雷建林，曹宏，楊麗霞，李茜，王應(yīng)強(qiáng)

·綜 述·

非洲豬瘟病毒的生物學(xué)特性與疫苗研制的難點(diǎn)

雷建林，曹宏，楊麗霞，李茜，王應(yīng)強(qiáng)

隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000

非洲豬瘟 (African swine fever，ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV) 引起的一種豬烈性傳染病，是全球養(yǎng)豬業(yè)的“頭號殺手”，強(qiáng)毒株引發(fā)的超急性和急性感染死率高達(dá)100%。2018年8月ASF首次傳入我國，截止2019年6月6日，已有32個省份累計暴發(fā)137起疫情，給我國社會、經(jīng)濟(jì)構(gòu)成巨大威脅。ASF疫苗的研制始于20世紀(jì)60年代，但均以失敗而告終，其主要原因是對ASFV生物學(xué)特性缺乏深入的研究。有效控制當(dāng)前ASF疫情擴(kuò)散、研制安全有效的疫苗將是我國面臨的巨大挑戰(zhàn)。本文對ASFV形態(tài)與基本結(jié)構(gòu)、傳播途徑、致病機(jī)制、基因組及編碼蛋白、入侵機(jī)制、免疫逃逸等生物學(xué)特性進(jìn)行了概述，并分析了當(dāng)前疫苗研制面臨的難點(diǎn)，以期為我國有效控制ASF疫情及病原研究提供參考。

非洲豬瘟，非洲豬瘟病毒，養(yǎng)豬業(yè)，生物學(xué)特性，疫苗研制

非洲豬瘟 (African swine fever，ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV) 引起的一種高度接觸性、廣泛出血性豬烈性傳染病，強(qiáng)毒株感染的致死率高達(dá)100%[1]。世界動物衛(wèi)生組織 (OIE) 將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病和重點(diǎn)防范的外來動物疫病之一。1921年肯尼亞首次確認(rèn)發(fā)生ASF以來，疫情隨后蔓延至撒哈拉以南的非洲地區(qū)及歐洲、美洲、亞洲等60多個國家和地區(qū) (OIE數(shù)據(jù))，且仍呈流行擴(kuò)大趨勢，目前尚無安全有效的疫苗用于該病的防控[1-3]。我國自2018年8月暴發(fā)首例ASF以來，截止2019年6月6日，已有32個省份累計暴發(fā)137起疫情 (OIE和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計數(shù)據(jù))，幾乎席卷我國所有省份和地區(qū)。我國作為世界豬肉產(chǎn)量最大國 (約占世界總產(chǎn)量的50%)[4]，這場突如其來的ASF疫情對我國的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大威脅。當(dāng)前，有效控制ASF疫情擴(kuò)散、研發(fā)安全有效的疫苗將是我國面臨的最大挑戰(zhàn)。

ASF疫苗研制始于20世紀(jì)60年代，由于ASFV生物學(xué)特性的復(fù)雜性，迄今未能研制出安全有效的疫苗[5-7]。本研究結(jié)合當(dāng)前最新研究進(jìn)展，就ASFV的結(jié)構(gòu)、致病性、傳播途徑、基因及編碼蛋白、入侵機(jī)制、免疫逃逸機(jī)制等生物學(xué)特性進(jìn)行了概述，并分析了當(dāng)前疫苗研制面臨的難點(diǎn)，以期為我國有效防控ASF疫情及病原研究提供參考。

1 ASFV的結(jié)構(gòu)及特性

1.1 形態(tài)與基本結(jié)構(gòu)

ASFV為有囊膜的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟相關(guān)病毒科 (Asfarviridae) 非洲豬瘟病毒屬 (Asfivirus) 的唯一成員，也是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一DNA蟲媒病毒。胞外病毒粒子直徑約為200 nm，由內(nèi)核 (Internal core)、內(nèi)核心殼 (Core shell)、內(nèi)膜 (Inner envelope)、衣殼 (Capsid)、囊膜 (External envelope) 形成的同心多層20面體對稱結(jié)構(gòu)組成(圖1)。內(nèi)核由類核 (Nucleoid) 組成，包含病毒基因組和核蛋白、早期mRNAs合成所需的元件。內(nèi)核心殼由pp220、pp62等多聚蛋白構(gòu)成。內(nèi)膜在電子顯微鏡下為單脂膜[6]，主要來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，包含p54、p17、p12蛋白。衣殼由2 000多個六邊形殼粒組成，主要為p72蛋白，占病毒粒子總量的33%。囊膜為ASFV出芽時獲得于細(xì)胞的質(zhì)膜。ASFV形態(tài)發(fā)生于細(xì)胞核及微管組織中心附近，該特殊區(qū)域稱之為“病毒工廠”，不包括宿主蛋白，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和波形蛋白支架包圍。除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，線粒體也被招募至“病毒工廠”的外圍[6,8]。

1.2 傳播途徑

豬科動物是ASFV的唯一易感動物，包括家豬、歐洲野豬、疣豬、巨型森林豬等，其中家豬高度易感，無明顯品種、年齡、性別差異[8-9]。

圖1 胞外ASFV顆粒結(jié)構(gòu)示意圖[6]

ASF是歐盟 (EU) 和OIE認(rèn)定的高度接觸性傳染病。豬通過直接接觸感染動物或經(jīng)感染病毒的軟蜱叮咬傳播，也可直接或間接接觸感染豬的糞便、血液、尿液、唾液等排泄物或分泌物，飼料、設(shè)備、衣物、鞋、運(yùn)輸工具等污染物傳播(圖2)。另外，ASFV也能通過直接接觸感染病毒的豬尸體或其產(chǎn)品傳播[10-12](圖2)。

鈍緣軟蜱是ASFV的生物學(xué)傳播媒介，通過叮咬家豬或野豬相互傳播病毒。軟蜱感染后成為儲存宿主，病毒在其體內(nèi)存活可長達(dá)數(shù)年，能通過卵及雌雄交配的方式將病毒傳播給子代，導(dǎo)致ASFV在軟蜱中持續(xù)循環(huán)[3](圖3)。疣豬對ASFV具有一定的抵抗力，成年疣豬感染后既不排毒也不產(chǎn)生病毒血癥，呈隱性感染，作為儲存庫使病毒在森林中循環(huán) (圖3)[3,13]。新生疣豬感染ASFV后會引發(fā)嚴(yán)重的病毒血癥，但無臨床癥狀[14]。疣豬不能通過直接接觸或水平和垂直的方式傳播病毒，蜱是其唯一的傳播媒介 (圖3)[14-15]。其他非洲野豬 (叢林豬、巨型森林豬) 對ASFV的易感性和流行病學(xué)尚不清楚，但叢林豬在實(shí)驗條件下能通過直接接觸的方式將病毒傳播給家豬[16-17]。ASFV在流行地區(qū)有3種循環(huán)模式：1) 家豬-家豬循環(huán)；2) 家豬-軟蜱-野豬循環(huán)；3) 家豬-軟蜱循環(huán)[18-19]。這些循環(huán)模式使得ASFV在流行地區(qū)持續(xù)循環(huán)，導(dǎo)致疫情不斷擴(kuò)散。

圖2 豬感染ASFV的途徑示意圖

圖3 ASFV在疣豬與軟蜱之間傳播示意圖

其他傳播方式也有研究報道，如ASFV能通過短距離的氣溶膠傳播，但距離不超過2 m[20]。另外，豬舍內(nèi)的螯蠅spp.作為機(jī)械的傳播媒介也能將ASFV傳播給豬，但病毒在其體外存活不超過2 d[17]。最新研究報道ASFV很容易通過飲水傳播，其最小感染劑量為100TCID50[21]。其他可能的傳播媒介如鼠和鳥類目前還未得到證實(shí)[17]。目前，家豬能否通過交配或垂直的方式傳播還未得到證實(shí)，但從感染豬的生殖器分泌物中能檢測到ASFV[17]。

1.3 毒力與致病性

ASFV按其毒力分為強(qiáng)、中、低毒力毒株。強(qiáng)毒株主要引發(fā)超急性或急性感染，感染4–9 d后發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%。超急性感染在出現(xiàn)臨床癥狀1–4 d后動物突然死亡，主要器官無明顯病理變化。急性感染以皮膚出現(xiàn)紅斑和紫紺為主要特征，并伴有高熱、厭食、嘔吐、腹瀉或出血性腹瀉、虛弱、嗜睡、呼吸窘迫、鼻腔及眼結(jié)膜粘液膿性分泌物、母豬流產(chǎn)等癥狀。病理剖檢變化主要有脾臟充血性腫大、內(nèi)臟淋巴結(jié)出血、腹腔積液等。強(qiáng)毒株引發(fā)ASF初期，主要以急性感染為主，持續(xù)一段時間后發(fā)展為亞臨床癥狀。中等毒力毒株主要引發(fā)亞急性感染，仔豬死亡率高于成年豬，死亡率為30%–70%，感染3–4周后部分豬恢復(fù)健康，臨床癥狀主要有持續(xù)或間歇性發(fā)熱，致死性感染的臨床癥狀與急性感染相似，病理剖檢變化嚴(yán)重程度略低于急性感染。低毒力毒株主要引發(fā)慢性感染，死亡率低，無典型的ASF臨床癥狀，一般出現(xiàn)間歇性發(fā)熱或低熱、皮膚潰爛、關(guān)節(jié)炎、食欲減退、精神沉郁、生長緩慢、消瘦、肺炎和流產(chǎn)等癥狀。潛伏期ASFV的感染力最強(qiáng)，臨床癥狀出現(xiàn)48 h前開始體外排毒，康復(fù)豬在臨床癥狀消失后仍能體外排毒持續(xù)1個月。產(chǎn)生抵抗力的豬成為ASFV儲存庫，導(dǎo)致病毒持續(xù)循環(huán)于流行地區(qū)[1,3,20]。

1.4 理化特性

ASFV在環(huán)境中具有很強(qiáng)的生存能力，在 pH 3.9–11.5的條件下活性不受影響，60 ℃條件下30 min可滅活。–70 ℃冷藏條件下，血液中的病毒能存活18個月，脾臟組織中ASFV感染力2年內(nèi)不受影響。37 ℃條件下，血液中的ASFV能存活1個月。ASFV在豬的糞便中至少可存活11 d，尸體中長達(dá)1年，在未經(jīng)燒煮或高溫?zé)熝幕鹜然蛳隳c中能存活3–6個月，4 ℃保存的帶骨肉中至少存活5個月，冷凍豬肉中能存活15周，半熟肉及泔水中也能長時間存活。多種消毒劑能有效滅活A(yù)SFV，飲用水或污水可用2%–3%次氯酸鈉，車輛及用具可用碘化合物，豬舍、場地等用1%–2%氫氧化鈉或3%鄰苯基酚[1,22-23]。

2 ASFV基因組及主要編碼蛋白

2.1 基因組結(jié)構(gòu)

ASFV基因組為線性雙鏈DNA分子，大小在170–190 kb之間，包含一個125 kb的保守中心區(qū)和兩個由串聯(lián)重復(fù)序列和多基因家族 (Multigene families，MGF) 構(gòu)成的可變末端區(qū)，MGF基因拷貝數(shù)的增減導(dǎo)致不同毒株的基因組大小不同[6]。ASFV DNA包含151–167個開放閱讀框 (Open reading frames，ORFs)，約編碼68種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白[1,24]。基因組緊密排布，兩條DNA編碼鏈無內(nèi)含子，末端有共價結(jié)合的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，以彼此反轉(zhuǎn)或互補(bǔ)兩種形式存在[25-26]。ASFV mRNAs結(jié)構(gòu)類似于真核細(xì)胞的mRNA分子，5?-UTR端有一個帽子結(jié)構(gòu)，3?-UTR端有33個多聚核苷酸 (polyA) 尾，帽子結(jié)構(gòu)主要為m7G (50) pppAm[27]。

2.2 DNA復(fù)制過程

胞漿內(nèi)的ASFV通過微管運(yùn)輸至細(xì)胞核周圍區(qū)域開始復(fù)制，表達(dá)DNA復(fù)制所需的酶。早期轉(zhuǎn)錄利用病毒編碼的RNA聚合酶、多聚腺苷酸化酶、轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)行復(fù)制[28]。感染6 h后啟動轉(zhuǎn)錄模式，兩條DNA鏈均可作為編碼鏈。ASFV約20%基因參與轉(zhuǎn)錄和mRNA的修飾，且轉(zhuǎn)錄相對獨(dú)立，能精準(zhǔn)控制基因表達(dá)的位置和時間。細(xì)胞核在病毒復(fù)制過程中的作用尚未研究清楚，但DNA復(fù)制早期，在細(xì)胞核內(nèi)能檢測到小DNA片段，晚期在胞漿中合成大分子片段。全長基因組在“病毒工廠”區(qū)域以“頭對頭”的串聯(lián)體方式將基因組分為單位長度的ORFs完成復(fù)制。ASFV DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄與痘病毒相似，不同的是痘病毒DNA復(fù)制在早期階段不能在細(xì)胞核中進(jìn)行[28]。

2.3 ASFV編碼蛋白

目前，ASFV基因編碼蛋白的數(shù)量與功能仍未完全鑒定清楚。早期采用二維凝膠電泳技術(shù)在高度純化的胞外病毒粒子中檢測到54種蛋白，大小在10–150 kDa之間[29]。隨后通過對ASFV基因組全序分析可編碼的結(jié)構(gòu)大約有113種蛋白，編碼ORFs有151–167個[28,30]。最近采用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定出68種結(jié)構(gòu)蛋白和21種非結(jié)構(gòu)蛋白，并對68種結(jié)構(gòu)蛋白的功能進(jìn)行了鑒定分析：結(jié)構(gòu)及形態(tài)形成16種 (24%)、病毒轉(zhuǎn)錄及RNA修飾13種 (19%)、維持基因完整性4種 (6%)、病毒入侵3種 (4%)、免疫逃避2種 (3%)、其他功能已知蛋白7種 (10%)、功能未知蛋白23種 (34%)[24,28]。

3 ASFV的復(fù)制特性

3.1 主要靶細(xì)胞

ASFV主要感染單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，包括高度分化的組織巨噬細(xì)胞和淋巴結(jié)、脾、腎、肝等器官的網(wǎng)狀細(xì)胞的特定亞類。ASFV復(fù)制也見于內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞和肝細(xì)胞等細(xì)胞，但僅見于感染晚期階段，在ASFV的病理過程中不起關(guān)鍵作用[6,31]。

3.2 病毒入侵與脫殼

ASFV入侵細(xì)胞依賴于溫度、能量、膽固醇、低pH值，并需要肌動蛋白和網(wǎng)格蛋白參與[32-33]。早期研究證明ASFV入侵宿主機(jī)體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，利用囊膜與內(nèi)吞體膜融合機(jī)制將病毒粒子釋放至胞漿中，但參與感染的病毒受體尚未完全闡明[34-35]。最新研究證實(shí)，ASFV入侵豬的巨噬細(xì)胞既可通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，也能通過肌動蛋白驅(qū)動的巨胞飲方式進(jìn)入巨噬細(xì)胞，是兩種可選擇的入侵方式 (圖4)。胞漿內(nèi)的病毒粒子以早期核內(nèi)體和胞飲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)運(yùn)輸至晚期多泡核內(nèi)體中，在此受低pH的驅(qū)動逐漸分解裝配，包括衣殼破裂、囊膜分離、病毒內(nèi)膜與限制性內(nèi)質(zhì)膜融合[36]。隨后，病毒粒子被運(yùn)輸至胞漿中進(jìn)一步脫殼，釋放可復(fù)制的病毒基因組[36-37](圖4)。

3.3 “病毒工廠”的形成與病毒釋放

“病毒工廠”位于胞漿內(nèi)細(xì)胞核周圍的特定區(qū)域，屬于微管組織中心的一個獨(dú)立區(qū)，蛋白質(zhì)、DNA在該位點(diǎn)聚集，完成病毒粒子的組裝 (圖4)。微管是“病毒工廠”形成的必需元件，其完整性、穩(wěn)定性影響病毒的入侵。驅(qū)動蛋白將ASFV運(yùn)輸至“病毒工廠”是結(jié)構(gòu)蛋白p54與馬達(dá)分子相互作用的結(jié)果?！安《竟S”周圍的波形支架蛋白能聚集病毒組裝的元件，阻止其游離至細(xì)胞質(zhì)中。核衣殼和內(nèi)核心殼在“病毒工廠”區(qū)域完成組裝形成初期的病毒結(jié)構(gòu)，DNA進(jìn)一步衣殼化形成成熟的病毒粒子。驅(qū)動蛋白將成熟的病毒粒子運(yùn)輸至細(xì)胞膜附近，出芽釋放至胞外 (圖4)[38-40]。

圖4 ASFV內(nèi)化與脫殼模型圖[6,36]

4 ASFV免疫逃逸機(jī)制

4.1 主要靶向單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)

吞噬細(xì)胞在吞噬、殺滅和清除病原的過程中起核心作用，主要包括單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等。當(dāng)機(jī)體遇到病原感染后，吞噬細(xì)胞被迅速招募至感染部位，通過模式識別受體 (Pattern recognition receptors，PRRs) 識別病原相關(guān)分子模式 (Pathogen associated molecular patterns，PAMP) 吞噬病原微生物，還能吞噬病原感染的自身細(xì)胞以達(dá)到殺滅和清除病原體的作用。巨噬細(xì)胞在激活和調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮主要作用。ASFV主要靶向宿主的單核-巨噬細(xì)胞，并在其內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，這種感染機(jī)制有利于ASFV抑制或控制宿主免疫應(yīng)答。而且，ASFV入侵的首要前提需要跨越巨噬細(xì)胞本身具有消滅病原體的免疫防線。因此，ASFV可作為一個良好的模型用于研究病毒如何逃逸宿主免疫防御系統(tǒng)完成自我復(fù)制，抑制宿主免疫應(yīng)答等感染機(jī)制[41-42]。

為了入侵巨噬細(xì)胞，ASFV利用細(xì)胞具有的內(nèi)吞或巨胞飲的特性進(jìn)入胞漿啟動復(fù)制循環(huán)。巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境具有殺滅ASFV功能，如誘導(dǎo)DNA損傷或突變，抑制病毒復(fù)制，但ASFV在胞漿中能適應(yīng)性地獲得堿基切除或DNA修復(fù)的酶系統(tǒng)，如DNA聚合酶Ⅹ、Ⅰ型DNA鏈接酶和脫嘌呤/脫嘧啶內(nèi)切核酸酶，這種修復(fù)機(jī)制能及時修復(fù)DNA損傷，保證病毒在胞漿中完成復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)酶修復(fù)系統(tǒng)在巨噬細(xì)胞中具有保存病毒遺傳信息的功能[43-44]。

4.2 控制宿主免疫防御系統(tǒng)

ASFV復(fù)制通過程序性通路 (Programmed pathways) 破壞細(xì)胞死亡通路，包括細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)、細(xì)胞焦亡 (Pyroptosis) 和壞死 (Necrosis)。這種破壞機(jī)制有利于ASFV在細(xì)胞內(nèi)存活足夠的時間完成子代病毒復(fù)制。而且，ASFV誘導(dǎo)的這些通路有利于細(xì)胞發(fā)生裂解，招募巨噬細(xì)胞[41,45]。

4.2.1 抑制細(xì)胞死亡

凋亡作為重要的先天性細(xì)胞免疫能抵抗病毒感染，多種病毒為了完成自身復(fù)制在感染的早期抑制細(xì)胞凋亡[46]。ASFV基因編碼抗凋亡蛋白Bcl-2的同源物，能抑制凋亡，該蛋白在病毒復(fù)制早期和晚期均可表達(dá)[47]，也能抑制促凋亡蛋白(BH3-only促凋亡家族) 的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[47]。另外，基因能與細(xì)胞自噬調(diào)控因子Beclin-1相互作用抑制細(xì)胞自噬[48]。基因編碼的凋亡抑制劑 (凋亡樣蛋白) (Apoptosis-like protein，IAP) 能抑制caspase-3凋亡通路，激活NF-κB信號通路逃逸宿主免疫應(yīng)答。同時，基因能調(diào)控炎癥因子、caspase-1及caspase-8信號通路引發(fā)的細(xì)胞焦亡[41,49-50]。

4.2.2 控制蛋白合成

ASFV與其他DNA病毒類似，通過調(diào)控翻譯起始因子及劫持細(xì)胞翻譯合成自身蛋白。ASFV基因編碼蛋白含有一個能結(jié)合宿主蛋白磷酸酶1 (Host protein phosphatase 1，PP1) 的催化亞基，該蛋白能與宿主PP1相互作用誘導(dǎo)eIF2α去磷酸化，促進(jìn)ASFV蛋白合成。研究表明，刪除ASFV基因感染細(xì)胞不能誘導(dǎo)eIF2α磷酸化增加，表明ASFV有其他補(bǔ)償機(jī)制阻止eIF2α磷酸化[41-42]。

4.3 抑制宿主免疫應(yīng)答

4.3.1 抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)

ASFV編碼的一系列蛋白能抑制Ⅰ型干擾素、細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和其他免疫調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。干擾素在感染細(xì)胞與相鄰細(xì)胞間被細(xì)胞表面受體識別，誘導(dǎo)干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs) 表達(dá)。干擾素能將病毒抗原呈遞給CD8+細(xì)胞，激活自然殺傷細(xì)胞 (Natural killer cells) 抑制病毒復(fù)制[41-42,51]。

ASFV強(qiáng)毒株感染巨噬細(xì)胞能抑制Ⅰ型干擾素和ISGs的表達(dá)。敲除多基因家族及基因病毒能抑制干擾素產(chǎn)生，影響STAT信號通路和抗病毒分子。ASFV編碼的其他蛋白也通過復(fù)雜的作用機(jī)制調(diào)控宿主先天性免疫，如(病毒Toll樣受體同源物)、基因通過調(diào)控NF-κB通路抑制干擾素產(chǎn)生。另外，ASFV也能靶向ISG抑制宿主免疫應(yīng)答[41,52-53]。

4.3.2 CD2v蛋白的免疫抑制作用

ASFV CD2樣蛋白 (CD2-like protein，CD2v) 與病毒粒子在細(xì)胞中表達(dá)的配體相互作用引發(fā)紅細(xì)胞吸附，這種作用有利于病毒在宿主體內(nèi)迅速擴(kuò)散。同時，CD2v基因與病毒的致病性有關(guān)，刪除CD2v基因?qū)е滤拗鞑《狙Y和臨床癥狀的顯著延緩。CD2v也可通過抑制淋巴細(xì)胞增殖誘導(dǎo)免疫抑制[41,54]。

5 ASF疫苗研制的難點(diǎn)與對策分析

ASF疫苗研制始于1960年，由于ASFV生物學(xué)特性的復(fù)雜性，目前尚未研制出安全有效的商業(yè)化疫苗[55-56]。

5.1 遺傳多樣性

ASFV基因組結(jié)構(gòu)中兩端可變區(qū)MGF基因易變、串聯(lián)重復(fù)序列錯配率高，導(dǎo)致ASFV在宿主、細(xì)胞、環(huán)境中容易發(fā)生變異。目前，依據(jù)p72基因 () 末端核苷酸的差異，可將ASFV分為24個基因型，基于病毒是否會引起紅細(xì)胞吸附的特性，已鑒定出至少有8個血清群。此外，在不同流行地區(qū)已鑒定出有不同來源 (非洲源、歐洲源)、毒力 (高毒力、中毒力、低毒力)、宿主傳代變異等多種毒株，這些毒株對宿主的致病性和免疫應(yīng)答存在一定差異。因此，ASFV在流行地區(qū)容易發(fā)生適應(yīng)性變異，不斷進(jìn)化，致使開發(fā)的各類疫苗不能完全提供交叉免疫保護(hù)。早期研究采用細(xì)胞傳代、天然致弱等傳統(tǒng)手段，研制的減毒活疫苗能抵抗同源毒株的攻擊，但不能提供異源毒株的交叉保護(hù)，且存在安全隱患，迫使此類疫苗研發(fā)受阻[6-7,57-58]。

5.2 免疫保護(hù)機(jī)制不清楚

在特異性免疫應(yīng)答中，體液免疫和細(xì)胞免疫各自有其獨(dú)特的作用，相互配合，共同發(fā)揮免疫效應(yīng)抵抗病原體的入侵。前期大量研究嘗試各類疫苗的研制，但均未能獲得理想的免疫保護(hù)效果。細(xì)胞傳代減毒疫苗、滅活疫苗均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，但不能提供攻毒保護(hù)，而且存在安全隱患。為了解決疫苗安全問題，研究開始轉(zhuǎn)向核酸疫苗、亞單位疫苗、病毒活載體疫苗，此類疫苗主要選擇遞呈病毒單個或多個具有免疫保護(hù)的抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。結(jié)果表明，該類疫苗能夠誘導(dǎo)豬只產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體，但仍不能完全抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，甚至ASFV存在抗體依賴性增強(qiáng)作用。據(jù)此有人認(rèn)為，抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)可能不足以完全抵抗ASFV的攻擊，這一結(jié)論一直備受爭議，因為感染ASFV的康復(fù)豬能完全抵抗強(qiáng)毒的攻擊，這也是科學(xué)界認(rèn)為有可能研究出ASF疫苗的主要依據(jù)。同時，有人認(rèn)為抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)可能依賴于ASFV復(fù)制，也可能是ASFV在細(xì)胞內(nèi)外感染機(jī)制的不同導(dǎo)致特異性抗體不能有效中和病毒。因此，需要進(jìn)一步研究細(xì)胞免疫在機(jī)體免疫保護(hù)中的作用[6-7,57,59-60]。

目前，大量研究證實(shí)細(xì)胞免疫在抗ASFV感染中發(fā)揮重要作用。如特異性的CD8+T細(xì)胞能清除ASFV，參與機(jī)體的免疫保護(hù)。ASFV 三種基因 (CD2v/、p54/、p30/) 與細(xì)胞中的泛素基因共表達(dá)后，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL) 的免疫應(yīng)答，在無特異性抗體的情況下能提供部分免疫保護(hù)。另外，γ干擾素 (Interferon-γ，IFN-γ) 應(yīng)答、自然殺傷細(xì)胞 (NK細(xì)胞) 等也在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用[6-7,55-56]。

5.3 結(jié)構(gòu)復(fù)雜

ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜、基因組龐大，大部分基因功能未知，而且結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒入侵、組裝及對宿主免疫應(yīng)答過程中的作用尚未完全闡明。因此，這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致疫苗研制進(jìn)程相對緩慢，如基因缺失疫苗具有較好的免疫效力，能完全抵抗同源強(qiáng)毒株的攻擊，也具有交叉保護(hù)的免疫效力，但存在毒力返強(qiáng)的潛在危險。另外，ASFV基因編碼的酶、轉(zhuǎn)錄因子在病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程中的功能大部分不清楚，致使以酶為靶點(diǎn)開發(fā)抑制病毒轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的抗病毒藥物受阻[55-56]。

5.4 可選擇的入侵方式

ASFV可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或非特異性的巨胞飲作用入侵靶細(xì)胞，且參與病毒吸附的受體尚未鑒定清楚，這種入侵機(jī)制表明受體結(jié)合不是決定細(xì)胞嗜性的唯一因素。同時，宿主非敏感細(xì)胞對ASFV的嗜性尚不清楚。因此，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，以病毒受體為靶標(biāo)開發(fā)新型疫苗、抗病毒藥物等阻斷病毒入侵的策略受到極大限制[36,56-57]。

5.5 免疫逃逸

ASFV主要靶向單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，通過抑制細(xì)胞凋亡、宿主免疫應(yīng)答等策略逃逸宿主免疫防御系統(tǒng)。目前，對于ASFV研究僅限于鑒定數(shù)種編碼蛋白參與免疫逃逸，通過調(diào)控宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、凋亡、自噬、炎癥應(yīng)答、免疫抑制等通路完成自我復(fù)制，這些基因在病毒與宿主中功能尚未研究清楚，如是否存在更多結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白參與免疫逃逸，以何種方式逃逸宿主免疫防御系統(tǒng)，刪除該基因后是否影響病毒復(fù)制等。探索病毒跨越宿主免疫防線、破壞免疫系統(tǒng)是人類攻克各種病毒的難題，也是ASF疫苗研制的主要難題之一，深入研究ASFV免疫逃逸機(jī)制也可為預(yù)防或治療其他病毒性疾病提供借鑒[41-42,55-56,61]。

5.6 疫苗開發(fā)面臨的其他難題

基因缺失疫苗被認(rèn)為是短期內(nèi)最有希望開發(fā)成功的疫苗，具有同源保護(hù)作用，也能抵抗異源毒株的攻擊，但存在安全隱患，進(jìn)一步鑒定及敲除毒力基因后具有很大應(yīng)用前景[22,55-56,58]。然而，該類疫苗在商業(yè)化的進(jìn)程也面臨諸多挑戰(zhàn)：1) 需建立區(qū)別疫苗免疫與野毒感染的 (Differentiating infected from vaccinated animals，DIVA) 診斷方法；2) 需構(gòu)建病毒穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，原代單核-巨噬細(xì)胞僅限于實(shí)驗室對ASFV生物特性與免疫原性的研究，不適合用于疫苗批量生產(chǎn)，其他易感細(xì)胞傳代后病毒容易變異；3) 需建設(shè)安全的病毒操作平臺，ASFV致病性、攻毒模型、免疫效力評價需在動物生物安全三級 (ABSL3) 以上實(shí)驗室進(jìn)行；4) 安全性及免疫原性評價周期較長，基因缺失疫苗專利申請及獸藥證書的審批需要嚴(yán)格評估程序，確保毒株在宿主及環(huán)境中安全、遺傳穩(wěn)定，且免疫效力不受影響[6,22,56]。

5.7 對策與建議

目前，鑒于我國ASF疫情現(xiàn)狀，研制安全有效的疫苗刻不容緩。系統(tǒng)總結(jié)疫苗研制的失敗經(jīng)驗、著力開展基礎(chǔ)研究，為疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)：1) 解析我國流行毒株的分子特征、遺傳變異特點(diǎn)，評價其致病力；2) 采用基因重組、反向遺傳操作、CRISPR/Cas9基因編輯等生物學(xué)技術(shù)，鑒定ASFV基因的致病性、病毒復(fù)制過程中的功能，使得能有效刪除毒力基因，解決疫苗的安全問題；3) 探究病毒與宿主的相互作用，鑒定參與病毒吸附的受體、結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制、宿主免疫應(yīng)答過程中的功能；4) 研究宿主的免疫保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)外ASFV感染機(jī)制對免疫保護(hù)的影響，鑒定能提供免疫保護(hù)作用的抗原蛋白；5) 借鑒感染人的病毒研究策略，揭示ASFV免疫逃逸機(jī)制，鑒定參與免疫抑制的蛋白與信號通路，探索非敏感細(xì)胞對ASFV的嗜性；6) 加強(qiáng)國際合作與交流，建立病毒操作平臺。聯(lián)合國內(nèi)外科研人員攻克難題，如揭示疣豬等非洲野豬抗ASFV感染的分子機(jī)制、感染ASFV后的康復(fù)豬能抵抗強(qiáng)毒感染的免疫機(jī)制等科學(xué)問題，為疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)[6,22,55,57-58,62]。

6 結(jié)語與展望

目前，ASF疫情在全球呈流行擴(kuò)大趨勢，幾乎席卷我國所有地區(qū)，周邊國家蒙古、越南、柬埔寨、朝鮮也相繼暴發(fā)ASF疫情 (OIE報告數(shù)據(jù))[57]。疫情暴發(fā)后，我國立即通過封鎖隔離、撲殺等應(yīng)急措施有效減緩了ASF疫情的擴(kuò)散，部分省份已解除封鎖。然而，面對我國貿(mào)易全球化、跨國旅游及學(xué)習(xí)人員不斷增加的國際環(huán)境，人流、豬流、物流、車流量大和豬肉產(chǎn)品消費(fèi)量大的國內(nèi)環(huán)境，ASF疫情卷土重來的風(fēng)險極大。因此，需要結(jié)合我國國情和養(yǎng)豬業(yè)的現(xiàn)狀，采用傳統(tǒng)防控策略 (診斷、隔離、撲殺) 的同時，需要不斷創(chuàng)新防控技術(shù)，如提升豬場的生物安全水平、進(jìn)出口豬肉產(chǎn)品嚴(yán)格檢疫、加強(qiáng)監(jiān)測力度、設(shè)計安全的生豬調(diào)運(yùn)車輛、妥善處理尸體與污染物等全面遏制疫情進(jìn)一步擴(kuò)散[22,57,63]。

野外生存的野豬群也是ASF最大的潛在傳染源之一，由于其分布相對分散、活動范圍難以控制的特點(diǎn)導(dǎo)致疫情擴(kuò)散風(fēng)險高、防控難度大[64]。我國目前流行的ASFV均能引發(fā)野外或人工圈養(yǎng)野豬的死亡[65]。目前，野豬與家豬相互傳播ASFV的可能途徑有蜱蟲叮咬、直接接觸、混種繁殖、誤食感染病毒的肉類等。因此，調(diào)查我國野豬的分布與數(shù)量、監(jiān)測感染率、隔離或撲殺、限制活動范圍等對有效控制ASF疫情擴(kuò)散也具有重要作用。

從目前疫苗研制進(jìn)展分析，短期內(nèi)基因缺失疫苗最具潛力，鑒定并敲除毒力基因、評價免疫原性及安全性、解決商業(yè)化生產(chǎn)面臨的難點(diǎn)、加快疫苗審批進(jìn)程是當(dāng)前亟需解決的問題。從長遠(yuǎn)角度分析，未來研究需著力于ASFV的基礎(chǔ)研究，為疫苗的研制提供可靠的科學(xué)依據(jù)。此外，以病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄參與的酶或轉(zhuǎn)錄因子為靶點(diǎn)開發(fā)抗病毒的分子與藥物，或培育抗ASFV感染的豬種等策略阻斷病毒入侵宿主。

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Characteristics of African swine fever virus and difficulties in vaccine development

Jianlin Lei, Hong Cao, Lixia Yang, Qian Li, and Yingqiang Wang

College of Agriculture and Forestry, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu, China

African swine fever (ASF) is a devastating disease of pigs caused by African swine fever virus (ASFV), which is considered to be the No. 1 killer to the global pig industry. Highly virulent strains are usually responsible for the peracute and acute forms that provoke high mortality rates that may reach 100%. Since ASF was first introduced in August 2018 into China, 137 outbreaks in domestic and wild pigs had been reported from 32 provinces by June 06, 2019, causing severe socioeconomic consequences. Efforts to develop an ASFV vaccine began in the 1960s, but all failed, the major reason is the lack of in-depth research on the biological characteristics of ASFV. It will be a great challenge for China to control the spread of current ASF, develop safe and effective vaccines. In this review, we outline the biological characteristics of ASFV, including its morphology and basic structure, transmission routes, pathogenicity, genome and proteins, entry mechanism, immune escape, and analyzed the difficulties in vaccine development. We hope to provide basic information for the control of current ASF and understanding of etiology in China.

African swine fever, African swine fever virus, pig industry, biological characteristics, vaccine development

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April 17, 2019;

July 22, 2019

Supported by: Science and Technique Innovation Program for Young Teachers in Longdong University (No. XYZK1912), Research Project of Gansu Provincial Universities (No. 2016A-086).

Jianlin Lei. Tel: +86-934-8651834; E-mail: leijianlings@163.com

10.13345/j.cjb.190144

隴東學(xué)院青年科技創(chuàng)新基金(No. XYZK1912)，甘肅省高等學(xué)?？蒲许椖?(No. 2016A-086) 資助。

2019-07-30

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190729.1224.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)