干渺妍，謝 暉，唐惠儒,

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2. 復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院，上海 201203

脂肪酸是生物體內(nèi)重要的能量[1-2]和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可通過代謝轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷為心肌和肝臟等組織提供能量[3]，也可用于合成磷脂、激素及酮體等具有生理功能的物質(zhì)。研究顯示，脂肪酸代謝失調(diào)會(huì)導(dǎo)致炎癥[4]、腫瘤[5-6]及心血管疾病[7]等，因此定量分析此類物質(zhì)隨生理及病理生理過程的變化具有重要意義[8-12]?；谥舅崴紨?shù)的不同，其可被分為短鏈（C1～C6）、中鏈（C8～C12）和長鏈（C16～C26）脂肪酸。目前，對(duì)其進(jìn)行同步定量是代謝組學(xué)分析及生理與病理生理機(jī)制研究中亟待解決的問題。

脂肪酸的定量分析主要包括核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance，NMR）[13-14]、氣相色譜 - 氫火焰離子化檢測(cè)器/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-f l ame ionization detector/mass spectrometry，GC-FID/MS）[15]及液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）等[16-17]。其中，GC-FID/MS將氣相色譜穩(wěn)定分離的優(yōu)勢(shì)與FID及質(zhì)譜的高靈敏度檢測(cè)相結(jié)合，成為了脂肪酸的定量分析的一種重要方法。該技術(shù)具有良好的重現(xiàn)性和線性動(dòng)態(tài)范圍[18]，擁有商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫，可以輔助對(duì)未知物的定性。氣相色譜分離要求待測(cè)物具有良好的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性，而脂肪酸由于含有極性官能團(tuán)羧基且鏈長不同使得其物理化學(xué)性質(zhì)差異較大，因此常需先對(duì)其進(jìn)行化學(xué)衍生化處理。目前，脂肪酸的衍生化方法主要有三甲基硅烷化[19-22]及甲酯化[23-25]。其中，前者常用的試劑是N, O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺和N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺。上述2種試劑極易水解，因此在衍生化前要求樣本行干燥處理，同時(shí)衍生化過程須在無水條件下進(jìn)行；而該種操作使樣品在前處理時(shí)較為繁雜、耗時(shí)，且易導(dǎo)致分析對(duì)象（即代謝物）發(fā)生損失。甲酯化法被廣泛用于中長鏈脂肪酸的定量分析，但這種方法衍生化耗時(shí)較長，且應(yīng)用于短鏈脂肪酸產(chǎn)生的甲酯化產(chǎn)物易揮發(fā)，因此甲酯化法不適合對(duì)短、中、長鏈脂肪酸進(jìn)行同步定量分析。

針對(duì)上述問題，本文利用GC-FID/MS中的FID與質(zhì)譜同步檢測(cè)，并通過對(duì)脂肪酸進(jìn)行異丁酯化建立一種簡(jiǎn)便快速、條件溫和且可對(duì)水相介質(zhì)中短、中、長鏈脂肪酸進(jìn)行同步定量分析的方法；同時(shí)，使用27種脂肪酸對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，并通過將該方法應(yīng)用于血清、尿液、糞便、肝臟等典型的常見生物樣本以驗(yàn)證其基質(zhì)普適性，從而為生理及病理生理過程中脂肪酸的變化規(guī)律及其功能研究提供新的方法。限公司，十二烷酸購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，4-甲基己酸購自加拿大TRC公司，乙酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司。上述脂肪酸樣品分別用水配制成已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并密封貯存待檢。

1 材料與方法

1.1 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用試劑均購自商業(yè)化產(chǎn)品來源而未經(jīng)任何純化。異丁醇購自上海化學(xué)試劑研究所有限公司，色譜純正己烷購自美國Merck公司，無水硫酸鈉購自上海大合化學(xué)品有限公司，（-） -氯甲酸薄荷酯、氫氧化鈉、吡啶、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、癸酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、芥酸、二十二烷酸、二十四烷酸均購自美國Sigma-Aldrich公司，甲酸、丙酸、異丁酸、新戊酸、丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸、戊酸、2-乙基丁酸、異己酸、己酸、庚酸、正辛酸、十四烷酸、亞油酸、油酸、亞麻酸均購自阿拉丁試劑（上海）有

1.2 研究方法

1.2.1 脂肪酸的異丁酯化 本研究采用異丁酯化的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液或生物樣本進(jìn)行衍生化處理，具體操作如下：取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中，加入130 μL氫氧化鈉水溶液（20 mmol/L）、50 μL 吡啶和80 μL 異丁醇后渦旋震蕩 10 s。加入20 μL （-） -氯甲酸薄荷酯渦旋震蕩30 s，放氣后再渦旋震蕩30 s。再次加入20 μL （-） -氯甲酸薄荷酯，重復(fù)上述渦旋震蕩步驟。完畢后，向上述衍生化混合物加入150 μL正己烷并渦旋萃取2 min，16 099×g離心5 min。取上清液，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，將其加入氣相色譜進(jìn)樣瓶中檢測(cè)。

1.2.2 GC-FID/MS檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 本研究使用配有FID的氣相色譜 - 質(zhì)譜儀（7890B-5977A，美國Agilent Technologies公司）和HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美國Agilent J&W公司）對(duì)衍生化后的脂肪酸進(jìn)行分析。采用分流進(jìn)樣（分流比為29:1），進(jìn)樣量為1 μL。進(jìn)樣口溫度為280 ℃，載氣氦氣（純度＞99.999%）的流速為1.0 mL/ min。色譜柱起始溫度為40 ℃，保持3 min后以 10 ℃ /min升至145 ℃，以30 ℃ /min升至175 ℃，再以10 ℃ /min升至260 ℃，保持1.5 min，最后以30 ℃ /min的速率升至310 ℃，保持3 min。FID溫度為280 ℃，氫氣流速為30 mL/min。質(zhì)譜溶劑延遲時(shí)間4.2 min，將質(zhì)量選擇檢測(cè)器（mass selective detector，MSD）傳輸管及電子離子化（electron ionization，EI）源溫度設(shè)為230 ℃，燈絲電壓固定為 70 eV。質(zhì)譜采集采用選擇離子掃描模式（selective ion monitoring，SIM），檢測(cè)碎片離子作為各目標(biāo)物定性定量離子。使用MassHunter軟件（定性分析B.06.00版以及定量分析B.06.00版，美國Agilent Technologies公司）分析上述檢測(cè)獲得的GC-FID/MS數(shù)據(jù)。所有代謝物根據(jù)其保留時(shí)間及質(zhì)譜碎片質(zhì)荷比分布信息進(jìn)行定性分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)提取的定量離子色譜峰進(jìn)行積分得到定量數(shù)據(jù)。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證 本研究使用27種脂肪酸樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到檢測(cè)限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）；使用高濃度、中濃度、低濃度的樣品混合溶液測(cè)量方法的日間及日內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。通過與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果比較評(píng)估方法的靈敏度及穩(wěn)定性，具體操作如下。

本研究所用的脂肪酸樣品的母液由雙蒸水及10%異丁醇水溶液配制而成，其中碳數(shù)小于6的脂肪酸用雙蒸水作為溶劑配制。研究采用逐級(jí)稀釋法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將脂肪酸樣品的母液稀釋1、2、4、10、20、40、100倍后獲得的7個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行衍生化，并依次進(jìn)行GCFID/MS分析檢測(cè)。將進(jìn)樣的柱上摩爾數(shù)作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及其對(duì)應(yīng)的線性范圍。LOD及LOQ分別為信噪比等于3和10時(shí)的代謝物柱上量。此外，選用稀釋1、10及100倍的3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)衍生化后進(jìn)行日內(nèi)及日間RSD評(píng)估，即將衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于室溫，1 d內(nèi)每間隔8 h檢測(cè)1次，計(jì)算3次峰面積間的RSD值作為日內(nèi)RSD評(píng)價(jià)；標(biāo)準(zhǔn)溶液在3 d內(nèi)檢測(cè)3次，計(jì)算3次峰面積間的RSD值作為日間RSD評(píng)價(jià)，且標(biāo)準(zhǔn)溶液在測(cè)定間隙需置于4 ℃保存。

1.2.4 普適性分析 將所建方法應(yīng)用于血清、尿液、糞便、肝臟等生物樣本的脂肪酸進(jìn)行定量分析，以驗(yàn)證該方法在不同生物基質(zhì)中的普適性。本研究所用血清樣本源于健康青少年（13歲～18歲），尿液樣本來源于健康成年人（25歲），血清和尿液樣本均為已通過倫理審批的代謝組研究生物樣本，采集后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱；實(shí)驗(yàn)前，將樣本梯度解凍后可直接進(jìn)行衍生化處理，通過前述建立的方法對(duì)樣本中的脂肪酸進(jìn)行分析。本研究使用的糞便來源于健康嬰幼兒（0歲～3歲），糞便樣本為已通過倫理審批的代謝組研究生物樣本，肝臟樣本來源于雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠；實(shí)驗(yàn)時(shí)將樣本梯度解凍后稱取糞便0.042 6 g、肝臟組織0.054 6 g，分別加入500 μL 10%異丁醇水溶液，采用組織破碎儀（德國QIAGEN公司）進(jìn)行勻漿（每次20 Hz勻漿90 s，間隔60 s，循環(huán)3次）；隨后，在冰浴中以45 Hz持續(xù)30 s、80 Hz持續(xù)30 s交替超聲10 min，進(jìn)一步提取生物樣本中的代謝物；提取后的糞便及肝臟組織經(jīng)離心后，取100 μL勻漿液進(jìn)行衍生化處理并使用GC-FID/MS對(duì)衍生化后的脂肪酸進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 脂肪酸的異丁酯化

脂肪酸異丁酯化的反應(yīng)原理已在文獻(xiàn)[26]中報(bào)道。本研究通過優(yōu)化衍生化過程中的試劑用量、時(shí)間、處理方法等參數(shù)，建立了27種脂肪酸的異丁酯化方法。該反應(yīng)可直接在水相中進(jìn)行，常溫下渦旋震蕩1 min即可完成衍生化，且衍生化產(chǎn)物較穩(wěn)定。

2.2 GC-FID/MS檢測(cè)

本研究在文獻(xiàn)[27]報(bào)道的升溫程序基礎(chǔ)上，結(jié)合不同鏈長脂肪酸異丁酯的性質(zhì)，優(yōu)化確定了分析的升溫梯度及分流比等色譜分離參數(shù)。結(jié)果（圖1）顯示，使用（-） -氯甲酸薄荷酯與異丁醇對(duì)27種脂肪酸進(jìn)行衍生化后，脂肪酸在HP-5MS色譜柱上可較好保留且峰型良好，其中甲酸及乙酸也可與溶劑峰分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)甲酸和乙酸更準(zhǔn)確的定性定量分析。

圖1 27種脂肪酸異丁酯的GC-MS色譜圖Fig 1 GC-MS chromatogram of 27 kinds of fatty acids isobutyl esters

本研究對(duì)脂肪酸的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜定性及定量離子進(jìn)行分析，結(jié)果（表1）顯示27種脂肪酸經(jīng)衍生化后均具有特征質(zhì)譜碎片離子及不同的保留時(shí)間，可用于脂肪酸的定性與定量分析。各脂肪酸的定量離子為具有特征性的且抗基質(zhì)噪音干擾能力較強(qiáng)的質(zhì)譜碎片離子，同時(shí)各脂肪酸存在3～4個(gè)輔助定性離子。因此，在復(fù)雜樣本中或基質(zhì)干擾嚴(yán)重時(shí)，使用SIM進(jìn)行分析可增加定量準(zhǔn)確性。

表1 27種脂肪酸配制濃度及其異丁酯色譜質(zhì)譜信息Tab 1 Concentrations of 27 kinds of fatty acids and GC-MS data for the isobutyl esters

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

本研究使用27種脂肪酸進(jìn)行定量分析方法的驗(yàn)證，主要包括線性范圍、線性回歸方程、LOD、LOQ、日內(nèi)及日間RSD。結(jié)果（表2）表明，在使用質(zhì)譜的SIM時(shí)，27種脂肪酸在2～3個(gè)數(shù)量級(jí)濃度范圍內(nèi)的線性方程R2值均可達(dá)0.99，其LOD在柱上0.03～2.96 pmol之間，LOQ在0.09～9.86 pmol之間，與文獻(xiàn)中所述方法[28]相似。同時(shí)，使用FID及質(zhì)譜檢測(cè)器SIM采集模式進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，大部分短鏈及中鏈脂肪酸的質(zhì)譜響應(yīng)優(yōu)于FID，長鏈脂肪酸的FID檢測(cè)靈敏度則高于質(zhì)譜。此外，27種脂肪酸在低濃度、中濃度和高濃度情況下的日內(nèi)及日間RSD均小于10%，說明方法具有良好的穩(wěn)定性及精密度。

表2 脂肪酸異丁酯定量方法的線性、靈敏度、精密度及穩(wěn)定性分析Tab 2 Analysis of linearity, sensitivity, precision and stability for isobutylation-based fatty acid quantification method

2.4 生物樣本的普適性分析

本研究以健康青少年的血清、成年人的尿液、嬰幼兒的糞便及大鼠肝臟為典型生物樣本，各選擇1例就上述脂肪酸定量方法對(duì)不同基質(zhì)的普適性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果（圖2、表3）表明，該方法在血清樣本中至少可檢測(cè)到10種脂肪酸，主要為短鏈及長鏈脂肪酸，而中鏈脂肪酸較少；在尿液樣本中可檢出7種脂肪酸；在糞便樣本中至少可檢測(cè)到14種脂肪酸，其中乙酸含量明顯高于其他脂肪酸，這與文獻(xiàn)[29]報(bào)道結(jié)果相一致。此外，糞便樣本中可檢測(cè)到丙酸、2- 甲基丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸，這些脂肪酸在其他3種生物樣本中未檢測(cè)到。大鼠肝臟樣本可檢測(cè)到9種脂肪酸。但由于選取樣本量有限，上述結(jié)果并未涉及對(duì)生物學(xué)問題（如代謝物的生物學(xué)意義等）的回答，僅涉及所建方法對(duì)多種生物樣本的適用性；后續(xù)在方法的具體應(yīng)用中，研究者需考慮生物樣本個(gè)數(shù)的重復(fù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

圖2 4種典型生物樣本中脂肪酸的GC-MS譜圖Fig 2 GC-MS chromatograms of fatty acids in four typical biological samples

表3 4種典型生物樣本中脂肪酸的含量Tab 3 Concentration of fatty acids in four typical biological samples

3 討論

脂肪酸是細(xì)胞的重要能量來源、結(jié)構(gòu)組成成分及信號(hào)物質(zhì)，對(duì)其組成及變化規(guī)律進(jìn)行定量分析是全局性認(rèn)識(shí)此類代謝物在生理及病理過程中的功能的關(guān)鍵突破口。就傳統(tǒng)的脂肪酸硅烷化及甲酯化分析方法而言，其衍生化步驟繁瑣、耗時(shí)，且硅烷化分析方法必須在無水條件下進(jìn)行，干燥過程易造成代謝物的損失。為此，本研究使用（-） -氯甲酸薄荷酯和異丁醇作為衍生化試劑，建立了一種基于異丁酯化的27種脂肪酸的GC-FID/MS定量分析方法，與文獻(xiàn)[20]中報(bào)道的方法相比具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，此方法可以在水相中進(jìn)行，樣品前處理快速便捷且無需對(duì)水進(jìn)行去除或絕對(duì)隔離；其次，此方法克服了脂肪酸甲酯化或乙酯化產(chǎn)物的易揮發(fā)性，避免了檢測(cè)前處理造成的脂肪酸酯的揮發(fā)損失；再次，此方法提高了甲酸及乙酸異丁酯的色譜保留，避免了其與溶劑峰重疊的問題，可實(shí)現(xiàn)短、中、長鏈脂肪酸的同步定量分析。

本研究通過優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，對(duì)27種脂肪酸進(jìn)行了定性定量分析，包括甲酸和乙酸等在內(nèi)的脂肪酸經(jīng)衍生化后，實(shí)現(xiàn)了與溶劑峰有效分離進(jìn)而被檢測(cè)。使用的FID及質(zhì)譜檢測(cè)器SIM采集方式的檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到十億分之一級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于短鏈及中鏈脂肪酸SIM響應(yīng)更高，對(duì)于長鏈脂肪酸FID的響應(yīng)優(yōu)于SIM；但在復(fù)雜樣本中或基質(zhì)干擾嚴(yán)重時(shí)，仍然應(yīng)使用SIM進(jìn)行分析以增加定量準(zhǔn)確性。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，該反應(yīng)在一定濃度動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)呈線性（R2＞0.99），且方法靈敏度高（LOQ＜10 pmol）。代謝物定量分析的日內(nèi)和日間RSD均小于10%，這表明當(dāng)樣本在常溫下放置24 h或在4 ℃下放置3 d時(shí)，此方法不影響甲酸和乙酸等易揮發(fā)性脂肪酸定量結(jié)果的穩(wěn)定性。因此，該方法可用于自動(dòng)化程度較高的大樣本脂肪酸定量分析研究。

本研究進(jìn)一步以典型常見生物樣本（血清、尿液、糞便、肝臟）為對(duì)象，對(duì)所建立方法的生物樣本基質(zhì)普適性進(jìn)行驗(yàn)證。通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液比對(duì)，在健康青少年血清、健康成年人尿液、嬰幼兒糞便和大鼠肝臟4種常見哺乳動(dòng)物的生物樣本中，分別可檢測(cè)到10、7、14和9種脂肪酸。其中，在糞便樣本中可檢測(cè)到多種短鏈脂肪酸且以乙酸含量最高，該結(jié)果與文獻(xiàn)[29]報(bào)道相符合；糞便中檢測(cè)到的丁酸源于腸道菌群對(duì)膳食纖維的發(fā)酵，其可作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的重要營養(yǎng)物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)pH值的功能，此外其還可作為G蛋白偶聯(lián)受體的天然配體。本研究盡管只聚焦27種代表性脂肪酸，但所建立的方法也可用于其他脂肪酸的定量分析，特別是血清與肝臟組織中的其他長鏈脂肪酸。此結(jié)果與本課題組使用甲酯化方法進(jìn)行脂肪酸定量分析的前期研究[25]相比，對(duì)長鏈飽和及不飽和脂肪酸的檢測(cè)處于同等數(shù)量級(jí)水平；雖然亞麻酸、二十烷酸等脂肪酸未被檢出，但本方法擴(kuò)大了短、中鏈脂肪酸的檢測(cè)覆蓋度，同時(shí)也為進(jìn)一步擴(kuò)大長鏈不飽和脂肪酸的檢測(cè)覆蓋度提供了可能。

綜上，本研究所建立的脂肪酸定量分析方法具有簡(jiǎn)便、快速、條件溫和的特點(diǎn)，可直接在水相中進(jìn)行衍生化反應(yīng)以減少代謝物損失，簡(jiǎn)化了前處理步驟，滿足了代謝組分析對(duì)通量的需求；同時(shí)，該方法增加了脂肪酸檢測(cè)的覆蓋范圍，可實(shí)現(xiàn)短、中、長鏈脂肪酸的同步定量分析。該方法為研究脂肪酸在生理病理狀態(tài)下的功能提供了重要的方法學(xué)基礎(chǔ)。