葉金統(tǒng)，孟頌東，朱曉東

·綜 述·

雙特異抗體的研究進(jìn)展

葉金統(tǒng)1，孟頌東2，朱曉東1

1 北京康明百奧新藥研發(fā)有限公司，北京 101111 2 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

雙特異抗體是指可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同抗原或一個(gè)抗原不同表位的特殊抗體，目前已有3個(gè)雙特異抗體批準(zhǔn)上市，還有很多個(gè)雙特異抗體處于臨床或臨床前研究階段。文中就雙特異抗體的發(fā)現(xiàn)、制備方法、結(jié)構(gòu)類型和設(shè)計(jì)策略、作用機(jī)制以及目前研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

雙特異抗體，治療性藥物，抗腫瘤藥

雙特異抗體是指可以結(jié)合兩個(gè)不同抗原或一個(gè)抗原不同表位的特殊抗體，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在腫瘤免疫治療及自身免疫疾病等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

雙特異抗體最早出現(xiàn)在1961年，Nisonoff等將兩種結(jié)合不同抗原的多克隆抗體的Fab’片段用化學(xué)交聯(lián)劑制成雙特異抗體[1]。在20世紀(jì)80年代，隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，雙特異抗體的研究也呈爆發(fā)式增長，并在20世紀(jì)90年代，已經(jīng)有雙特異抗體進(jìn)入臨床[2-3]，但由于臨床效果不佳，未能有批準(zhǔn)的雙特異抗體上市，雙特異抗體的研究歸于沉寂。近年來，基因工程的飛速發(fā)展，也帶動(dòng)了雙特異抗體的研發(fā)進(jìn)展[4]。2009年，由歐洲Trion Pharma公司開發(fā)的雙特異抗體Catumaxomab獲得歐盟藥品管理 (EMA) 批準(zhǔn)，用于治療惡性腹水，是全球第一個(gè)批準(zhǔn)上市的雙特異抗體藥。2014年，Amgen公司研制的Blinatumomab雙特異抗體獲得FDA批準(zhǔn)用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。2017年11月，羅氏制藥公司研制的Emicizumab被FDA批準(zhǔn)上市，用于A型血友病的治療。隨著雙特異抗體的臨床應(yīng)用成功及批準(zhǔn)上市，雙特異抗體已成為藥物研究中的一個(gè)新熱點(diǎn)，目前跨國藥企和眾多生物技術(shù)公司都在開發(fā)雙特異抗體，大部分處于臨床或者臨床前研究。文中就雙特異抗體的制備方法、結(jié)構(gòu)類型和設(shè)計(jì)策略、作用機(jī)制、目前研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡要綜述。

1 雙特異抗體的制備方法

雙特異抗體含有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合域，在自然狀態(tài)下是不存在的，只能通過人工制備。雙特異的制備從最初將兩個(gè)不同的、純化的單克隆抗體化學(xué)偶聯(lián)，或者將2個(gè)表達(dá)不同單克隆抗體的雜交瘤融合，構(gòu)建4倍體雜交瘤，到近年來采用基因工程重組技術(shù)法構(gòu)建各種類型的雙特異抗體等[5]，每一種制備方法都會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。

1.1 化學(xué)偶聯(lián)法

化學(xué)偶聯(lián)法的原理是通過化學(xué)偶聯(lián)劑 (如領(lǐng)苯二馬來酰亞胺、二硫代?；郊姿岬? 將兩個(gè)完整IgG或者F (ab′)2抗體片段通過二硫鍵或硫醚鍵連接形成雙特異性抗體[1,6]。該方法可快速、大量制備雙特異性抗體，但在交聯(lián)過程中抗體時(shí)有失活，而且難以保證產(chǎn)物的勻質(zhì)性。

1.2 雙雜交瘤法

雙雜交瘤法是將兩株不同的雜交瘤細(xì)胞融合成雙雜交瘤細(xì)胞株，再通過雜交瘤篩選法克隆靶細(xì)胞，但是，雙雜交瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生兩種重鏈和兩種輕鏈，理論體系中會(huì)有10種不同組合的抗體存在，其中有9種輕、重鏈配對(duì)產(chǎn)物不是所需要的，只有輕鏈與重鏈同源配對(duì)、重鏈與重鏈異源配對(duì)這一種組合配對(duì)方式產(chǎn)生的抗體才是所需要的BsAb，大約僅占10%–50%。而且，從這些結(jié)構(gòu)相似的抗體中將所需的BsAb分離純化也費(fèi)時(shí)費(fèi)力，為抗體純化及質(zhì)控帶來巨大挑戰(zhàn)。利用雜交瘤方法制備雙特異抗體隨機(jī)性較大、效率低，但是抗體的生物活性較好，抗體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定[7]。

1.3 基因工程法

基因工程法制備原理就是利用基因工程技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)的抗體進(jìn)行基因工程方面的改造，從而形成多種形式的雙特異抗體，基因工程的飛速發(fā)展也為雙特異抗體的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，利用基因工程技術(shù)制備雙特異抗體是目前最常用的制備方法[8]。

2 雙特異抗體的結(jié)構(gòu)分類

一般來說，雙特異抗體按其結(jié)構(gòu)來說可分為兩大類，一類是含有Fc區(qū)的雙特異抗體，另一類是缺乏Fc區(qū)的雙特異抗體[9](圖1)。

2.1 含F(xiàn)c區(qū)雙特異抗體

傳統(tǒng)的單克隆抗體含有Fc區(qū)，因?yàn)樗拇嬖?，相比于其他生物工程藥物如?xì)胞因子類，抗體藥物的臨床應(yīng)用具備以下幾方面的優(yōu)勢(shì)：1) Fc區(qū)含有蛋白A/G的識(shí)別區(qū)，工業(yè)化規(guī)?？刹捎酶咛禺愋杂H和層析的方法，對(duì)目標(biāo)藥物蛋白進(jìn)行最高效的模式化分離純化。2) Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)功能在很多臨床適應(yīng)癥如癌癥治療上有很重要的附加效應(yīng)，如抗體依賴的細(xì)胞毒性 (ADCC)、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用 (CDC)，這些功能是某些抗體藥物體現(xiàn)藥效的根本。3) 新生兒Fc受體 (FcRn) 主要表達(dá)在造血細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等表面，當(dāng)抗體的Fc通過與新生兒Fc受體的結(jié)合而進(jìn)入胞飲再循環(huán)過程而避免溶酶體途徑降解，導(dǎo)致在血液里抗體有更長的半衰期[10]。含F(xiàn)c區(qū)雙特異抗體可以利用Fc的這3個(gè)特點(diǎn)使其本身有更好的臨床應(yīng)用。目前含F(xiàn)c雙特異抗體制備技術(shù)平臺(tái)主要有Triomab quadroma、2 in 1-IgG、KIH IgG、CrossMab、 DVD-Ig、Mebs-Ig等。

2.1.1 Triomab quadroma雙特異性抗體

Triomab quadroma雙特異性抗體技術(shù)是將靶向CD3的大鼠源IgG2b抗體和靶向腫瘤細(xì)胞的小鼠源IgG2抗體進(jìn)行體細(xì)胞雜交而獲得的雙特異抗體，該平臺(tái)是由Fresenius和Trion Pharma公司合作開發(fā)，解決了重鏈與重鏈、輕鏈與輕鏈錯(cuò)配問題。純化過程利用大鼠和小鼠抗體對(duì)蛋白質(zhì)A不同的親和力來獲得雙特異性抗體。Triomab抗體通過抗體的兩個(gè)不同抗原結(jié)合域分別結(jié)合腫瘤細(xì)胞及T細(xì)胞，并通過抗體Fc功能區(qū)募集效應(yīng)功能細(xì)胞 (如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等) 形成復(fù)合體，刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子清除腫瘤細(xì)胞[11]。Catumaxomab (EpCAM×CD3)就是基于該平臺(tái)技術(shù)開發(fā)的雙特異抗體。

2.1.2 KIH IgG (Knob-in-hole)雙特異性抗體

KIH (Knob-in-hole) 技術(shù)由Genentech公司開發(fā)，利用基因工程技術(shù)對(duì)重鏈進(jìn)行工程化改造以獲得異源二聚體，是解決重鏈錯(cuò)配問題的一大突破。組成雙特異性抗體的兩條重鏈，在其中一條重鏈的CH3區(qū)引入突變，形成一個(gè)突起的類似“杵”的結(jié)構(gòu) (Knob)，在另一條重鏈CH3區(qū)引入突變形成一個(gè)凹陷的類似“臼”的結(jié)構(gòu) (Hole)，利用兩條重鏈CH3區(qū)域的空間位阻效應(yīng)利于兩種異源抗體重鏈的正確裝配。突變后，產(chǎn)品正確裝配率可提高至90%以上，能夠滿足規(guī)模化生產(chǎn)的要求[12]。但是該技術(shù)還存在一個(gè)輕鏈錯(cuò)配問題，即不同的輕鏈與重鏈異源二聚體會(huì)發(fā)生隨機(jī)配對(duì)，可通過采用一個(gè)能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原的共同輕鏈解決，然而不是所有的抗體都適用。因此，又出現(xiàn)很多在該技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出不同的解決輕鏈問題的雙特異抗體結(jié)構(gòu)。

2.1.3 CrossMAb雙特異性抗體

CrossMAb 是一種抗體Fab抗體臂的功能區(qū)互換的技術(shù)，是由羅氏開發(fā)的技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)是在“knob-in-hole”技術(shù)基礎(chǔ)上，對(duì)雙特異IgG抗體Fab臂功能區(qū)的交換形成，通過交換一條重鏈的CH1結(jié)構(gòu)和對(duì)應(yīng)輕鏈的CL結(jié)構(gòu)域，而另外一條重鏈及輕鏈保持不變，經(jīng)過交換的抗體輕鏈不易與未改造抗體的重鏈發(fā)生錯(cuò)配，由此產(chǎn)生輕重鏈的正確配對(duì)，這種互換技術(shù)保留了原始的抗原親和力。同時(shí)結(jié)合KIH結(jié)構(gòu)又可促進(jìn)重鏈異源結(jié)合，進(jìn)一步提高正確裝配率[13]。

2.1.4 Ortho-Fab IgG雙特異抗體

Ortho-Fab IgG技術(shù)是Liu等報(bào)道的一種克服輕鏈錯(cuò)配的設(shè)計(jì)策略。該技術(shù)是在“knob-in-hole”技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)建模，結(jié)合X晶體衍射技術(shù)將其中一個(gè)抗體的VH/VL及CH1/CL進(jìn)行正交互補(bǔ)突變?cè)O(shè)計(jì)，減少輕鏈錯(cuò)配現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)雙特異抗體[14]。

2.1.5 YBODY雙特異抗體

YBODY技術(shù)是由武漢友芝友公司開發(fā)的雙特異技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)是在“knob-in-hole”技術(shù)的基礎(chǔ)上，形成異源二聚體的其中一條為正常重鏈，另外一條為Fc功能區(qū)的N端連接scFv，形成了不對(duì)稱的雙特異抗體，該抗體在生產(chǎn)工藝、藥效和生物穩(wěn)定性等方面獲得重大突破，臨床開發(fā)前景廣闊[15]。

2.1.6 Two-in-one雙特異性抗體

Two-in-one抗體最早是由Genentech公司Bostrom等開發(fā)而成，該技術(shù)也是用來解決輕重鏈錯(cuò)配及重鏈與重鏈錯(cuò)配問題，通過對(duì)可變區(qū)進(jìn)行工程化改造并通過噬菌體展示技術(shù)獲得識(shí)別兩個(gè)不同靶點(diǎn)的雙特異抗體，又稱為DAF抗體(Dual Action Fab，DAF)[16]。Two-in-one雙特異性抗體具有正常IgG抗體的結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性良好，易于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，技術(shù)難點(diǎn)在于前期的工程化過程。

2.1.7 DVD-Ig雙特異性抗體

DVD-Ig (Dual Variable Domain-Ig) 技術(shù)由Abbott開發(fā)而成，通過在正常IgG抗體的輕鏈和重鏈的N末端分別連接另一個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域以形成雙特異抗體，即第2個(gè)抗體VH與第一個(gè)抗體VH融合在一起，第2個(gè)抗體VL與第一個(gè)抗體VL融合在一起，產(chǎn)生一個(gè)對(duì)每個(gè)抗原有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的四價(jià)分子。這類分子與正常單抗具有相同的Fc區(qū)，可用通用抗體技術(shù)進(jìn)行純化生產(chǎn)[17]。

2.1.8 IgG-scFv及scFv2-Fc雙特異抗體

IgG-scFv雙特異性抗體是將單鏈抗體(scFv)連接在正常IgG抗體分子Fc功能區(qū)的C末端，產(chǎn)生一個(gè)每個(gè)抗體都有兩個(gè)不同結(jié)合域的四價(jià)分子，通過分子兩端的不同的CDR區(qū)與靶分子結(jié)合實(shí)現(xiàn)雙功能。而scFv2-Fc分子與IgG-scFv結(jié)構(gòu)類似，是將兩個(gè)scFv分子分別連接在Fc功能區(qū)的兩端，形成雙功能區(qū)[9]。

2.1.9 FIT-Ig雙特異抗體

FIT-Ig (Fabs-In-Tandem) 是上海岸邁生物公司開發(fā)的，它是將兩個(gè)Fab別連接在抗體兩個(gè)重鏈的N端，但將新的Fab抗體臂的功能區(qū)進(jìn)行互換，即新Fab的輕鏈CL和重鏈CH1互換，形成了250 kDa的四價(jià)蛋白，構(gòu)建時(shí)是用3個(gè)片段共同轉(zhuǎn)染到一個(gè)細(xì)胞里，因?yàn)榉肿記]有Fc的突變，也沒有單鏈抗體和linker等不穩(wěn)定因素的引入，臨床前表現(xiàn)較好的藥效和成藥性[18]。

2.1.10 Mebs-Ig雙特異抗體

Mebs-Ig (Mab editing bispecific immuoglobin)是北京康明百奧新藥研發(fā)有限公司開發(fā)的新型雙特異平臺(tái)，具有很多“best-in-class”的特點(diǎn)：首先采用糖工程修飾的方法，將抗體的Fc糖鏈的巖藻糖敲除，大大增強(qiáng)了抗體的ADCC以及ADCP的能力，能招募更多的效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞。同時(shí)使用共同輕鏈的方法，可將2個(gè)新Fab分別連接在抗體2個(gè)重鏈的N端，沒有功能區(qū)的互換，解決了雙抗鏈之間錯(cuò)配的問題。Mebs-Ig屬于四價(jià)雙特異分子，能保持更好的抗體親和力。另外分子形式也沒有不穩(wěn)定的單鏈抗體或者Linker結(jié)構(gòu)。因?yàn)橹挥?個(gè)片段，細(xì)胞株構(gòu)建更為簡單[19]。

2.2 不含F(xiàn)c區(qū)雙特異抗體

不含F(xiàn)c區(qū)雙特異性抗體缺失了Fc區(qū)，由兩個(gè)抗體的VH區(qū)及VL區(qū)組成或者由Fab片段組成，這類抗體分子體積小，利于組織滲透 (如在腫瘤治療中)，但由于缺乏Fc區(qū)，不能介導(dǎo)Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，完全依賴其抗原結(jié)合能力來發(fā)揮療效，且半衰期通常較短，在體內(nèi)會(huì)快速發(fā)生腎清除。目前，此類雙特異性抗體主要有BiTE、DART、TandAbs、bi-Nanobody等。

2.2.1 BiTE雙特異抗體

BiTE是由德國Micromet公司 (2012年被Amgen收購) 開發(fā)而成，是一種串聯(lián)型的scFv，將一個(gè)結(jié)合T細(xì)胞抗原 (通常是CD3) 的scFv和結(jié)合腫瘤抗原的scFv串聯(lián)而成。BiTE可同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)T細(xì)胞靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。BiTE的分子量為55–60 kDa，屬于小分子，滲透性好，可以到達(dá)大分子抗體難以到達(dá)的部位與抗原發(fā)生結(jié)合。但親和力較低，在體內(nèi)的半衰期較短[20]。Blinatumomab是基于該平臺(tái)開發(fā)的雙特異抗體藥物的典型代表。

2.2.2 DART雙特異性抗體

DART (Dual affinity re-targeting) 是由MacroGenics公司開發(fā)而成，是一種由兩條多肽鏈結(jié)合形成的異源二聚體抗體，首先使用linker分別將一個(gè)抗體可變區(qū)的VH和VL與另一個(gè)抗體可變區(qū)的VL和VH序列連接形成scFv，之后共表達(dá)兩個(gè)scFv片段，利用抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域鏈間相互作用形成雙特異片段，并在兩條多肽鏈的C末端引入了半胱氨酸形成鏈間二硫鍵，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[21]。

2.2.3 TandAbs雙特異性抗體

TandAbs是由Affimed公司開發(fā)的一類四價(jià)的雙特異抗體，包含4個(gè)scFv結(jié)構(gòu)域。TandAbs由兩條肽鏈形成，其中每條肽鏈的N端到C端按VL1-VH2-VL2-VH1的順序排列，兩條肽鏈反向配對(duì)形成同源二聚體分子。TandAbs 相對(duì)分子質(zhì)量約為110 kDa，介于全分子抗體及BiTE之間，比較其他重組抗體片段有更長的半衰期。TandAbs可以同2種抗原結(jié)合，并且每種抗原都有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。TandAbs可以招募效應(yīng)細(xì)胞 (T細(xì)胞或NK細(xì)胞)，并對(duì)靶細(xì)胞 (腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞) 起到殺傷效果。當(dāng)TandAbs連接了T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞后，T細(xì)胞會(huì)被激活，釋放穿孔素、顆粒酶、溶酶體酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)被傳送到T細(xì)胞的細(xì)胞膜并分泌到細(xì)胞外的基質(zhì)中。穿孔素會(huì)使靶細(xì)胞內(nèi)形成氣孔，從而促進(jìn)裂解物質(zhì)的進(jìn)入，進(jìn)而引起靶細(xì)胞的裂解[22]。

2.2.4 Bi-Nanobody雙特異抗體

Bi-Nanobody是Ablynx公司 (2018年被Sanofi收購) 開發(fā)，是一種單域抗體，來自于駱駝及美洲駝體內(nèi)的一種缺失輕鏈的重鏈抗體的可變區(qū)片段。這類抗體的主要優(yōu)點(diǎn)是分子小、穩(wěn)定性高、易于連接，分子小使其易于穿過較深的組織并靶向一些正常IgG抗體難以到達(dá)的表位。不過，缺乏Fc的納米抗體在體內(nèi)的循環(huán)半衰期較短，可以通過融合人血清白蛋白或白蛋白功能區(qū)以延長半衰期[23]。

除上述結(jié)構(gòu)外，還有其他的一些結(jié)構(gòu)，如McDonagh CF等將兩個(gè)scFv與人白蛋白融合，延長了抗體的體內(nèi)半衰期[23-24]，并進(jìn)入臨床研究，由于Ⅱ期臨床失敗，項(xiàng)目終止。

3 雙特異抗體的作用機(jī)制

與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，雙特異性抗體具有同時(shí)結(jié)合2個(gè)不同抗原表位的能力，可以通過不同的作用方式，如介導(dǎo)細(xì)胞毒作用、抑制信號(hào)通路、形成蛋白復(fù)合物等方式而起到特殊的生物學(xué)功能 (圖2)。

3.1 介導(dǎo)細(xì)胞毒作用

大部分的雙特異抗體都設(shè)計(jì)將免疫細(xì)胞重新定向到疾病發(fā)展過程中具有重要作用的靶細(xì)胞 (比如腫瘤細(xì)胞)，雙特異性抗體擁有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合域，其中一個(gè)結(jié)合域靶向腫瘤細(xì)胞，另一結(jié)合域靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞上的標(biāo)志抗原，達(dá)到召集免疫細(xì)胞清除腫瘤細(xì)胞的目的。目前已批準(zhǔn)上市的2個(gè)雙特異性抗體藥物Removab (Catumaxomab)和Blicyto (Blinitumomab)都是通過這種機(jī)制而發(fā)揮作用的。

EpCAM (CD326，17-1A)是一種分子量約為40 kDa的跨膜糖蛋白，為鈣非依賴性的上皮細(xì)胞間粘附分子，在上皮癌變發(fā)揮重要作用，包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膽管癌、乳腺癌等。Removab采用Triomab分子模式，依靠兩個(gè)抗原結(jié)合臂分別結(jié)合細(xì)胞毒性T細(xì)胞的CD3位點(diǎn)和腫瘤細(xì)胞的EpCAM位點(diǎn)，從而引導(dǎo)T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞[25-27]。Blinatumomab是一種BiTE抗體藥物，分別靶向T細(xì)胞CD3和腫瘤細(xì)胞CD19抗原，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，Blinatumomab在極低濃度 (10–100 pg/mL) 下，依然可以召集T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。但是由于Blinatumomab的單鏈結(jié)構(gòu)，缺乏Fc段導(dǎo)致藥物在體內(nèi)半衰期很短，實(shí)際使用時(shí)需要額外配備連續(xù)輸液裝置[28-30]。

3.2 抑制信號(hào)通路

利用雙特異抗體拮抗2種或多種信號(hào)傳導(dǎo)配體，阻斷雙信號(hào)通路，是雙特異抗體發(fā)揮作用的另一機(jī)制。受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTKs) 是最大的一類酶聯(lián)受體，如her家族和胰島素樣生長受體IGF受體，能夠刺激或者調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長，在很多腫瘤細(xì)胞表面異常高表達(dá)，因此它們成為腫瘤治療中的優(yōu)先靶點(diǎn)。靶向RTKs的單靶點(diǎn)單克隆抗體，如靶向her1的cetuximab和panitumumab，以及靶向her2的tratuzumab和pertuzumab，已在腫瘤治療中得到廣泛應(yīng)用。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過信號(hào)通路的轉(zhuǎn)換來破除這些抗體藥物對(duì)其生長的抑制。因此，采用雙特異性抗體藥物介導(dǎo)的同時(shí)針對(duì)兩條RTK信號(hào)通路的治療，可以減少腫瘤細(xì)胞逃逸，從而提高療效。

Tratuzumab和pertuzumab是靶向her2抗原domain Ⅱ和domain Ⅳ兩個(gè)不同表位的抗體，兩個(gè)抗體分別通過不同的信號(hào)通路，防止her2同源聚體和her家族其他成員的異源聚體形成，抑制腫瘤的生長，這兩個(gè)抗體聯(lián)合使用已在臨床被驗(yàn)證具有很好的治療效果。針對(duì)這兩個(gè)表位的雙特異抗體具有很大的市場(chǎng)前景。國內(nèi)外有數(shù)家企業(yè)如蘇州康寧杰瑞、北京天廣實(shí)和北京康明百奧都有針對(duì)這兩個(gè)不同表位的雙特異抗體，3個(gè)公司都是采用了KIH的分子結(jié)構(gòu)，其中康寧杰瑞和北京康明百奧在KIH結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上采用共同輕鏈解決了重輕鏈錯(cuò)配問題，而天廣實(shí)則是分別表達(dá)兩個(gè)半抗后體外包裝形成雙特異抗體，同時(shí)北京康明百奧和天廣實(shí)進(jìn)一步利用低巖藻糖細(xì)胞株生產(chǎn)抗體，進(jìn)一步提高抗體對(duì)腫瘤的殺傷[19,31-32]。

3.3 促進(jìn)蛋白復(fù)合物形成

利用雙特異性抗體兩個(gè)抗原結(jié)合臂可以結(jié)合不同抗原的特點(diǎn)，兩個(gè)抗原結(jié)合臂分別結(jié)合兩種特定蛋白分子，形成功能性復(fù)合體。利用該種復(fù)合體給藥，可以減少機(jī)體內(nèi)排斥反應(yīng)，提高臨床治療效果。如羅氏研制的雙特異抗體Emicizumab模擬了FVIII的功能，促進(jìn)蛋白復(fù)合物形成[33-34]。

4 雙特異抗體的研究現(xiàn)狀

抗體藥物是全球最受歡迎的藥物之一，近年來，不斷有新的抗體藥物批準(zhǔn)上市，抗體藥物的市場(chǎng)容量也在穩(wěn)步增長，2017年全球抗體藥物的銷售額約1 200億美元，且在逐年遞增。雙特異性抗體被譽(yù)為第二代抗體，具有廣闊市場(chǎng)前景。有報(bào)告顯示，2024年雙特異性抗體藥物的市場(chǎng)將達(dá)到58億美元。

目前，全球已有3個(gè)雙特異性抗體藥物獲得批準(zhǔn)上市。Catumaxomab是全球首個(gè)獲批的雙特異性抗體藥物，一種抗CD3和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的小鼠雙特異性抗體，于2009年被EMA批準(zhǔn)上市，用于惡性腹腔積液的治療。不過Catumaxomab目前并未獲得FDA批準(zhǔn)。Blinatumomab于2014年被FDA批準(zhǔn)上市，是一種BiTE抗體藥物，用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。相比化療藥物，Blinatumomab將復(fù)發(fā)性或難治性前體B細(xì)胞ALL中位生存時(shí)間延長了近一倍 (7.7個(gè)月vs.4個(gè)月)，2017年其銷售額為1.75億美元。Emicizumab在2017年11月被FDA批準(zhǔn)上市，用于A型血友病的治療。Emicizumab部分模擬了FVⅢ的功能，通過橋連FIXa與FX，促進(jìn)FXa的產(chǎn)生，該藥物的上市，打破了A型血友病此前只能采用VⅢ因子替代療法的治療現(xiàn)狀。Emicizumab此前曾獲突破性藥物、孤兒藥和優(yōu)先審批資格，專家預(yù)測(cè)峰值銷售可達(dá)50億美元。除了目前已上市的3個(gè)雙特異抗體外，至少還有60個(gè)以上處于臨床前，30個(gè)處于臨床研究或臨床前研究的在研雙特異抗體，約三分之二的雙特異抗體都是集中在腫瘤治療領(lǐng)域[35]。大部分抗腫瘤雙特異抗體采用的是和Catumaxomab、Blinatumomab類似的組合形式，包含一個(gè)抗CD3抗原結(jié)合位點(diǎn)，用來招募T細(xì)胞至腫瘤細(xì)胞附近，第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)靶向CD19、CD20、CD33、CD123、HER1、HER2、CEA、PSMA、gpA33等腫瘤表面抗原。另外還有一些其他的抗原結(jié)合位點(diǎn) (通常是細(xì)胞因子) 的雙特異抗體組合形式處于臨床，如HER2+HER3、IL1α+IL1β、IL13+IL17、CD30+ CD16A等。部分處于臨床階段的雙特異抗體情況匯總?cè)绫?。

雙特異性抗體在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，許多跨國藥企和眾多生物技術(shù)公司都在開發(fā)雙特異抗體相關(guān)藥物。國內(nèi)也有不少企業(yè)涉足雙特異抗體的研究開發(fā)領(lǐng)域，其中部分產(chǎn)品已進(jìn)入臨床或者臨床申報(bào)階段，截止2019年12月，國內(nèi)已有22款雙特異性抗體在CDE有相關(guān)申報(bào)記錄 (表2)。

雙特異性抗體作為新興的抗體種類，被視為腫瘤和自身免疫疾病治療等領(lǐng)域前瞻性藥物，目前其在技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化上仍存在一定的技術(shù)難點(diǎn)。全球生物技術(shù)公司大量投資雙特異性抗體藥物的開發(fā)途徑，希望打開通向大品種、多適應(yīng)癥疾病治療“新大陸”的新航線。從國內(nèi)申報(bào)情況看，國內(nèi)雙特異性抗體目前已有一定的技術(shù)基礎(chǔ)，但在靶點(diǎn)的選擇、雙抗的連接方式、適應(yīng)癥方向等方面與國際一流水平有較大的差距，特別是在專利布局上有很大的缺陷。未來的專利陷阱和專利挑戰(zhàn)會(huì)對(duì)項(xiàng)目的進(jìn)程產(chǎn)生重要影響。創(chuàng)新藥不同于生物類似藥，開發(fā)戰(zhàn)略要從獨(dú)特技術(shù)平臺(tái)和自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)入手，在速度基礎(chǔ)上更看重靶點(diǎn)的確認(rèn)性和產(chǎn)品分子的優(yōu)越性，才能為未來臨床和上市成功銷售贏在起跑線上。相信未來幾年，雙特異性抗體藥物將在抗體研發(fā)領(lǐng)域占據(jù)重要地位。

表1 臨床研究階段的雙特異抗體[36]

表2 國內(nèi)雙特異抗體的申報(bào)情況

雙特異抗體可結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)，在疾病的治療策略選擇上要有很強(qiáng)的科學(xué)依據(jù)，希望從靶點(diǎn)，作用機(jī)制等方面獲得雙特異的協(xié)同效應(yīng)，即具備優(yōu)于兩種抗體聯(lián)合治療的科學(xué)原理。目前已經(jīng)獲批的雙特異抗體藥物主要有兩大類：1) 橋接兩種靶細(xì)胞；2) 靶向兩種蛋白或者一種蛋白的兩個(gè)表位。不論采用哪種類型的雙特異抗體，開發(fā)目標(biāo)是在安全性與/或療效上優(yōu)于現(xiàn)有療法，或者實(shí)現(xiàn)使用劑量的減少。

分析獲批上市的雙特異抗體藥物，主要存在以下幾個(gè)問題：1) CNS神經(jīng)系統(tǒng)毒性。例如 Blicyto (Blinitumomab)在使用過程中，會(huì)有很強(qiáng)的CNS毒性?？赡茉蚴强笴D3或Fc接合臂的二聚體會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)毒性以及細(xì)胞因子風(fēng)暴。2) 同源二聚體。治療血友病的Emicizumab即便采用了共同輕鏈以及knobs-in-hole等先進(jìn)技術(shù)，但和其他類似的技術(shù)平臺(tái)一樣仍會(huì)有一定的同源二聚體成分，這些特定成分存在潛在的安全問題。3) 免疫原性。比如Removab (Catumaxomab) 除了鏈錯(cuò)配的問題，其蛋白序列全部來自于未人源化的動(dòng)物 (大鼠、小鼠) 抗體序列，考慮免疫原性的產(chǎn)生是導(dǎo)致療效不顯著的重要原因；其他雙特異品種也有可能因?yàn)楫a(chǎn)生額外結(jié)構(gòu)域的新表位而可能導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫原性。以上這些問題，需要更多的非臨床以及臨床試驗(yàn)，去評(píng)估更多技術(shù)平臺(tái)和產(chǎn)品的效益與風(fēng)險(xiǎn)比而不斷被解決。

5 結(jié)語

目前大部分的雙特異抗體的臨床應(yīng)用是針對(duì)腫瘤治療和炎癥疾病，主要是利用雙特異抗體同時(shí)定位參與病理生理過程中的不同靶點(diǎn)以提高療效。目前大多雙特異抗體都是處于臨床或臨床前研究，說明雙特異抗體還是有一些亟待解決的問題，細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)以及生產(chǎn)工藝問題是雙特異抗體的主要問題。科技手段的發(fā)展和更新，有助于雙特異抗體存在的這些問題得到逐漸解決或改善，使其具有更強(qiáng)大的療效和更低的副作用。隨著越來越多的雙特異抗體進(jìn)入臨床研究，將會(huì)有越來越多的雙特異抗體上市，一些新的治療策略正在研究中，可進(jìn)一步支持這些分子用于治療腫瘤，為腫瘤患者帶來福音。

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Recent advances in the development of bispecific antibodies

Jintong Ye1, Songdong Meng2, and Xiaodong Zhu1

1Beijing Combio Pharmaceutical Co., Ltd, Beijing 101111, China 2 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Bispecific antibody (BsAbs) are antibodies (Abs) containing two different antigen-binding sites in one molecule. In the last decade, three BsAbs drugs have been approved for therapeutic use. Meanwhile there are a number of BsAbs in preclinical or clinical studies. In this review, we describe BsAb design, discovery, mechanism of action, and the recent research progress in developing BsAbs.

bispecific antibodies, therapeutic drugs, antitumor drug

葉金統(tǒng), 孟頌東, 朱曉東. 雙特異抗體的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 33–43.

Ye JT, Meng SD, Zhu XD. Recent advances in the development of bispecific antibodies. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 33–43.

April 22, 2019;

July 16, 2019

Supported by:National Major Scientific and Technological Special Project for “Significant New Drugs Development” (No. 2015ZX09102024).

Xiaodong Zhu. Tel: +86-10-56315215; E-mail: xiaodongzhu@vip.sina.com

10.13345/j.cjb.190154

國家重大新藥創(chuàng)制 (No. 2015ZX09102024) 項(xiàng)目資助。

2019-07-22

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190722.1442.003.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)