李貞霞，陳倩倩,2，唐金磊，李清艷，張學禮

·工業(yè)生物技術(shù)·

甲羥戊酸途徑限速步驟研究及其在產(chǎn)番茄紅素重組大腸桿菌中的應用

李貞霞1，陳倩倩1,2，唐金磊2,3，李清艷2,3，張學禮2,3

1 河南科技學院 園藝園林學院，河南 新鄉(xiāng) 453000 2中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308 3中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

甲羥戊酸途徑 (MVA途徑) 被引入重組大腸桿菌中，能夠提高重組大腸桿菌中萜類化合物的合成能力。但因重組大腸桿菌中萜類化合物合成途徑中間產(chǎn)物積累，導致細胞生長和萜類化合物合成受到限制。本研究在穩(wěn)定表達MVA途徑以及優(yōu)化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑)、番茄紅素合成途徑關(guān)鍵基因表達的重組大腸桿菌LYC103中，用質(zhì)粒高表達MVA途徑和番茄紅素合成途徑關(guān)鍵基因，挖掘該途徑的限速步驟。結(jié)果表明，、、、和基因過表達后，細胞生長沒有明顯變化，番茄紅素產(chǎn)量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%，說明這幾個基因可能是合成番茄紅素的限速步驟。三個基因在同一操縱子上，用mRNA穩(wěn)定區(qū)(RNA stabilizing region) 進行啟動子文庫(mRSL) 調(diào)控，相當于對3個基因同時調(diào)控。用高效基因組編輯技術(shù) (CAGO) 對基因的mRNA穩(wěn)定區(qū)進行啟動子文庫的調(diào)控，得到菌株LYC104。番茄紅素產(chǎn)量與對照菌株LYC103相比增加了2倍，細胞生長提高了32%。然后，利用CRISPR-Cas9技術(shù)在染色體位點整合基因，得到LYC105菌株。與出發(fā)菌株LYC103相比，細胞生長提高了147%，番茄紅素產(chǎn)量增加了2.28倍。本研究在染色體上具有完整MVA途徑的基礎上，利用質(zhì)粒高表達單個基因挖掘限速步驟，用同源重組方法整合限速基因、解除限速，為代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)菌株提供新策略。

番茄紅素，甲羥戊酸途徑，CRISPR-Cas9系統(tǒng)，大腸桿菌

在自然界中，類胡蘿卜素是一類重要的萜類化合物，在許多光合生物(包括細菌、藻類和高等植物) 和一些非光合生物中都可以合成[1]。番茄紅素是一種 C40 的類胡蘿卜素，作為天然萜類色素，可以從西瓜、番茄等植物的成熟果實中獲得。由于番茄紅素含有特殊的分子結(jié)構(gòu)，具有很強的消除抗氧化能力和自由基能力，其抗氧化能力分別是胡蘿卜素和維生素E的3.2倍和100倍[2]。番茄紅素可以預防皮膚癌、乳腺癌、肺癌和肝癌[3-4]等疾病。因此，番茄紅素能夠被廣泛應用于保健食品、制藥和化妝品行業(yè)。

異戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲丙烯焦磷酸酯 (DMAPP) 是合成番茄紅素等萜類化合物的前體物質(zhì)[5]。在自然界中存在2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP) 和甲羥戊酸(MVA) 兩條途徑(圖1) 合成IPP和DMAPP[6-7]。大腸桿菌自身具有MEP途徑，可以合成萜類化合物的前體物質(zhì)IPP與DMAPP，還可以在大腸桿菌中引入外源甲羥戊酸途徑 (MVA途徑) 來提高萜類化合物的前體物質(zhì)供給。將合成番茄紅素的外源基因?qū)氪竽c桿菌中，分別是GGPP合成酶CrtE (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase)、八氫番茄紅素合成酶CrtB (Phytoene synthase)、八氫番茄紅素脫氫酶CrtI (Phytoene desaturase)，經(jīng)縮合、脫氫、環(huán)化等反應生成番茄紅素[8]，使不能直接生產(chǎn)類胡蘿卜素的大腸桿菌具有合成類胡蘿卜素的能力。

近年來，多個研究組對提高重組大腸桿菌中類胡蘿卜素產(chǎn)量進行了研究，主要包括MEP途徑研究[9-13]、中央代謝途徑改造[14-18]、引入MVA途徑增加前體物質(zhì)供應[19-23]等幾個方面。通過MVA途徑增加萜類化合物前體物質(zhì)供應，提高重組大腸桿菌類胡蘿卜素產(chǎn)量已經(jīng)有較為詳細研究。Vadali等將MVA途徑基因引入大腸桿菌，增加番茄紅素合成前體物質(zhì)IPP和DMAPP供應，番茄紅素產(chǎn)量提高一倍[19]。Yoon等將MVA途徑的后半部分幾個基因引入大腸桿菌中，并通過增加MVA途徑中間產(chǎn)物甲羥戊酸，成功提高番茄紅素產(chǎn)量[20-21]。Anthony等發(fā)現(xiàn)MVA途徑中甲羥戊酸激酶 (MK) 是一種限速酶[24]，通過改變限速基因啟動子和質(zhì)?？截悢?shù)，目標產(chǎn)物產(chǎn)量提高了7倍。但是，有研究表明甲羥戊酸途徑酶表達不平衡可以抑制細胞生長[5,19]。Pitera等過表達MVA途徑上游的幾個基因，MVA途徑中間體羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMGCoA) 積累，抑制了細胞生長[5,25]。馮凡等將MVA途徑分成3個代謝元件模塊，并通過調(diào)控元件的表達來增強模塊功能，從而使異戊二烯的產(chǎn)量得到提高[26]。Ye等將MVA途徑分成兩個模塊在染色體上進行整合，并對兩個模塊建庫調(diào)控，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了51%[23]。Wei等將MVA途徑分成上下游兩個模塊基于染色體多位點整合策略，提高大腸桿菌合成番茄紅素的產(chǎn)量[27]。Ye等構(gòu)建MVA途徑的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶/HMG-CoA還原酶基因 () 和基因等5個基因的RBS文庫，根據(jù)菌株顏色，篩選到使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的質(zhì)粒[22]。然后將得到協(xié)調(diào)表達的MVA途徑基因整合到產(chǎn)番茄紅素的重組大腸桿菌的染色體上，使番茄紅素產(chǎn)量提高了1.19倍[5]。

圖1 重組大腸桿菌中番茄紅素合成途徑

本研究對所得的LYC102菌株進行調(diào)控得到LYC103菌株[5,28]。LYC103菌株中MEP途徑經(jīng)過精確調(diào)控[13,18,29]，并且在染色體上含有完整的MVA途徑基因[5,28]。MVA途徑基因雖然經(jīng)過RBS建庫協(xié)調(diào)表達，但是可能因為本菌株是單拷貝的染色體表達，而Ye文獻[22]中是多拷貝的質(zhì)粒表達，并且本菌株MVA途徑操縱子又經(jīng)過了更換啟動子的改造，所以MVA途徑可能重新出現(xiàn)限速步驟。另外，在LYC103中添加了MVA途徑，進一步增加了IPP/DMAPP的供應，下游也可能成為限速步驟，因此，確保整合MVA途徑的菌株中前體物質(zhì)的平衡供給，同時尋找并解除下游合成途徑中的限速步驟。本研究首次在染色體整合完整MVA途徑基因的基礎上，將MVA途徑中的5個基因進行研究，本方法優(yōu)于對MVA途徑5個基因同時進行研究。另外對番茄紅素合成途徑下游的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶()、香葉醇轉(zhuǎn)移酶()、GGPP合成酶基因() 以單基因、多基因組合等方法在重組大腸桿菌中過量表達，從而尋找新的限速步驟，研究細胞生長和番茄紅素產(chǎn)量的變化，并進一步提高番茄紅素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；氨芐青霉素、氯霉素和SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；DNA Marker、EasyPCR SuperMix DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Gold View I型核酸染色劑，購自北京索萊寶科技有限公司；PhusionTM超保真DNA聚合酶購自NEB公司[28]；其他試劑均為分析純。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基和發(fā)酵用的LB+2%甘油培養(yǎng)基配制見參考文獻[5,32-33]。氨芐青霉素(Amp)、硫酸卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cam)終濃度分別為100、50和34 μg/mL。

保存于?80 ℃的菌種在LB平板上劃線活化，按照參考文獻方法培養(yǎng)菌體，用于番茄紅素產(chǎn)量測定[5]。

1.2.2 番茄紅素產(chǎn)量測定方法

測定番茄紅素產(chǎn)量時，先取500 μL待測菌液，參考文獻所述方法處理樣品，并用液相色譜測定番茄紅素產(chǎn)量[5,29]。

1.2.3 構(gòu)建單基因質(zhì)粒菌株

采用環(huán)形聚合酶延伸克隆(Circular polymeraseextension cloning，CPEC)[34]的方法構(gòu)建質(zhì)粒(圖2)，以質(zhì)粒pSC103為模板，通過引物99A-cpec-F/ 99A-cpec-R，擴增質(zhì)粒骨架，得到正確的片段大小后，回收PCR所得骨架。提取LYC103菌株DNA基因組作為模板，用MvaE-cpec-F/ MvaE-cpec-R、Ef-MvaS-cpec-F/Ef-MvaS-cpec-R、Sp-MK1-cpec-F/Sp-MK1-cpec-R、Sp-MvaK2- cpec-F/Sp-MvaK2-cpec-R和Sp-MvaD-cpec- F/Sp-MvaD-cpec-R為引物，擴增MVA途徑中的5個基因，分別是和基因條帶；用99A-F/99A-R為引物擴增合成番茄紅素下游的3個基因，分別是和基因條帶，得到正確大小的片段后，回收片段，然后分別和骨架用摩爾比1︰1的連接體系，使用CPEC的PCR程序進行擴增，電轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入LYC103菌株，涂cam板(氯霉素平板)，挑單克隆用引物99A-F和相應下游引物驗證，驗證正確的克隆接菌送測序，將測序正確的質(zhì)粒分別命名為質(zhì)粒pSC103-mvaE、pSC103-mvaS、pSC103-mvaK1、pSC103-mvaK2、pSC103-mvaD、pSC103-idi、pSC103-crtE和pSC103-ispA。構(gòu)建菌株及所用質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒

1.2.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化方法

根據(jù)文獻制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和條帶，完成轉(zhuǎn)化[35]。

1.2.5啟動子文庫建立

CRISPR/Cas9主要是利用靶點特異性的 RNA (Guide RNA，gRNA) 和Cas9核酸酶對特定基因位點進行切割導致突變。隨著該技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)成功在多個物種染色體上實現(xiàn)基因敲除、整合、突變等[5,30,31,36]。Zhao等構(gòu)建了一步法 CRISPR/Cas9高效基因組編輯技術(shù)(CAGO)，該方法可以在基因組任意位點實現(xiàn)非脫靶編輯。整個過程僅需要一個片段和一個通用pCAGO質(zhì)粒，無需構(gòu)建新的gRNA質(zhì)粒[30]。本研究用CAGO技術(shù)，對構(gòu)建mRS(mRNA 穩(wěn)定區(qū))啟動子文庫[37]。MvaST-594-I-F/MvaST-BsaI-CGCT-R引物，以LYC103菌株基因組為模板，擴增得500 bp左右條帶，作為同源重組的上同源臂。設計簡并引物MvaK1-mRSL-down (NNNNNNNNNNNNN NNNNN)，本引物包括50 bp下同源臂片段、18個兼并堿基(mRS文庫區(qū)) 和擴增M1-P的20 bp同源區(qū)。以MvaK1-mRSL-down/Refull_BsaI_F為引物，以.MG1655-?基因組為模板，擴增約1.2 kb條帶，該片段包括氯霉素抗性基因、Cas9識別序列、啟動子文庫和下游50 bp同源臂。兩片段以等摩爾混合進行Golden Gate連接[38]，連接后用于一步同源重組。將得到的重組條帶，轉(zhuǎn)化含帶有pCAGO質(zhì)粒的LYC103菌株，30 ℃、75 r/min復蘇4 h，涂含有34 μg/mL 氯霉素的LB平板，30 ℃培養(yǎng)過夜。隨機挑選14個單克隆進行驗證，驗證引物為Mvas-1000-I-F/Mvak1-316-I-r，得到1.6 kb條帶即為正確。挑選正確的菌株于37 ℃進行搖瓶發(fā)酵，測定番茄紅素產(chǎn)量。將產(chǎn)量最高菌株按照Zhao的方法[30]，去除cam抗性基因及多余序列，得到除啟動子之外沒有多余序列的菌株LYC104。LYC104菌株構(gòu)建流程如圖3所示，其中L-short和mRS文庫區(qū)屬于M1-P的一部分。敲除marker后，在基因前僅留M1-P啟動子序列。

圖2 CPEC構(gòu)建質(zhì)粒

1.2.6 CRISPR-Cas9技術(shù)輔助整合基因

采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)輔助整合基因[31]。首先構(gòu)建質(zhì)粒pLacZ-N20-trc-idi，以pLacZ-N20質(zhì)粒為模板，用lacZ-B-BsaI-F2/lacZ-B-BsaI-R2為引物，PCR擴增骨架，以pSC103-idi質(zhì)粒為模板，用Ptrc-BsaI-AGCT-F/BS-idi-BsaI-R為引物，擴增trc-idi條帶，兩片段以等摩爾混合進行Golden Gate連接，并加入Ⅰ酶消化模板，然后將連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)商品感受態(tài)Trans-T1，涂于含有34 μg/mL cam的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。用P15A-yz-up/99A-CPEC-R驗證得到2 kb條帶即為正確。在LYC104菌株中轉(zhuǎn)化pRed_Cas9和pLacZ-N20-trc-idi質(zhì)粒，阿拉伯糖來誘導cas9表達，切割染色體上的N20區(qū)域； pLacZ-N20-trc-idi提供上下同源臂、trc啟動子和基因進行染色體整合。整合后用99A-F/ LacZ-yz-down引物進行驗證，測序正確菌株命名為LYC105。驗證引物見表2。

圖3 LYC104構(gòu)建流程圖

2 結(jié)果與分析

2.1 單基因質(zhì)粒構(gòu)建

通過將番茄紅素合成基因過表達的形式來尋找番茄紅素合成途徑中的限速步驟。以pSC103質(zhì)粒為模板擴增大小為5 kb的骨架，以LYC103菌株DNA基因組為模板，將、和基因以及、和基因進行PCR擴增，依次得到片段大小為2 412 bp、1 152 bp、879 bp、954 bp、1 011 bp、1 049 bp、900 bp和 919 bp。核酸電泳圖如圖4所示。采用CPEC方法將單個基因連接到中pSC103質(zhì)粒上，然后電轉(zhuǎn)化菌株LYC103，取陽性單克隆用99A-F和擴增相應基因的下游引物進行菌落PCR，驗證正確連接質(zhì)粒。將PCR驗證正確質(zhì)粒送樣測序，測序正確的質(zhì)粒分別依照表1中的質(zhì)粒名稱進行命名。

表2 本研究所用的引物[28]

圖4 PCR驗證單基因質(zhì)粒構(gòu)建

2.2 單基因過表達對番茄紅素產(chǎn)量的影響

將所構(gòu)建的單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有MVA途徑的LYC103番茄紅素菌株，發(fā)酵測定細胞生長和番茄紅素產(chǎn)量，發(fā)酵結(jié)果如圖5所示；過表達番茄紅素產(chǎn)量和單位細胞產(chǎn)率明顯降低，分別是LYC103的51%和62%；過表達番茄紅素產(chǎn)量和單位細胞產(chǎn)率有一定降低，說明當前條件下再表達MVA途徑的前兩個基因，可能會使MVA途徑中間體物質(zhì)積累，進一步影響類胡蘿卜素的合成和細胞生長。

質(zhì)粒過表達和基因后，番茄紅素產(chǎn)量相對于LYC103依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%。其中含有pSC103-idi質(zhì)粒的番茄紅素單細胞產(chǎn)量最高，從32.95 mg/g增加到53.52 mg/g DCW，是對照菌株的1.63倍。文獻報道大腸桿菌引入MVA途徑后，會因為MVA途徑各基因表達不協(xié)調(diào)引起中間代謝物積累，包括甲羥戊酸及其多種衍生物的生成會產(chǎn)生細胞毒性，從而影響細胞生長[24-25]。過表達可以減少MVA等中間代謝物積累，促進細胞生長，因此本研究中質(zhì)粒表達基因，菌株番茄紅素單位細胞產(chǎn)量都有一定提高(圖5B)；另外，MVA途徑的引入同時也提高了前體物質(zhì)IPP的積累，基因過量的表達來平衡IPP和DMAPP的量，基因過量表達可以減少IPP積累和平衡外源MVA途徑。促使下游產(chǎn)物的順利合成，使番茄紅素產(chǎn)量提高。

圖5 過表達單基因菌株的番茄紅素產(chǎn)量

2.3 mvaK1-mRSL文庫的構(gòu)建

基因以質(zhì)粒形式在大腸桿菌中表達時會因為質(zhì)粒不穩(wěn)定影響番茄紅素的產(chǎn)量，還會造成代謝負荷等弊端[39-40]。產(chǎn)番茄紅素的重組大腸桿菌LYC103中，三個基因在同一操縱子上，用啟動子的mRNA穩(wěn)定區(qū)(mRS)文庫調(diào)控，相當于對3個基因同時調(diào)控。本研究采用CAGO技術(shù)一步同源重組方法在染色體上直接對基因進行調(diào)控，在mRNA穩(wěn)定區(qū)設計簡并引物構(gòu)建mRS文庫。

首先準備重組片段。圖6A中1、2泳道為重組片段的上同源臂的PCR驗證條帶，3、4泳道為重組片段中下同源臂、cam抗性基因、gRNA-PAM的PCR驗證條帶。用Golden Gate方法將兩片段以等摩爾混合，用T4 DNA連接酶和Ⅰ酶切連接。得到約1.7 kb片段(見圖6B)，直接轉(zhuǎn)化帶有pCAGO質(zhì)粒的LYC103感受態(tài)，在含有amp和cam抗生素的LB固體平板上篩選。然后隨機選單克隆用cat-up/ Mvak1-316-I-r進行PCR驗證，得到約1.6 kb的條帶為正確克隆，部分PCR驗證電泳結(jié)果見圖6C，挑正確的單克隆接菌發(fā)酵。

2.4 mvaK1啟動子文庫建立對番茄紅素產(chǎn)量的影響

隨機選取14株在mRNA穩(wěn)定區(qū)文庫調(diào)控基因正確的菌株進行發(fā)酵，結(jié)果見圖7。調(diào)控基因后，番茄紅素產(chǎn)量為56.08– 196.07 mg/L，單位細胞產(chǎn)量為25.35–73.69 mg/g。其中番茄紅素產(chǎn)量最高的菌株是LYC103-7，番茄紅素產(chǎn)量是對照的2倍；600從8.65提高到11.38，提高了32%，基因的調(diào)控使細胞生長變快，減少了中間產(chǎn)物的積累和細胞毒性。

三個基因的協(xié)調(diào)表達提高了前體物質(zhì)IPP和DMAPP的供應，使番茄紅素產(chǎn)量得到進一步的提高。

圖6 mvaK1-mRSL文庫的構(gòu)建及驗證

圖7 mvaK1啟動子文庫對番茄紅素產(chǎn)量的影響

本研究采用文獻所述方法消除LYC103--7中cam抗性基因，得到不含任何抗生素的標記的菌株，命名為 LYC104。

2.5 單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LYC104菌株對番茄紅素產(chǎn)量的影響

LYC104中經(jīng)過了文庫調(diào)控后，番茄紅素產(chǎn)量得到提高，驗證了為當前菌株的限速步驟并消除限速。為了研究在LYC104中和基因是否同樣為限速步驟，本研究在LYC104中用單基因質(zhì)粒過表達和基因，結(jié)果如圖8所示。添加pSC103-和pSC103-后，番茄紅素產(chǎn)量和LYC104相比沒有明顯差別(>0.05)，而添加pSC103-質(zhì)粒后番茄紅素菌株細胞生長最好、番茄紅素產(chǎn)量最高。細胞600是LYC104的1.15倍，番茄紅素產(chǎn)量提高了34.4%，說明在建庫調(diào)控的番茄紅素高產(chǎn)菌株LYC104中，依然是限速步驟。因為LYC104中MVA途徑得到進一步優(yōu)化表達，而使MVA途徑催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為IPP增加，需要繼續(xù)高表達基因來平衡兩者之間的轉(zhuǎn)化。

圖8 單基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LYC104菌株對番茄紅素產(chǎn)量的影響

2.6 調(diào)控idi基因?qū)Ψ鸭t素產(chǎn)量的影響

為了穩(wěn)定表達基因，本實驗CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在LYC104菌株的位點對基因進行染色體整合，驗證測序正確后，將該菌株命名為LYC105。發(fā)酵結(jié)果見表3，與出發(fā)菌株LYC103相比，LYC105的細胞生長提高了147%，番茄紅素產(chǎn)量增加了2.28倍；與對照菌株LYC104相比，LYC105的細胞生長提高了90.1%，番茄紅素產(chǎn)量增加了1.95倍。結(jié)果見表3。

表3 調(diào)控idi基因?qū)Ψ鸭t素產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

本研究在染色體含有MVA和MEP兩個途徑的重組番茄紅素菌株LYC103 基礎上，通過以單質(zhì)粒表達的形式將MVA途徑中的和五個基因以及番茄紅素合成途徑下游的和三個基因進行過表達，系統(tǒng)研究了各基因表達對番茄紅素產(chǎn)量和細胞生長的影響。結(jié)果表明，限制番茄紅素產(chǎn)量和細胞生長的主要因素是前體供應不足和代謝過程中有毒中間體的過度積累，MVA途徑后半部分基因和基因高表達，能明顯提高番茄紅素產(chǎn)量和細胞生長。與之前研究結(jié)果類似[41-42]。

本研究中三個基因在同一個操縱子中且位置相鄰，對基因進行調(diào)控，相當于對后面兩個基因也進行了調(diào)控。本研究對基因的mRNA穩(wěn)定區(qū)進行了啟動子文庫的調(diào)控，其番茄紅素產(chǎn)量相比對照菌株LYC103增加了2倍，細胞生長提高了32%。調(diào)控基因后，可以減少有毒中間物質(zhì)HMG1-CoA的積累，從而增加細胞生長和番茄紅素的產(chǎn)量。

添加MVA途徑并協(xié)調(diào)表達，進一步增加了IPP的合成，文獻報道大量積累IPP，會產(chǎn)生細胞毒性，從而影響細胞生長和萜類物質(zhì)的合成[43-44]，在重組番茄紅素菌株LYC104基礎上對基因進行染色體整合，來解決前體物質(zhì)IPP和DMAPP供應不平衡等問題，番茄紅素產(chǎn)量增加了127%。與以前文獻報道完全用質(zhì)粒表達MVA途徑基因相比[19-23]，本研究所得菌株LYC105性狀更穩(wěn)定，添加單個基因研究限速步驟的方法更簡單，為重組大腸桿菌表達多個外源基因的研究提供新思路。

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Role of rate-limiting step of mevalonate pathway in improving lycopene production in

Zhenxia Li1, Qianqian Chen1,2, Jinlei Tang2,3, Qingyan Li2,3, and Xueli Zhang2,3

1 School of Horticulture and Garden, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453000, Henan, China 2 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

The introduction of the mevalonate pathway (MVA pathway) in recombinantcan improve the synthesis of terpenoids. But the imbalance expression of MVA pathway genes and accumulation of intermediates inhibit cell growth and terpenoids production. In this study, each gene of MVA pathway and key genes of lycopene synthesis pathway were cloned in plasmid to express in the recombinantLYC103 with optimizing the expression of the key genes of the 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP pathway), chromosome recombinant MVA pathway and the lycopene synthesis pathway. The results showed that the overexpression of,,andgenes did not affect the cell growth, while lycopene production increased by 13.5%, 16.5%, 17.95%, 33.7% and 61.1% respectively, indicating that these genes may be the rate-limiting steps for the synthesis of lycopene.,,of MVA pathway were the rate-limiting steps and were in an operon. The,,operon was regulated by mRS (mRNA stabilizing region) library in front of, obtaining strain LYC104. Lycopene yield of LYC104 was doubled and cell growth was increased by 32% compared with the control strain LYC103. CRISPR-cas9 technology was used to integrateinto chromosome atsite to obtain LYC105 strain. Cell growth of LYC105 was increased by 147% and lycopene yield was increased by 2.28 times compared with that of LYC103. In this study, each gene of lycopene synthesis pathway was expressed in plasmid to certify the rate-limiting gene based on the complete MVA pathway on the chromosome. Then the rate-limiting gene was integrated in chromosome with homologous recombination to release the rate-limiting, which providing a new strategy for the construction of high-yield strains for metabolic engineering.

lycopene, mevalonate pathway, CRISPR-Cas9 system,

李貞霞, 陳倩倩, 唐金磊, 等. 甲羥戊酸途徑限速步驟研究及其在產(chǎn)番茄紅素重組大腸桿菌中的應用. 生物工程學報, 2020, 36(1): 77–89.

Li ZX, Chen QQ, Tang JL, et al. Role of rate-limiting step of mevalonate pathway in improving lycopene production in. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 77–89.

May 13, 2019;

August 30, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31770059, 31770105), the STS Project of the Chinese Academy of Sciences (No. KFJ-SW-STS-164), Key Projects of Henan Provincial Universities (No. 18A210015).

Qingyan Li. Tel/Fax: +86-22-84861946; E-mail: li_qy@tib.cas.cn

10.13345/j.cjb.190189

國家自然科學基金(Nos. 31770059, 31770105)，中國科學院STS項目(No. KFJ-SW-STS-164)，河南省高等學校重點項目 (No. 18A210015) 資助。

2019-10-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191010.0957.005.html

(本文責編 陳宏宇)