歐陽(yáng)娟，薛松磊，周琦琦，崔恒宓

·綜 述·

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展及其在斑馬魚中的應(yīng)用

歐陽(yáng)娟，薛松磊，周琦琦，崔恒宓

揚(yáng)州大學(xué) 表觀遺傳學(xué)與表觀基因組學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225009

規(guī)律成簇間隔的短回文序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 是細(xì)菌和古菌中的獲得性免疫系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)能定點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。最近，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了新的CRISPR-associated (Cas)蛋白，其中由Cas12a介導(dǎo)的基因編輯能顯著降低脫靶率。文中對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷史、組成和分類、工作原理進(jìn)行概述，并總結(jié)了該系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展及在斑馬魚中的應(yīng)用。

CRISPR/Cas，基因編輯，斑馬魚

1970年，DNA重組技術(shù)的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著生物學(xué)進(jìn)入新的發(fā)展階段。20年后，科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)基因組DNA損傷修復(fù)可以通過(guò)DNA雙鏈斷裂而觸發(fā)?；蚪MDNA發(fā)生損傷后在不同條件下分別以同源重組(Homologous recombination，HR) 或非同源末端鏈接(Non-homologous end joining，NHEJ) 進(jìn)行修復(fù)。在基因組修復(fù)過(guò)程中，可能引起堿基插入或缺失，當(dāng)存在外源片段時(shí)還能引入片段替換。目前存在3種基因編輯技術(shù)，包括鋅指蛋白核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN) 技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN) 和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas) 技術(shù)。CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)由成熟的CRISPR RNA (crRNA) 與反式活性的tracrRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式，形成擁有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，它能夠指導(dǎo)該系統(tǒng)中相關(guān)的Cas9蛋白特異性識(shí)別靶標(biāo)DNA，從而引發(fā)DNA雙鏈斷裂。在核酸內(nèi)切酶、兩條RNA鏈的參與下能對(duì)特異性DNA鏈進(jìn)行程序性編輯[1]。目前CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)涉及人類疾病研究、模式生物模型構(gòu)建、微生物和植物等研究領(lǐng)域[2]。本文著重介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展，并簡(jiǎn)介該系統(tǒng)在斑馬魚研究中的應(yīng)用情況。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷史

1987年，Ishino等[3]在研究大腸桿菌中與堿性磷酸酶同功酶轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因的具體位置，及基因兩側(cè)序列的特點(diǎn)即下游存在29 nt的重復(fù)序列。2000年，Mojica等[4]通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析最終將間隔重復(fù)序列定義為一類獨(dú)特重復(fù)家族。Ruud等[5]提出了以首字母縮略詞CRISPR對(duì)微生物基因組進(jìn)行描述，將系統(tǒng)分為 3類(Ⅰ–Ⅲ)，發(fā)現(xiàn)了不同CRISPR系統(tǒng)之間存在的差異，例如CRISPR介導(dǎo)的Ⅲ-A型系統(tǒng)中Cas酶，最終不是靶向RNA序列[6]。科學(xué)家提出CRISPR序列作為免疫記憶的防御機(jī)制，可能有防止噬菌體感染等功能[7]。研究表明，CRISPR序列被轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)化成包含獨(dú)立間隔子shorter CRISPR RNAs (crRNAs) 指導(dǎo)Cas核酸酶活性[8]，Cas酶能夠獲取間隔序列，間隔序列能對(duì)噬菌體進(jìn)行防御[9-10]；此外CRISPR的形成涉及DNA的降解過(guò)程[11]。Hélène等[12]通過(guò)分析20種突變型噬菌體，發(fā)現(xiàn)噬菌體突變后，原本細(xì)菌Protospacer-adjacent motif (PAM) 序列中的NGG就不能定位，從而導(dǎo)致CRISPR系統(tǒng)不能發(fā)揮作用。CRISPR系統(tǒng)中通過(guò)crRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，不僅能夠進(jìn)行特異性靶向，而且能防止自身染色體被切斷[13]。該系統(tǒng)機(jī)理研究例如抗噬菌體菌株篩選和培養(yǎng)[14]等，促進(jìn)了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。同時(shí)，該系統(tǒng)的應(yīng)用也使更多科研人員對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行更為深入的研究。Garneau等[15]發(fā)現(xiàn)Cas9是Cas中獨(dú)特的由酶介導(dǎo)切割靶標(biāo)DNA序列的基因簇。系統(tǒng)中的-activating crRNA (tracrRNA) 可以通過(guò)廣泛保守的核酸內(nèi)切酶和CRISPR相關(guān)蛋白Csn1靶向突變的crRNA[16]。不久，Rimantas等[17]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明嗜熱鏈球菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)能轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中發(fā)揮免疫作用，抵御外源噬菌體的入侵，這一機(jī)制有利于細(xì)菌間交流，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)噬菌體的防御功能。嗜熱鏈球菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)，除能在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，其中Cas9-crRNA復(fù)合物還能在體外通過(guò)DNA特異性位點(diǎn)與crRNAs互補(bǔ)配對(duì)從而引發(fā)雙鍵斷裂，發(fā)揮切割目的DNA序列的作用[18]。研究人員根據(jù)靶標(biāo)基因，成功設(shè)計(jì)多個(gè)guide RNA (gRNA)，提高了基因編輯效率[19]。此后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)逐漸成為研究人員青睞的基因編輯工具。

2 CRISPR基因座結(jié)構(gòu)組成及系統(tǒng)分類

與之前的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR基因座結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。因CRISPR/Cas系統(tǒng)的信息加工和處理機(jī)制上存在一定差異，據(jù)此將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3型，分別為TypeⅠ、TypeⅡ和Type Ⅲ。

TypeⅠ系統(tǒng)需要多種蛋白參與才能形成具有切割功能的蛋白復(fù)合物[19]。該系統(tǒng)中CRISPR相關(guān)的復(fù)合物中的堿基序雖相似性不明顯，但是其結(jié)構(gòu)相似度高[20]。

TypeⅡ系統(tǒng)中所包含的Cas蛋白數(shù)量比TypeⅠ少，發(fā)揮作用的主要蛋白質(zhì)分子是Cas9，Cas9蛋白擁有Ruv和HNH兩種核酸酶結(jié)構(gòu)域。Type ⅡA系統(tǒng)中，產(chǎn)膿鏈球菌基因座結(jié)構(gòu)見圖1。

Type Ⅲ系統(tǒng)與TypeⅠ類似，都是多亞基的蛋白。該系統(tǒng)中作用的主要是Cas10蛋白分子，該蛋白同時(shí)具有RNA酶活性以及與TypeⅠ中復(fù)合物類似的功能[22]。

上述3種CRISPR/Cas系統(tǒng)分別擁有其自身特點(diǎn)，同時(shí)也存在相似之處。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用原理

TypeⅡ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)較其他兩種而言，相對(duì)簡(jiǎn)單，主要由重復(fù)間隔序列、編碼Cas9核酸酶序列和PAM組成[23]。行使功能時(shí)主要包括3個(gè)階段：適應(yīng)階段、CRISPR/Cas9表達(dá)和初級(jí)轉(zhuǎn)錄階段以及免疫階段[15]。

第一階段，當(dāng)外界的噬菌體或DNA入侵細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌會(huì)啟動(dòng)其自身的防御機(jī)制。由PAM指導(dǎo)gRNA與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，從而促進(jìn)Cas9蛋白結(jié)合[24]。其中，Cas9空間結(jié)構(gòu)的變化有利于Cas9與靶標(biāo)序列結(jié)合，發(fā)揮切割功能[25]。

第二階段，CRISPR/Cas9基因進(jìn)行表達(dá)。CRISPR序列在RNA聚合酶的幫助下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，然后被剪切為成熟crRNAs。最后，成熟crRNAs與tracrRNAs結(jié)合，形成雙鏈RNA也稱向?qū)NA，發(fā)揮導(dǎo)向功能。

第三階段，在向?qū)NA引導(dǎo)Cas9蛋白與靶標(biāo)序列相互作用，引發(fā)切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂 (Double-strand breaks，DSBs)，從而引發(fā)自身修復(fù)，包括同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)[26]。

以上3個(gè)階段作為一個(gè)整體，在原核生物機(jī)體中發(fā)揮免疫功能。此外，這3個(gè)階段又能分別作為一個(gè)獨(dú)立單元發(fā)揮作用。

4 CRISPR/Cas9最新研究進(jìn)展

隨著CRISPR系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，科研工作者也繼續(xù)深入對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行研究。2014年，O’Connell等[27]科學(xué)家證明Cas9 (SpCas9) 可以切割單鏈RNA (ssRNA)。在此之前，大多數(shù)科研工作者認(rèn)為Cas9只能靶向DNA，該研究結(jié)果表明CRISPR系統(tǒng)中PAM序列以寡鏈核苷酸 (PAM-presenting oligonucleotides，PAMmer)形式存在時(shí)，能提高Cas9與ssRNA親和力，進(jìn)而發(fā)揮基因編輯功能。相比原來(lái)Cas9對(duì)基因組DNA進(jìn)行編輯，這一系統(tǒng)能直接編輯ssRNA，使編輯更具高效性。該系統(tǒng)在應(yīng)用時(shí)需要注意PAMmer序列容易降解[28-29]，所以應(yīng)盡可能縮短操作時(shí)間。除上述系統(tǒng)中Cas9外，科研人員還發(fā)現(xiàn)TypeⅡ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中另一種新型核酸內(nèi)切酶Cas12a (Cpf1)。Cpf1蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：Cpf1較小，更容易進(jìn)入所研究對(duì)象中進(jìn)行切割；Cpf1通過(guò)切割作用，引導(dǎo)crRNA成熟[30]；Cpf1有兩個(gè)功能域，RuvC切割雙鏈DNA，Nuc主要起輔助作用[31]；Cpf1不僅能對(duì)PAM中富含T的序列進(jìn)行編輯[31-32]，還能對(duì)PAM遠(yuǎn)端序列進(jìn)行切割[33]；Cpf1發(fā)揮切割作用后切口處留下互補(bǔ)黏性末端，能提高DNA插入的可控性同時(shí)提高插入效率[31]；Cpf1能夠靶向ssDNA，并將其完全降解[34]；Cpf1脫靶率比Cas9蛋白脫靶率低[35]。研究表明，在某些菌株中SpCas9沒有功能，Cpf1則能在該菌株中通過(guò)同源重組介導(dǎo)高效的基因敲入和敲除，彌補(bǔ)了SpCas9在編輯對(duì)象上的局限(FnCas9和FnCpf1的CRISPR基因座結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域的比較如圖2)，拓展了CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用范圍[36]。此外，研究人員還利用Cpf1建立DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR) 系統(tǒng)，用來(lái)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)人乳頭瘤病毒，為臨床應(yīng)用提供新型平臺(tái)[34]。

圖1 產(chǎn)膿鏈球菌中CRISPR系統(tǒng)ⅡA型基因座結(jié)構(gòu)[21]

上述系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)都需要通過(guò)PAM序列定位識(shí)別，研究表明存在一種不依賴PAM序列，且能對(duì)靶標(biāo)RNA發(fā)揮識(shí)別作用的Cas9 (FnCas9) 蛋白[37]。起初是科學(xué)家在研究細(xì)菌脂蛋白對(duì)抗噬菌體反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能引發(fā)天然免疫。這個(gè)過(guò)程主要是通過(guò)small CRISPR/Cas associated RNA (scaRNA) 來(lái)抑制細(xì)菌脂蛋白內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物，當(dāng)時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/FnCas9系統(tǒng)對(duì)于抑制細(xì)菌脂蛋白非常重要[38]。之后，有研究結(jié)果表明FnCas9蛋白可以通過(guò)crRNA和tracrRNA相互作用來(lái)識(shí)別5′-NGG-3′ PAM結(jié)構(gòu)，切割雙鏈DNA (dsDNA)[39]。Price等[37]對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行改造研究，他們把人肝癌細(xì)胞中丙肝病毒基因失活，最后病毒蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，下降約60%。但系統(tǒng)定點(diǎn)編輯RNA的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[39]。不久，有研究人員將該系統(tǒng)用于植物抗病毒研究，發(fā)現(xiàn)FnCas9有利于增強(qiáng)植物對(duì)ssDNA、RNA病毒的抵抗力[40-41]。FnCas9在植物抗病領(lǐng)域顯現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步擴(kuò)展了CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域。

2016年，Abudayyeh等[42]在研究纖毛菌時(shí)發(fā)現(xiàn)在特異性RNA引導(dǎo)下，該細(xì)菌中Cas13a (LshCas13a) 蛋白能發(fā)揮抵御噬菌體入侵的功能。不久，他們又在纖毛菌.中發(fā)現(xiàn)另外一種Cas13a蛋白 (LwaCas13a)[43]。LwaCas13a蛋白通過(guò)多個(gè)靶向crRNA對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行編輯，它在CRISPR系統(tǒng)屬于二類CRISPR/Cas中的typeVI-A類型。這種新型Cas13a具有以下特點(diǎn)，Cas13a是在前間隔區(qū)側(cè)翼位點(diǎn) (Protospacer flanking site，PFS) 的存在下，由crRNA指導(dǎo)行使功能[44]；Cas13a蛋白的靶標(biāo)為單鏈RNA時(shí)，可以直接利用crRNA發(fā)揮作用[45]；Cas13a蛋白中包含兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中Arg (精氨酸) 和His (組氨酸) 突變可形成dead Cas13a (dCas13a)，該蛋白與dead Cas9 (dCas9) 作用類似，起結(jié)合靶標(biāo)作用；Cas13a蛋白還擁有兩個(gè)RNase活性中心。與之前發(fā)現(xiàn)的 (LshCas13a) 以及其他Cas13a相比，LwaCas13a的切割活性最高。隨著對(duì)Cas13a基礎(chǔ)研究的深入，科研工作者開始將其應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，例如作為哺乳動(dòng)物[43]和植物細(xì)胞[46]中特異性敲低工具；靈敏監(jiān)測(cè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[47]；依靠酶報(bào)告解鎖的高靈敏監(jiān)測(cè)系統(tǒng) (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking，SHERLOCK)[48]以及后續(xù)建立的SHERLOCK version 2 (SHERLOCKv2)[49]系統(tǒng)，以上系統(tǒng)能對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)。最近也有研究表明Cas13a能快速準(zhǔn)確檢測(cè)病毒包括人類RNA病毒[50]、埃博拉病毒[51]和H7N9病毒[52]等。

圖2 Francisella novicida U112中FnCas9和FnCpf1的CRISPR基因座結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域的比較[31]

除以上主要幾種Cas蛋白外，研究人員還發(fā)現(xiàn)幾種其他Cas蛋白。例如含有RNA引導(dǎo)的RNA酶Cas13b[53]，這種CRISPR/Cas系統(tǒng)缺少Cas1、Cas2，其基本作用機(jī)制與Cas13a一致。不過(guò)值得注意的是，Cas13b工作時(shí)需要靶點(diǎn)處存在PFS序列，這樣有利于提高Cas13b特異性切割。CRISPR/Cas13b系統(tǒng)中存在兩種蛋白Csx27與Csx28，它們分別起著抑制和加強(qiáng)Cas13b發(fā)揮識(shí)別和切割作用[53-54]。此外，科學(xué)家鑒定出VI-D型dCas13[55-56]，它能特異靶向RNA。其中來(lái)自黃色瘤胃球菌XPD3002 (CasRx) 的核酸酶效應(yīng)因子是一種可編程的RNA結(jié)合模塊，可有效靶向細(xì)胞RNA，為轉(zhuǎn)錄組工程和未來(lái)的治療開發(fā)提供了一個(gè)通用平臺(tái)。另外，研究人員通過(guò)構(gòu)建突變型Cas12b (BhCas12b) 從而提高基因編輯效率[57]。

2019年，CRISPR/cas技術(shù)在較多方面都取得進(jìn)展。除傳統(tǒng)基因編輯工具，Liu等[58]研究發(fā)現(xiàn)一種新型基因編輯工具CasX，它以獨(dú)特的存在形式結(jié)合雙鏈DNA對(duì)其進(jìn)行切割，使用低溫電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)CasX擁有RNA支架和DNA解旋結(jié)構(gòu)域等特殊結(jié)構(gòu)，不過(guò)CasX的具體工作原理還需要科學(xué)家繼續(xù)深入研究。另外，一種新型抗CRISPR蛋白也開始進(jìn)入研究人員視野。已有研究表明，可通過(guò)抑制Cas9的組裝來(lái)調(diào)節(jié)抗CRISPR蛋白的活性[59]。傳統(tǒng)CRISPR/Cas系統(tǒng)主要是依靠細(xì)菌中免疫防御機(jī)制來(lái)維持外源基因整合，現(xiàn)在研究人員發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子也可以編碼CRISPR/Cas系統(tǒng)[60]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)PAM與Cas9存在多種相互作用機(jī)制，這一發(fā)現(xiàn)也為系統(tǒng)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)[61]。研究人員在研究該系統(tǒng)的應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)在果蠅某一類細(xì)胞中Cas9蛋白表達(dá)受到抑制。這一結(jié)構(gòu)有利于揭示發(fā)育神經(jīng)元的重塑機(jī)制[62]。

綜上，CRISPR/Cas系統(tǒng)在研究人員的努力探索下，一直在不斷發(fā)展和完善。主要在以下幾個(gè)方面有所突破：1) 系統(tǒng)的靶向性。剛開始發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的靶向序列是DNA[13]，隨后發(fā)現(xiàn)Cas酶在不同情況下，靶向性存在差異，例如可以靶向dsDNA和ssRNA[39]等。2) 系統(tǒng)的定位。從一開始依靠PAM序列中NGG進(jìn)行定位[13]，到不僅能對(duì)PAM中富含T的序列進(jìn)行編輯[31-32]，還能對(duì)PAM遠(yuǎn)端序列進(jìn)行切割[31]；在特殊情況下，還存在一種不依賴PAM序列發(fā)揮識(shí)別作用的蛋白[34]；另外還能依賴PFS進(jìn)行定位[39]。3) 系統(tǒng)編輯的效率和脫靶率。主要通過(guò)發(fā)現(xiàn)新型Cas酶具有不同編輯原理[33]以及對(duì)原有的Cas酶進(jìn)行改造從而提高編輯效率降低脫靶率[57]。4) 系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域。從用于研究基因功能發(fā)展至用于植物抵抗病毒[40-41]、臨床疾病檢測(cè)[52]等方面。由此，我們可知CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ诳蒲泄ぷ髡吖餐ο?，能將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于更多的領(lǐng)域。

5 CRISPR/Cas9在斑馬魚中應(yīng)用

隨著科研人員對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的深入研究，該技術(shù)得到大力發(fā)展。CRISPR/Cas9技術(shù)開始在斑馬魚、小鼠等模式生物中應(yīng)用。通過(guò)對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行定向基因編輯，提高誘變突變率，獲得可遺傳的基因編輯個(gè)體。斑馬魚是一種模式生物，擁有較小個(gè)體、方便飼養(yǎng)、較強(qiáng)的繁殖能力、受精過(guò)程和整個(gè)發(fā)育過(guò)程都在體外完成、受精卵透明等優(yōu)點(diǎn)。1970年，美國(guó)遺傳學(xué)家Streisinger開始對(duì)斑馬魚發(fā)育和遺傳方面進(jìn)行研究[63]。之后，Westerfield總結(jié)斑馬魚相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并整理成書[64]。隨著對(duì)斑馬魚基礎(chǔ)研究的深入，加上測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚的基因與人類基因高度相似，開始建立斑馬魚疾病模型。

斑馬魚作為水生生物中的模式生物，科學(xué)家開始對(duì)其進(jìn)行研究，在方法優(yōu)化[65]、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[66]和模型構(gòu)建等多個(gè)方面已取得預(yù)期效果。2013年，Hwang等[67]首次將CRISPR/Cas9技術(shù)成功在斑馬魚上應(yīng)用，通過(guò)將Cas9和sgRNA的mRNA混合，注射至一細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中，后期檢測(cè)出斑馬魚中存在插入或刪除突變。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)注射的Cas9和sgRNA處于最佳比例時(shí)，能提高突變效率。相比之前的ZFN和TALEN，該技術(shù)能夠高效進(jìn)行基因編輯。不過(guò)，該技術(shù)在應(yīng)用中也存在脫靶的現(xiàn)象，在后續(xù)研究中需要盡可能在降低脫靶率的前提下進(jìn)行操作。例如在設(shè)計(jì)靶點(diǎn)時(shí)，盡可能選擇基因組上特異性高的序列從而降低脫靶率。同年，有研究團(tuán)隊(duì)[68]也成功將這一技術(shù)應(yīng)用于斑馬魚基因編輯中(圖3)，實(shí)驗(yàn)中選取多個(gè)基因進(jìn)行基因編輯，都獲得理想的結(jié)果。此外，他們對(duì)當(dāng)時(shí)基因編輯領(lǐng)域提出的另一論斷進(jìn)行驗(yàn)證，即在哺乳動(dòng)物和斑馬魚胚胎中DNA雙鏈斷裂后，在single-strand DNA (ssDNA) 存在的情況下能進(jìn)行同源重組。他們團(tuán)隊(duì)利用斑馬魚這一模式生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了其具有可行性。不過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)行同源重組后，斑馬魚基因組發(fā)生同源重組的區(qū)域還存在其他非ssDNA的序列，研究人員認(rèn)為可能是因?yàn)榘唏R魚體內(nèi)基因組進(jìn)行同源重組時(shí)存在其他復(fù)雜的機(jī)制。

該技術(shù)相比ZFN和TALEN具有高效、操作方便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但編輯過(guò)程中的脫靶效應(yīng)仍然不可忽視。一方面，可以利用這一新技術(shù)對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因水平操作，另一方面也需要努力探索降低脫靶的方法。對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因編輯時(shí)，除脫靶率外，我們還需考慮另外一個(gè)提高編輯效率的因素。因?yàn)榘唏R魚胚胎發(fā)育速度快，實(shí)驗(yàn)最終目的通常是為了獲得生殖系突變的個(gè)體，如果對(duì)已分裂的斑馬魚胚胎進(jìn)行基因編輯，CRISPR系統(tǒng)則只能對(duì)分裂中部分細(xì)胞起作用，所以這一技術(shù)對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因編輯時(shí)，需要確保使用一細(xì)胞期斑馬魚胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[69]。

圖3 用于斑馬魚基因編輯的Cas9和gRNA組成的CRISPR系統(tǒng)[68]

CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可以對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因敲入操作。研究表明當(dāng)斑馬魚體內(nèi)存在DSB位點(diǎn)時(shí)，主要的修復(fù)方式是NHEJ，這一修復(fù)方式能有效促進(jìn)斑馬魚體內(nèi)發(fā)生同源重組[70]。研究人員[71]起初利用該系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行基因敲入操作，將Cas9和sgRNA的mRNA注射至一細(xì)胞期的小鼠胚胎中，成功構(gòu)建插入外源片段的突變小鼠，降低脫靶率。此外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靶向一個(gè)基因的兩個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行基因敲除，獲得長(zhǎng)片段敲除的基因小鼠，為后續(xù)該系統(tǒng)的應(yīng)用提供了方向。使用這一方法對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因編輯存在局限，因?yàn)榛蚯贸僮髦饕抢肅as9蛋白切割產(chǎn)生DSB，在存在外源供體的情況下，進(jìn)行同源重組。正如前文中提到斑馬魚胚胎發(fā)育快，該系統(tǒng)還未完全發(fā)揮作用，斑馬魚胚胎已經(jīng)開始分裂。小鼠的一細(xì)胞期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，所以能使用該方法進(jìn)行基因敲入。之后，有科研人員[72]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和斑馬魚NHEJ修復(fù)原理，成功將含有熱休克蛋白啟動(dòng)子的報(bào)告基因敲入斑馬魚基因組中。該方法轉(zhuǎn)基因效率高于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因效率，為后續(xù)研究斑馬魚基因敲入提供了新思路。但該系統(tǒng)中，基因敲入部位處于順式作用元件序列附近，會(huì)影響內(nèi)源基因的表達(dá)，所以之后的研究應(yīng)盡可能在減少對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的影響的前提下，提高基因敲入效率，此外應(yīng)當(dāng)基于實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。例如通過(guò)基因插入的方式阻斷基因表達(dá)，則需要在標(biāo)簽序列后加入終止序列。

曾有研究團(tuán)隊(duì)利用格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute (NgAgo) 在斑馬魚體內(nèi)特異性敲低基因表達(dá)，引起表型改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因的DNA水平并未發(fā)生變化，僅mRNA表達(dá)降低[73]，該系統(tǒng)是否能應(yīng)用仍然需要進(jìn)一步研究。另外，有研究人員[74]設(shè)計(jì)出一種新型基因編輯工具(圖4)，即將細(xì)菌海床黃桿菌中的核酸內(nèi)切酶Ⅰ與片狀核酸內(nèi)切酶 (Flap endonucleaseⅠ，Ⅰ) 結(jié)合，形成一種新型基因編輯工具結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶 (Structure-guided endonuclease，SGN)，并且將其成功應(yīng)用于斑馬魚基因編輯中。這一技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于能進(jìn)行長(zhǎng)片段基因敲除，不足之處則是敲除效率較低，脫靶情況有待進(jìn)一步研究。

圖4 應(yīng)用于斑馬魚的SNG基因編輯技術(shù)[74]

現(xiàn)今除構(gòu)建長(zhǎng)片段基因插入的突變模型外，研究人員[75]還能利用改進(jìn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚基因組中引入點(diǎn)突變，構(gòu)建單核苷酸突變疾病模型(圖5)。主要是將CRISPR/Cas9與50 nt的ssDNA模板相結(jié)合，共同發(fā)揮作用，其中單鏈DNA模板中包含突變位點(diǎn)和PAM序列。以上系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，該單鏈不僅能引入特異性突變，而且能夠保護(hù)斑馬魚基因組中引入的單核苷酸突變。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，進(jìn)行單核苷酸敲入的限制性因素是PAM序列中特異性序列。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮到Cas9編輯效率、PAM識(shí)別兼容性和DNA靶標(biāo)特異性以及系統(tǒng)脫靶率。

我們實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)研究方向是使用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)斑馬魚基因進(jìn)行編輯，探究基因功能。2016年，我們團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在Nondret00679基因的啟動(dòng)子序列處設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，通過(guò)篩選，獲得突變型純合個(gè)體。我們利用該技術(shù)，構(gòu)建能自體表達(dá)Cas9蛋白的斑馬魚模型。研究人員利用該模型研究基因功能時(shí)，無(wú)需注射Cas9表達(dá)載體，只需注射靶向目的基因的sgRNA即可達(dá)到基因編輯的作用，使特定發(fā)育時(shí)期組織細(xì)胞中能自身表達(dá)Cas9，實(shí)現(xiàn)基因組織特異性敲除[76]。2018年，我們利用Cas9轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究斑馬魚中內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒基因的功能，發(fā)現(xiàn)敲除斑馬魚ERV基因可能通過(guò)Notch/Delta D信號(hào)通路影響斑馬魚發(fā)育[77]。目前，我們正利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚體內(nèi)的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，可以從F0代中篩選出相同突變類型，將具有相同突變類型的雌雄魚交配，F(xiàn)1代即可獲得純合突變個(gè)體，一定程度上縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。此外，有研究人員在鑒定突變的斑馬魚時(shí)，根據(jù)特定突變類型設(shè)計(jì)引物，鑒定突變個(gè)體[78]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們也采用此方法簡(jiǎn)化了鑒定步驟。

圖5 構(gòu)建斑馬魚單核苷酸突變步驟及各步驟最小時(shí)間間隔[75]

6 總結(jié)及展望

短短30年的時(shí)間，從CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)到將它發(fā)展成強(qiáng)大的基因編輯工具，這與科學(xué)家孜孜不倦的努力密不可分。水產(chǎn)生物方面，2015年美國(guó)FDA允許轉(zhuǎn)基因三文魚合法出售，它是全球首例獲批進(jìn)入市場(chǎng)進(jìn)行正常售賣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[79]。家畜方面，Qian等[80]研究人員對(duì)家豬進(jìn)行基因編輯，將抑制肌肉生長(zhǎng)基因敲除，從而獲得一種肌肉含量比基因敲除前更高的家豬。農(nóng)作物方面，通過(guò)基因編輯技術(shù)能夠更加快速獲得高產(chǎn)、抗病能力強(qiáng)的新植株[81]。如果敲除水產(chǎn)生物中抑制肌肉生長(zhǎng)的基因，敲入抗病基因，從而獲得更高產(chǎn)和抗病性更強(qiáng)的水產(chǎn)品，將極大提高經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，促進(jìn)水產(chǎn)生物的發(fā)展。

CRISPR/Cas技術(shù)是進(jìn)行基因水平研究的有利工具，該技術(shù)可操作性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)投入成本較低，獲得突變體頻率高，但是該技術(shù)的脫靶率問(wèn)題仍然不容忽視。此外進(jìn)行基因編輯的生物，如果比野生型更適應(yīng)環(huán)境，一旦該群體進(jìn)入大自然，可能會(huì)對(duì)該物種產(chǎn)生影響。另外，2018年11月，“基因編輯嬰兒”事件掀起軒然大波，涉及生命倫理[82]、法律[83]等問(wèn)題。雖然該技術(shù)發(fā)展十分迅速，但是現(xiàn)階段仍然處于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物階段，科學(xué)工作者不宜將該技術(shù)應(yīng)用于人。不過(guò)隨著科學(xué)研究不斷深入，相信研究人員能不斷更新完善CRISPR/Cas系統(tǒng)，使該技術(shù)能夠更加安全、合理、廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。

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Research progress and applications of gene editing technology CRISPR/Cas in zebrafish

Juan Ouyang, Songlei Xue, Qiqi Zhou, and Hengmi Cui

Institute of Epigenetics & Epigenomics, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) are acquired immune system in bacteria and archaea.This system is used in site-directed gene editing. Recently, scientists discovered new CRISPR-associated (Cas) proteins, in which Cas12a-mediated gene editing can significantly reduce the off-target rate. In this article, we review CRISPR/Cas system’s discovery of history, composition, classification, and working principle. The latest research progress of the CRISPR/Cas system, and its application in zebrafish are introduced.

CRISPR/Cas, gene editing, zebrafish

歐陽(yáng)娟, 薛松磊, 周琦琦, 等. CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展及其在斑馬魚中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 1–12.

Ouyang J, Xue SL, Zhou QQ, et al. Research progress and applications of gene editing technology CRISPR/Cas in zebrafish. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 1–12.

May 8, 2019;

July 8, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81773013).

Hengmi Cui. Tel: +86-514-87990309; E-mail: hmcui@yzu.edu.cn

10.13345/j.cjb.190178

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81773013) 資助。

2019-07-23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190722.1444.005.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)