許曼，江賢章，黃建忠，祁峰

·工業(yè)生物技術(shù)·

強(qiáng)化類球紅細(xì)菌輔因子NADPH再生以提高法尼醇的產(chǎn)量

許曼1,2,3，江賢章1,2,3，黃建忠1,2,3，祁峰1,2,3

1 福建師范大學(xué) 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350108 2 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108 3 福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程中心，福建 福州 350109

法尼醇 (Farnesol, FOH) 是由焦磷酸異戊烯基 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙基 (DMAPP) 合成的法尼?；沽姿猁} (FPP) 去焦磷酸化作用生成的。在類球紅細(xì)菌中IPP和DMAPP是由MEP途徑生成，而完整的MEP途徑需要消耗大量的輔因子NADPH，增加胞內(nèi)NADPH的量有可能強(qiáng)化FOH的合成。文中從增加NADPH的生成和降低NADPH的消耗這兩個(gè)策略出發(fā)，分別干擾了編碼6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因 () 和谷氨酸脫氫酶基因 () 的表達(dá)，同時(shí)強(qiáng)化了磷酸戊糖途徑中6-葡萄糖磷酸脫氫酶基因 () 和6-葡萄糖酸磷酸脫氫酶基因 () 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)改造的菌株NADPH含量顯著增加，干擾菌株中菌株RSpgii的產(chǎn)量較高，為3.91 mg/g，在過(guò)表達(dá)的菌株中同時(shí)過(guò)表達(dá)和基因的重組菌株 (RSzg) 的FOH產(chǎn)量提高到了3.43 mg/g。為了獲得FOH產(chǎn)量更高的菌株，以RSpgii為出發(fā)菌株，分別與和組合調(diào)控，獲得的菌株RSzgpi的產(chǎn)量達(dá)到了最高量為4.48 mg/g，是出發(fā)菌株RS-GY2產(chǎn)率的2.24倍。

法尼醇，類球紅細(xì)菌，RNA干擾，NADPH

法尼醇 (1-羥基-3, 7, 11-三甲基-2, 6, 10-十二碳三烯；C15H26O，簡(jiǎn)寫為FOH) 是一種無(wú)環(huán)倍半萜，廣泛分布在多種植物精油中，比如尋常椴、加南芥、茉莉、玫瑰、檸檬草等。因?yàn)槠洫?dú)特的甜香味，常被用來(lái)作為化妝品、香皂、芳香油和香水的香料[1-2]。它還具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-4]、群體感應(yīng)[5-6]等多種生物學(xué)功能，同時(shí)FOH還可以調(diào)控細(xì)胞增殖[7]。FOH還被用作胃潰瘍和維生素合成藥物的原料[8]，因?yàn)槠淠苷T導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系的凋亡，因此其衍生物已成為候選的抗癌藥物[9]。此外，由于其在水中的溶解性較低，能量高，也可以作為生物燃料的替代品[10]。隨著人們對(duì)FOH的需求日益增長(zhǎng)，且從自然資源中提取的產(chǎn)量極低，化學(xué)合成的純度低[11]，用微生物代謝工程生產(chǎn)FOH變得十分必要。

目前，F(xiàn)OH的生物合成途徑在植物和微生物中都已基本闡明。植物中FOH合成酶或微生物中混雜的磷酸酶可以通過(guò)法尼?；沽姿猁} (FPP) 的去磷酸化作用生成FOH[12]。FPP是由FPP合成酶通過(guò)1個(gè)二甲基丙烯焦磷酸鹽(DMAPP)和2個(gè)異戊基焦磷酸鹽(IPP)的頭尾縮合形成的[13]。這兩種物質(zhì)的合成有兩種途徑：一條是2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸 (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphates, MEP) 途徑；另一條是甲羥戊酸 (Mevalonate, MVA) 途徑[14-15]。之前的實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)MEP途徑中的關(guān)鍵酶可以提高FOH的水平，其中王崇龍等以為出發(fā)菌株，通過(guò)過(guò)表達(dá)ispA同時(shí)導(dǎo)入外源MVA途徑，發(fā)酵48 h后，使得FOH產(chǎn)量達(dá)到了135mg/L[12]。除此之外，實(shí)驗(yàn)還表明，F(xiàn)PP的可用性對(duì)FOH的合成具有重要意義，增加FPP池的大小可以促進(jìn)微生物高水平地生產(chǎn)FOH。而參與FPP的生物合成酶經(jīng)常參與生成與還原的鹽酸酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADPH) 相當(dāng)?shù)拇x物，并在其中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[16]。類球紅細(xì)菌作為輔酶Q10的天然生產(chǎn)者，擁有完整的MEP途徑。但是，想要提高微生物體內(nèi)FOH的產(chǎn)量，微生物體內(nèi)的還原輔因子NADPH量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。而在工業(yè)應(yīng)用中，需要還原輔因子如NADH和NADPH的生物合成過(guò)程，如果我們以等摩爾的量投入，將會(huì)非常昂貴。我們以類球紅細(xì)菌為出發(fā)菌株，利用生物工程手段，增加NADPH在全細(xì)胞系統(tǒng)中的可用性，從而提高FOH的產(chǎn)量(圖1)。6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 ()[18]和谷氨酸脫氫酶 () 是兩個(gè)依賴NANPH的脫氫酶，弱化這兩個(gè)基因的表達(dá)，將會(huì)減小NADPH輔因子的消耗；6-葡萄糖磷酸脫氫酶()[19]和6-葡萄糖酸磷酸脫氫酶()[20]的表達(dá)會(huì)增加NADPH的量，強(qiáng)化這兩個(gè)基因的表達(dá)，會(huì)增加NADPH輔因子的量；本實(shí)驗(yàn)的研究目的是通過(guò)干擾基因和基因的表達(dá)，強(qiáng)化基因和基因，從而提高類球紅細(xì)菌中NADPH的水平，達(dá)到強(qiáng)化MEP途徑，增加FPP前體供應(yīng)，從而提高FOH產(chǎn)量的作用。

圖1 類球紅細(xì)菌中FOH的合成途徑及磷酸戊糖途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

1.1.2 主要的試劑和儀器

所有的限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；Q5超保真DNA聚合酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；NADP/NADPH定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；卡那霉素購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。氣相色譜檢測(cè)器為Agilent 7890A型。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌在LB培養(yǎng)基 (NaCl 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母提取粉5g /L) 中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37 ℃、220 r/min；種子培養(yǎng)基 (3.5 g/L (NH4)2SO4、2 g/L酵母提取物、0.75 g/L玉米漿粉、10 g/L葡萄糖、2 g/L NaCl、0.75 g/L K2HPO4、0.75 g/L KH2PO4、0.1 g/L FeSO4和0.3 g/L MgSO4、1 g/L煙酸和1 g/L生物素，最終用10 mol/L NaOH調(diào)pH為6.1–6.3，在32 ℃中培養(yǎng)；生產(chǎn)FOH的培養(yǎng)基由4 g/L (NH4)2SO4、32.5 g/L葡萄糖、3.25 g/L NaCl、1.2 g/L KH2PO4、1.4 g/L FeSO4和9.8 g/L MgSO4、3.9 g/L玉米漿粉組成，最后用10 mol/L NaOH將pH值調(diào)至6.2–6.3。所有使用的質(zhì)粒都是卡那霉素抗性，培養(yǎng)基中卡那霉素終濃度為50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建

pBBR1MCS2-pgii和pBBR1MCS2-gdhAi載體的構(gòu)建：以類球紅細(xì)菌的基因組作為模板，用含有相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)的引物 (pgiiL-F/pgiiL-R，pgiiS-F/pgiiS-R，gdhAL-F/gdhAL-R，gdhAS-F/ gdhAS-R) 分別擴(kuò)增出與和基因相對(duì)應(yīng)的兩段反向重復(fù)序列pgiL和pgiS、gdhAL和gdhAS，較長(zhǎng)的片段pgiL和gdhAL包含548 bp，較短的片段pgiS和gdhAS包含498 bp，較長(zhǎng)的片段中多出的50 bp形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。然后用HⅠ和RⅠ消化較長(zhǎng)的片段pgiL和gdhAL，RⅠ和Ⅰ消化較短的片段pgiS和gdhAS。然后將限制性內(nèi)切酶消化的兩段PCR產(chǎn)物與用HⅠ和Ⅰ消化后的載體PBBR1MCS2連接，形成 一個(gè)稱為pBBR1MCS2-pgii和pBBR1MCS2-gdhAi的質(zhì)粒，RNA干擾圖和原理圖如圖2所示。

表1 菌株和質(zhì)粒

過(guò)表達(dá)、、載體的構(gòu)建：以類球紅細(xì)菌的基因組作為模板，用帶有相應(yīng)同源臂的引物zwf-F/zwf-R和gnd-F/gnd-R，分別擴(kuò)增出帶有相應(yīng)同源臂的基因和基因序列，然后用Gibson assembly試劑將擴(kuò)增出來(lái)的和分別與骨架PBBR1MCS2z (引物為pBBR1MCS2z-F/ pBBR1MCS2z-R) 和骨架PBBR1MCS2g (引物為pBBR1MCS2g-F/pBBR1MCS2g-R) 連接起來(lái)，形成質(zhì)粒pBBR1MCS2-zwf和pBBR1MCS2-gnd；共過(guò)表達(dá)基因和基因的質(zhì)粒的構(gòu)建，分別用overlapzwf-F/overlapzwf-R和overlapgnd-F/overlapgnd- R擴(kuò)增出帶有相應(yīng)同源臂的基因和基因序列，用pBBR1MCS2zg-F/pBBR1MCS2zg-R為引物，質(zhì)粒pBBR1MCS2為模板擴(kuò)增出骨架pBBR1MCS2zg，然后用Gibson assembly試劑將這3個(gè)片段連接起來(lái)，連成的質(zhì)粒為pBBR1MCS2- zwf-gnd，結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。

干擾加強(qiáng)化的質(zhì)粒構(gòu)建，分別以pBBR1MCS2- zwf、pBBR1MCS2-gnd和pBBR1MCS2-zwf-gnd為模板，tac-F/trrnB-R為引物，分別擴(kuò)增出帶有tac啟動(dòng)子和trrnB終止子的、和的基因序列，然后用限制性內(nèi)切酶Ⅰ消化擴(kuò)增出來(lái)的片段和質(zhì)粒pBBR1MCS2-pgii，最后用T4 DNA連接酶連接，分別形成質(zhì)粒pBBR1MCS2- pgii-zwf、pBBR1MCS2-pgii-gnd和pBBR1MCS2- pgii-zwf-gnd。結(jié)構(gòu)圖如圖2所示，所有質(zhì)粒見(jiàn)表1，引物見(jiàn)表2。

由表6說(shuō)明，土樣1土壤中添加2%骨炭(A)化學(xué)修復(fù)劑時(shí)土壤中的重金屬鋅、鉛、鉻、銅、砷、鎘含量均有所下降。其中在種有狼尾草的土壤區(qū)域主要污染物鋅含量下降幅度最大，下降值為132.5mg/L。在種有狼尾草的土壤區(qū)域主要污染物砷含量下降幅度最大，最大值為2.3mg/L。

1.2.2 工程菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證

將含有相應(yīng)質(zhì)粒的供體菌S17-1接種在含有卡那霉素抗性的液體LB中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，以10%的接種量轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗性的新鮮LB中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；受體菌接種在無(wú)抗的液體LB中于30 ℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將受體菌和供體菌轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，7 000 r/min離心3 min，用新鮮的LB洗2次，然后分別用300 μL和200 μL的新鮮LB重懸受體菌和供體菌，將受體菌和供體菌按6∶1的體積比混勻后點(diǎn)在無(wú)抗的LB平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約20 h，最后用1 mL預(yù)冷的1×Sistrom’s培養(yǎng)基洗脫到預(yù)冷的1.5 mL的離心管中，4 ℃5 000 r/min離心2 min后去上清，用約1 mL的預(yù)冷的1×Sistrom’s洗滌2次后用100 μL預(yù)冷的1×Sistrom’s培養(yǎng)基重懸，最后涂布在含有卡那霉素抗性和終濃度為150 mg/L K2TeO3的平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)35 d直至長(zhǎng)出黑色的接合子。用驗(yàn)證引物和單酶切驗(yàn)證黑色的接合子，根據(jù)PCR和測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入成功。

圖2 RNA干擾原理圖和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

表2 引物序列

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組水平的分析

提取所有干擾菌株中總的RNA，用DNA酶消化所提取RNA中的基因組，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將去除基因組后的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用Power SYBR Green PCR試劑進(jìn)行qPCR。每個(gè)反應(yīng)混合物包括RT反應(yīng)液2 μL (模板濃度為50 ng/μL)，引物分別1 μL，SYBR Premix ExⅡ12.5 μL，用水補(bǔ)足到25 μL。每個(gè)反應(yīng)做3組平行，采用2–ΔΔCt(–ΔΔCt=[Ct(target)–Ct(ref)]sample–[Ct(target)–Ct(ref)]WT)相對(duì)法對(duì)基因進(jìn)行定量分析[21]。

1.2.4 NADP/NADPH的測(cè)定

收集發(fā)酵48 h后菌液1 mL (約1×105個(gè)細(xì)胞) 用預(yù)冷的PBS清洗2遍之后，2 000 r/min離心5 min，去除上清。加入300 μL NANP/NADPH緩沖液，于?80 ℃條件下反復(fù)凍融2次，每次凍20 min，然后渦旋振蕩10 s，13 000×離心10min后，將上清轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，取50 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，然后再加入100 μL反應(yīng)混合液，混勻后在室溫下反應(yīng)5 min，最后加入10 μL顯色劑，在室溫的條件下反應(yīng)約4 h后，測(cè)其在450 nm處的吸光值，得到細(xì)胞內(nèi)NADP的總量；取200 μL上清液到干凈的離心管中，在60 ℃的水浴鍋中加熱30 min，立刻將樣品放在冰上冷卻，快速離心，然后取50 μL的樣品于96孔板中，加入100 μL反應(yīng)混合液，混勻后在室溫下反應(yīng)5 min，最后加入10 μL顯色劑，在室溫的條件下反應(yīng)約4 h后，測(cè)其在450 nm處的吸光值，即得細(xì)胞內(nèi)NADPH的量。

1.2.5 FOH的產(chǎn)量測(cè)定

由于FOH具有揮發(fā)性，為了減少FOH的揮發(fā)在發(fā)酵培養(yǎng)液里加入了體積比為15%的癸烷[22]。發(fā)酵48 h后，收集癸烷相，以8 000×離心10 min，去除細(xì)胞碎片，取1 mL的上清，過(guò)濾膜，采用配備火焰離子化檢測(cè)器(FID) 的安捷倫技術(shù)7890A氣相色譜儀對(duì)FOH的產(chǎn)率進(jìn)行了定量。樣品以1∶10的比例注入，在19091J HP-5柱(30 m長(zhǎng)；0.32 mm內(nèi)徑)；以流速為1.0 mL/min的氮?dú)鉃檩d氣，入口壓力為39 psi。噴油器初始溫度為250 ℃，柱式烘箱設(shè)置為80 ℃。然后以10 ℃/min的速度增加到250 ℃，并保持1 min。FOH的標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(中國(guó)上海)。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)PCR、酶切酶連等多步實(shí)驗(yàn)，最終成功地獲得了干擾質(zhì)粒，用HⅠ單酶切原始質(zhì)粒和構(gòu)建成功的質(zhì)粒，分別得到一條約6.5 kb和6.6 kb的條帶，構(gòu)建成功的質(zhì)粒比原始質(zhì)粒多約100 bp，與預(yù)期的單酶切結(jié)果一致；經(jīng)PCR、Gibson assembly試劑組裝得到強(qiáng)化的質(zhì)粒，將陽(yáng)性克隆用引物tac-F/trrnB-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，分別得到條帶大小為1 972 bp (RSz)、1 386 bp (RSg)、2 670 bp (RSzg)，與預(yù)期結(jié)果一致，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與原序列系列比對(duì)一致；干擾串聯(lián)強(qiáng)化的質(zhì)粒驗(yàn)證，將轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出來(lái)的陽(yáng)性克隆用驗(yàn)證引物V-F/V-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到長(zhǎng)度分別為2 402 bp (RSzpi)、1 816 bp (RSgpi)、3 037 bp (RSzgpi) 的條帶與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，測(cè)序結(jié)果與原序列比對(duì)一致，干擾串聯(lián)強(qiáng)化質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 類球紅細(xì)菌工程菌株的驗(yàn)證

挑選黑色的結(jié)合子，轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素抗性的液體LB中，提取質(zhì)粒，然后分別用單酶切、tac-F/trrnB-R和V-F/V-R這兩對(duì)引物去PCR驗(yàn)證，最后得出單酶切重組質(zhì)粒之后的條帶比原始質(zhì)粒長(zhǎng)約100 bp，tac-F/trrnB-R擴(kuò)增出來(lái)的片段分別為1 972 bp (RSz)、1 386 bp (RSg)、2 670 bp (RSzg)，驗(yàn)證引物V-F/V-R擴(kuò)增出來(lái)的條帶大小分別為2 402 bp (RSzpi)、1 816 bp (RSgpi)、3 037 bp (RSzgpi)，以上結(jié)果均與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，工程菌株構(gòu)建成功。

2.3 干擾后pgi基因和gdhA基因的轉(zhuǎn)錄組水平分析

為了評(píng)價(jià)基因和基因干擾后的轉(zhuǎn)錄水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)兩株干擾株進(jìn)行分析。

分別挑取3個(gè)驗(yàn)證正確的接合子接種在含有卡那霉素抗性的液體LB中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后分別提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄等一系列操作之后，采用了q-PCR的方法，分別測(cè)定了干擾株RSpgii和RSgnhAi中基因和gdhA基因的轉(zhuǎn)錄水平，本實(shí)驗(yàn)以出發(fā)菌株RS-GY2中相對(duì)應(yīng)的基因豐度為1，來(lái)計(jì)算改造以后基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

圖3是干擾后的轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果，由圖3可知，與出發(fā)菌株相比，RSpgii和RSgdhAi中基因和基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下降。由圖3A可知，RSpgii-2和RSpgii-3干擾株基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，分別為出發(fā)菌株的0.19和0.18；gdhA基因的轉(zhuǎn)錄水平同樣也下調(diào)比較明顯，由圖3B可知，RSgdhAi-2和RSgdhAi-3的轉(zhuǎn)錄水平為出發(fā)菌株的0.10和0.15；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾菌株已經(jīng)構(gòu)建成功。

2.4 NADPH的測(cè)定及結(jié)果分析

分別取發(fā)酵48 h后的發(fā)酵液，經(jīng)多步處理后，測(cè)其生物體內(nèi)NADP/NADPH。分析結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，兩株干擾菌株中，RSgdhAi胞內(nèi)NADPH的量與出發(fā)菌株相比，基本保持不變，而干擾株RSpgii中NADPH比出發(fā)菌株提高了12.16%；三組過(guò)表達(dá)菌株中，RSg胞內(nèi)NADPH提高了23.65%，RSzg胞內(nèi)NADPH的量比原始菌株高出了0.42 pmol，為5.62 pmol，而RSz 胞內(nèi)NADPH的量與原始菌株相比無(wú)明顯變化；在干擾加強(qiáng)化的菌株中，RSzgpi胞內(nèi)NADPH的量達(dá)到了最大，是原始菌株胞內(nèi)NADPH的1.35倍，RSz胞內(nèi)的NADPH的量則減少到了4.84 pmol，RSg胞內(nèi)的NADPH的量基本不變。基因編碼的是6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，當(dāng)基因的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖的反應(yīng)受到限制，將導(dǎo)致代謝向磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)變，同時(shí)和也是磷酸戊糖途徑中的相關(guān)基因，所以當(dāng)干擾基因串聯(lián)共過(guò)表達(dá)和之后，胞內(nèi)的NADPH的積累量達(dá)到了最大。

表3 胞內(nèi)NADPH的濃度與NADPH/NADP+的比例

2.5 工程菌中FOH產(chǎn)量的增加

由于FOH具有揮發(fā)性，我們預(yù)先在培養(yǎng)基上層覆蓋一層癸烷，發(fā)酵48 h后，取癸烷相過(guò)濾膜后，利用高效氣相進(jìn)行檢測(cè)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)菌株的產(chǎn)量。我們分別在發(fā)酵0、12、24、36和48 h覆蓋9 mL的癸烷，待發(fā)酵48 h后，分離癸烷相，取1 mL測(cè)其產(chǎn)量。結(jié)果如圖4所示，圖4A表示的是干擾菌株FOH的產(chǎn)量，由圖可知，不同時(shí)間段開(kāi)始覆蓋癸烷的數(shù)據(jù)表明發(fā)酵開(kāi)始時(shí)覆蓋癸烷測(cè)得的產(chǎn)量最高，說(shuō)明癸烷的產(chǎn)生是伴隨著菌的生長(zhǎng)；在相同的條件下，干擾后的菌株較出發(fā)菌株RS-GY2分別提高了57.51%和51.31%，且干擾株RSpgii FOH的產(chǎn)量比干擾株RSgdhAi的產(chǎn)量略高了4.09%；圖4B表示的是不同的強(qiáng)化菌株在不同時(shí)間段覆蓋癸烷后FOH的產(chǎn)量，其中同時(shí)強(qiáng)化和這兩個(gè)基因，F(xiàn)OH的產(chǎn)量相較于出發(fā)菌株顯著性提高，比出發(fā)菌株提高了59.09%，達(dá)到了44.18 mg/L，單獨(dú)強(qiáng)化和的菌株產(chǎn)量都有提高，分別為35.93 mg/L和40.20 mg/L，其中RSg的產(chǎn)量較RSz產(chǎn)量高11.88%。

為了進(jìn)一步提高FOH的產(chǎn)量，我們以干擾之后產(chǎn)量較高的RSpgii菌株作為出發(fā)菌株，分別與和組合調(diào)控，觀察組合調(diào)控后對(duì)FOH產(chǎn)量的影響。在發(fā)酵前分別在每個(gè)培養(yǎng)基中覆蓋9 mL的癸烷，發(fā)酵48 h之后測(cè)其FOH的產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，組合調(diào)控后，F(xiàn)OH的產(chǎn)量較出發(fā)菌株RSpgii的產(chǎn)量都有所提高，RSzpi的產(chǎn)量為49.88 mg/L，DCW為11.77 g/L，RSgpi的產(chǎn)量為54.59 mg/L，DCW為13.53 g/L，RSzgpi的產(chǎn)量為52.29 mg/L，DCW為11.67 g/L，其中RSgpi的產(chǎn)量最高，為原始菌株RS-GY2的1.97倍，但是RSgpi的生物量較高為13.53 g/L，產(chǎn)率為4.04 mg/g，比RSzgpi和RSzpi的產(chǎn)率低，RSzgpi和RSzpi的產(chǎn)率分別為4.48 mg/g和4.29 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，增加胞內(nèi)的NADPH的量可以增加FOH的產(chǎn)量，當(dāng)基因的表達(dá)受到干擾，6-磷酸葡萄糖無(wú)法正常地向6-磷酸果糖轉(zhuǎn)變，積累6-磷酸葡萄糖，過(guò)表達(dá)的基因和基因會(huì)加速6-磷酸葡萄糖向6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯方向轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生大量的NADPH，從而增強(qiáng)MEP途徑的表達(dá)水平，增加FPP的前體供應(yīng)，促進(jìn)FPP向FOH轉(zhuǎn)化，使得類球紅細(xì)菌FOH的產(chǎn)量增加。

圖5 發(fā)酵48h后各重組菌株中FOH產(chǎn)量及其生物量

3 討論

隨著人們對(duì)FOH重要性的認(rèn)知逐漸增加，市場(chǎng)對(duì)FOH的需求也越來(lái)越大。目前微生物發(fā)酵是FOH的主要生產(chǎn)方式，利用生物工程手段定向改造菌株為提高產(chǎn)量、降低成本提供了有效的方法。到目前為止，研究者已通過(guò)多個(gè)方面來(lái)提高FOH的產(chǎn)量。Ohto等通過(guò)在中過(guò)表達(dá)和這兩個(gè)基因后使得其產(chǎn)量達(dá)到了389 μg/L[23]。據(jù)報(bào)道，在添加油脂和洗滌劑的條件下，釀酒酵母SQ合酶缺失突變體在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生28 mg/L的FOH。阻斷SQ合成會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)FPP水平，導(dǎo)致FOH的形成。本實(shí)驗(yàn)以類球紅細(xì)菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)增加NADPH的量，從而增加MEP途徑強(qiáng)度，使得FPP池增加，最終達(dá)到提高類球紅細(xì)菌產(chǎn)法尼醇能力的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在干擾基因的表達(dá)的前提下，同時(shí)過(guò)表達(dá)基因和基因后，法尼醇的產(chǎn)量達(dá)到了最大為52.29 mg/L，產(chǎn)率達(dá)到了4.48 mg/g，產(chǎn)量相比與出發(fā)菌株RS-GY2提高了約88.3%。由于的表達(dá)受到抑制，使得6-磷酸葡萄糖向6-磷酸果糖的轉(zhuǎn)變受到影響，胞內(nèi)積累大量的6-磷酸葡萄糖，當(dāng)同時(shí)過(guò)表達(dá)基因和基因后，6-磷酸葡萄糖通過(guò)磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)移，碳代謝流向磷酸戊糖方向轉(zhuǎn)變，磷酸戊糖途徑通量的提高使得胞內(nèi)NADPH的積累量達(dá)到最大；同時(shí)使得MEP途徑的起始原料3-磷酸甘油醛的量增加，從而達(dá)到增強(qiáng)MEP途徑的強(qiáng)度，使FPP池增加，最終增加法尼醇的積累量。

王崇龍等利用為出發(fā)菌株，通過(guò)過(guò)表達(dá)同時(shí)導(dǎo)入外源MVA途徑，發(fā)酵48 h后，F(xiàn)OH產(chǎn)量達(dá)到了135 mg/L[12]。雖然我們搖瓶發(fā)酵48 h后測(cè)得的FOH產(chǎn)量較低，但是本文的工作為使用代謝工程改造微生物提高FOH的產(chǎn)量提供了新的思路。由于FOH是易揮發(fā)的物質(zhì)，癸烷覆蓋之后，只需要從癸烷相提取FOH，避免了產(chǎn)物抽提等多步復(fù)雜的工作，操作簡(jiǎn)單。隨著發(fā)酵工藝、調(diào)控策略、培養(yǎng)基等的不斷優(yōu)化，利用類球紅細(xì)菌生產(chǎn)FOH的產(chǎn)量還將會(huì)有很大的提升。

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Reinforcement ofcofactor NADPH to increase the production of farnesol

Man Xu1,2,3, Xianzhang Jiang1,2,3, Jianzhong Huang1,2,3, and Feng Qi1,2,3

1 Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China 2 College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China 3 Engineering Research Center of Fujian Modern Fermentation Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China

Farnesol (FOH) is produced by dephosphorylation of farnesyl diphosphate (FPP) derived from two universal building blocks, dimethylallyl diphosphate (DMAPP) and isopentenyl diphosphate (IPP). Inthese building blocks are generated by MEP pathway, however, many of the biosynthetic reactions and biotransformations in the MEP pathway are limited by low availability of NADPH. Improvement of the amount of intracellular NADPH may enhance the synthesis of FOH. In this study, we utilized the strategies of increasing the production of NADPH and decreasing the consumption of NADPH. The expression of glucose 6-phosphate isomerase () and glutamate dehydrogenase () were inhibited by RNA interference, respectively, and overexpression of 6-glucose phosphate dehydrogenase () and 6-glucose phosphate dehydrogenase () in the pentose phosphate pathway were carried out. The results showed that the content of NADPH in the recombinant strains increased significantly, the highest FOH production of RSpgii in the RNA interfered strain was 3.91 mg/g, and the FOH production increased to 3.43 mg/g aftergene andgene has been overexpressed. In order to obtain strains with higher FOH production, we used RSpgii as the starting strain, and,and co-overexpressed+gene were overexpressed in RSpgii, respectively. The highest FOH production of the strain RSzgpi reached to 4.48 mg/g which was 2.24 times that of the starting strain RS-GY2.

farnesol,, RNA interfering, NADPH

許曼, 江賢章, 黃建忠, 等. 強(qiáng)化類球紅細(xì)菌輔因子NADPH再生以提高法尼醇的產(chǎn)量. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 90–99.

Xu M, Jiang XZ, Huang JZ, et al. Reinforcement ofcofactor NADPH to increase the production of farnesol. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 90–99.

April 26, 2019;

June 10, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21406130).

Feng Qi. Tel:+86-591-22868212; E-mail:f.qi@fjnu.edu.cn

10.13345/j.cjb.190165

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21406130) 資助。

2019-07-01

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190628.1634.005.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)