縱坐標(biāo),3-MCPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以3-MPD衍生物的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物的色譜峰面積之比為縱坐標(biāo),3-MPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到目標(biāo)化合物在0.050~0.80 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性方程,以3 倍信噪比計(jì)算方法的檢出限,以10 倍信噪比計(jì)算方法的定量限,結(jié)果如表3所示。經(jīng)驗(yàn)證目標(biāo)化合物在0.050~0.80 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,R2均大于0.998,檢出限和定量限分別為30 μg/kg和100 μg/kg。
表4 樣品的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions for spiked samples (n= 6)
在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,選取樣品分別加入200.0、400.0 μg/kg和800.0 μg/kg 3 個(gè)添加量的3-MCPDE和GEs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次,計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。由表4可知,當(dāng)樣品中目標(biāo)化合物的加標(biāo)水平在200.0~800.0 μg/kg時(shí),平均回收率在81.4%~101.1%,RSD為4.42%~6.12%,表明方法的精密度良好,能夠滿足嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的測(cè)定要求。
圖5 2 種目標(biāo)化合物含量分析箱線圖Fig. 5 Box plots of the contents of two target compounds
表5 不同階段嬰幼兒配方粉樣品中3-MCPDE和GEs含量分析Table 5 Analysis of 3-MCPDE and GEs contents in infant formula powder samples intended for different age groups
本研究對(duì)30 份我國市售嬰幼兒配方粉樣品中3-MCPDE和GEs的含量進(jìn)行測(cè)定,每份樣品做2 個(gè)平行,取平均值,結(jié)果見表5。30 份樣品中,3-MCPDE和GEs的檢出率為100%,而且從圖5可以看出,II段、III段嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的含量低于I段嬰幼兒配方粉中目標(biāo)化合物含量的均值與中值。一般認(rèn)為3-MCPDE和GEs來源于脂肪,而II段、III段嬰幼兒配方粉中脂肪含量相對(duì)于I段奶粉中脂肪的含量會(huì)有所減少,由此可見嬰幼兒配方粉中這2 種目標(biāo)化合物的含量可能與脂肪含量的多少有一定的相關(guān)性,同時(shí)還可能與配方粉中所添加的食用植物油的種類[30]等有關(guān)。
本研究利用同位素內(nèi)標(biāo)和GC-MS法建立嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的同步檢測(cè)方法,實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑的選擇、酸性醇解的轉(zhuǎn)化條件和酯類水解的時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。方法學(xué)評(píng)價(jià)表明,3-MCPDE和GEs在0.050~0.80 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,方法的檢出限均達(dá)到30 μg/kg。樣品基質(zhì)加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果表明,該方法回收率高,精密度良好,能滿足不同階段嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的定量檢測(cè)要求。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大量樣品的測(cè)定可知:30 份嬰幼兒配方粉樣品中3-MCPDE含量為50.0~207.8 μg/kg,平均值為98.0 μg/kg,GEs含量為50.0~480.0 μg/kg,平均值為208.1 μg/kg。本研究為完善其他食品中3-MCPDE和GEs的同步檢測(cè)方法提供參考,為嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs檢測(cè)方法的完善和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供指導(dǎo),為嬰幼兒配方粉中3-MCPDE和GEs的污染源解析和健康風(fēng)險(xiǎn)研究提供了新的解決辦法。