周 箴，徐云華，張菲菲，趙 藝，郭 林，付國龍，沈盛萍，冷雪嬌

1. 上海市胸科醫(yī)院，上海交通大學附屬胸科醫(yī)院，上海肺部腫瘤臨床醫(yī)學中心，上海 200030；2. 上海立迪生物技術股份有限公司，上海201203

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一和最常見的癌癥死亡原因之一，被認為是當今世界上對人類健康危害最大的惡性腫瘤，其中以非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）最為常見，約占肺癌的80%[1]。臨床上晚期肺癌的主要治療方式包括化學治療（化療）、放射治療（放療）及分子靶向治療等。盡管有多種化療藥物和分子靶向藥物在臨床上得到應用，但存在化療藥物效果不夠理想和分子靶向藥物易耐藥等問題。晚期肺癌患者的5年生存率仍很低，因此臨床上迫切需要尋找新的治療手段和治療靶點[2-4]。

近年來，腫瘤免疫治療技術發(fā)展迅速，其中以程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）及其配體程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）為靶點的免疫檢查點抑制劑在肺癌臨床治療中取得了突破性的進展，其機制是通過阻斷免疫細胞上的PD-1與腫瘤細胞上PD-L1的相互作用，從而解除T細胞活性的受抑狀態(tài)，促進T細胞再活化，從而發(fā)揮抗腫瘤效果[5-8]。隨著2015年PD-1抑制劑納武單抗（nivolumab）和派姆單抗（pembrolizumab）獲批用于轉移性鱗狀NSCLC和非鱗狀NSCLC的治療，免疫治療在肺癌的治療中越來越受到重視。同時，國內也陸續(xù)有自主研發(fā)的免疫檢查點抑制劑進入臨床試驗。

然而，PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的臨床療效僅為20%～45%，顯示出明顯的個體差異，并且存在由免疫介導產生的不良事件以及腫瘤快速進展等情況[9-10]。因此，明確哪些患者能從PD-1/PD-L1免疫治療中獲益是一個亟需解決的問題。

來源于患者原代腫瘤組織的人源異種移植（patientderived tumor xenograft，PDX）模型與傳統(tǒng)細胞系異種移植（cell-derived xenograft，CDX）模型[11-12]及基因工程鼠模型不同，其直接采用患者腫瘤組織來建立皮下移植瘤模型，能更好地保留腫瘤在個體中特殊的功能性基因結構及生物學標志物，更接近個體化的臨床生物學特征，重現人類癌癥的復雜狀態(tài)，如腫瘤細胞的異質性和腫瘤微環(huán)境等[13-14]，是目前國際公認的最能代表人類腫瘤遺傳信息特征的小鼠異種移植瘤模型[15-17]，能為藥物的篩選及療效觀察提供更好的預測。近年來，PDX技術發(fā)展迅速，展現出其在藥物篩選、療效評估、臨床同期治療效果預測和臨床后期耐藥原因剖析上的重要作用。在一定條件下，PDX樣本對傳統(tǒng)化療藥物的有效率和耐藥率的預測準確度可達90%和97%[15]。近年來人源化免疫PDX模型均建立在PDX模型的基礎上，使之同時包含人類腫瘤細胞和免疫細胞；該模型是評價新型免疫治療劑效果的一個具有巨大潛力的轉化醫(yī)學平臺[18-20]。長久以來，以人類CD34+造血干細胞和祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）為基礎的人源免疫系統(tǒng)重建是多數研究的重點[21-24]，但因為模型使用的小鼠為免疫缺陷小鼠，缺少T細胞發(fā)育所必需的胸腺，所以該模型小鼠體內無法形成成熟的T細胞，在細胞免疫和體液免疫方面均存在功能缺陷。此外，該模型構建時間長，構建過程復雜；而且人臍帶血來源的CD34+HSPC多來自不同個體，導致實驗結果不穩(wěn)定，因此該模型很難大規(guī)模應用。

目前僅有少量研究[25-26]使用外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）建立人源化免疫小鼠。PBMC包含已經發(fā)育成熟的免疫細胞，細胞功能完善，而且模型制備時間短，可以較快獲得人CD3+T細胞。因此，本研究在此基礎上探索了PBMC人源化免疫PDX模型的方法，對采用PBMC建立人源化免疫肺癌PDX模型的可行性進行了研究，并初步驗證該模型用于評估PD-1抑制劑治療NSCLC的效果。

1 材料與方法

1.1 腫瘤樣本

樣本來源于2015年8月—2017年12月在上海交通大學附屬胸科醫(yī)院治療的晚期NSCLC患者的胸腔積液或活檢組織（多數為肺癌小活檢組織，少數為遠處淋巴結活檢組織）。樣本入組標準為未見驅動基因突變、基因重排或融合的晚期NSCLC。本項目獲上海市胸科醫(yī)院倫理委員會審查及批準（KS1872）。

1.2 實驗動物

雌性CB17-SCID小鼠（重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠），6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2016-0006。雌性NCG小鼠（高度免疫缺陷小鼠），6～8周齡，購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，生產許可證號為SCXK（蘇）2015-0001。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海立迪生物技術股份有限公司SPF級動物房的獨立通風換氣（IVC）恒溫恒壓系統(tǒng)[實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2015-0015]，環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h/d明暗交替。在正式實驗前，適應性飼養(yǎng)5 d。

1.3 PDX模型建立

在生物安全柜中，取新鮮的活檢組織樣品，置于冰上，加Hank's平衡鹽溶液洗滌2次，剔除非腫瘤組織。將腫瘤組織切成1 cm×1 cm×1 cm大小，植入CB17-SCID小鼠的一側背部近腋窩的皮下（記為P0代）。患者的胸腔積液采用微流控技術（ClearCell FX1系統(tǒng)，新加坡Clearbridge BioMedics公司）富集腫瘤細胞，每只小鼠接種約5×106細胞至小鼠背部皮下（記為P0代）。當P0代腫瘤生長至500～800 mm3時，取出腫瘤，采用上述活檢樣品的操作，進行小鼠體內傳代（記為P1代），隨后傳代依次記為P2代、P3代……。傳代期間對小鼠體質量以及腫瘤大小進行觀察，并凍存腫瘤樣品。

取PDX模型傳代腫瘤組織經蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E染色）后行組織病理學觀察，驗證其與患者原始腫瘤組織病理形態(tài)的相似性。

1.4 腫瘤的PD-L1表達檢測

通過免疫組織化學法（免疫組化）檢測肺癌PDX模型傳代腫瘤組織PD-L1的表達情況。收集P1～P2代PDX腫瘤組織檢查樣本，用10%甲醛溶液固定，經過包埋、切片、脫蠟、抗原修復、背景封閉、PD-L1染色[ （E1L3N）XP?兔抗人PD-L1單抗，美國CST]、顯色等步驟進行PD-L1免疫組化染色。按照染色程度評分，評分標準如下：得分=染色密度評分（0～3分）×染色面積評分（0～3分）。若得分＜1分，則樣品PD-L1的表達為陰性（-）；若得分≥1分，則樣品PD-L1的表達為陽性。得分1～3分記為+，4～6分記為++，7～9分記為+++。

1.5 PDX模型人源化免疫重建

1.5.1 PDX腫瘤單細胞懸液的制備 將已建好的PDX模型傳代腫瘤（P1～P2代）自小鼠體內取出，于生物安全柜中去除非腫瘤組織和壞死組織；將組織剪切成1～3 mm3，使用膠原酶于37 ℃消化腫瘤塊1～2 h；200×g離心3 min，去除上清液，收集細胞懸液。

1.5.2 PBMC的分離與培養(yǎng) 取正常人外周血，用密度梯度離心法分離PBMC，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，細胞密度調整至3×106/mL。將分離的PBMC加入經絲裂霉素C處理的1×106/mL腫瘤細胞中，共培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)液為含10 ng/mL IL-2和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.5.3 細胞接種 收集共培養(yǎng)6 d后致敏的PBMC，與新鮮消化后的PDX腫瘤細胞按1:10的比例混合，接種約5.5 ×106細胞至NCG小鼠背部皮下。

1.5.4 免疫熒光檢測 待腫瘤組織長至100 mm3后取出，用4%多聚甲醛溶液固定、30%蔗糖溶液脫水、OCT包埋劑包埋后，進行冰凍切片，切片厚度為10 μm。用兔抗人CD45抗體（英國Abcam）作為一抗，Alexa Fluo 488標記的羊抗兔IgG（英國Abcam）進行二抗染色，DAPI進行核染色。

1.6 采用人源化免疫PDX模型評估PD-1抑制劑療效

待人源化免疫重建PDX模型上腫瘤長至約100 mm3時，將不同臨床樣本建立的模型小鼠分別隨機分成2組，即給藥組和對照組，每組6只。給藥組按20 mg/kg的劑量給予PD-1抑制劑信迪利單抗（sintilimab）注射液[信達生物制藥（蘇州）有限公司]，給藥頻率為每2 d 1次，腹腔注射，至實驗結束（至少21 d），給予CO2窒息處死。對照組給予PBS。每周測量小鼠體質量和腫瘤體積2次，腫瘤體積計算公式為V=0.5×ab2（a、b分別代表腫瘤的長徑和短徑）；并計算腫瘤生長抑制率（TGI，tumor growth inhibition）（%）=[1- （給藥組給藥后的腫瘤體積－給藥組首次給藥時的腫瘤體積） / （對照組給藥后的腫瘤體積－對照組首次給藥時的腫瘤體積） ]×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用Graphpad 6.0統(tǒng)計軟件進行作圖及數據處理，定量資料用表示，采用t檢驗比較組間差異。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDX模型建立

共獲得NSCLC患者44份活檢組織樣本和29份胸腔積液樣本，每份樣本接種1～2只小鼠。其中活檢組織樣本有15份建模成功，成功率為34.1%（15/44）；胸腔積液樣本有13份建模成功，成功率為44.8%（13/29）；總建模成功率為38.4%（28/73）。對成功建立的PDX模型進行編號，其中來源于活檢組織的以LUPF開頭，來源于胸腔積液的以CTC開頭。

通過H-E染色發(fā)現，PDX模型腫瘤與患者原始腫瘤的細胞病理形態(tài)相似（圖1），表明PDX模型能夠很好地保持臨床腫瘤的細胞形態(tài)特征。

圖1 患者臨床樣本與PDX模型腫瘤樣本的病理學觀察（H-E染色，×100）Fig 1 Pathological observation of clinical samples and PDX tumors (H-E staining, ×100)

2.2 免疫組化法檢測PD-L1的表達

對成功建立的28個肺癌PDX模型中的16個PDX模型P1～P2代進行PD-L1表達檢測，共發(fā)現6個PD-L1表達陽性的模型（表1，圖2）。

圖2 免疫組化法檢測PDX模型腫瘤的PD-L1表達Fig 2 PD-L1 expression in the tumors from PDX models by immunohistochemistry

表1 PDX模型腫瘤的PD-L1表達檢測結果Tab 1 Results of PD-L1 expression in PDX models

2.3 PDX模型人源化免疫重建

將新鮮消化后的PDX腫瘤細胞重懸，與致敏的PBMC混合后，接種至NCG小鼠皮下。28 d后，取人源化免疫PDX模型中的腫瘤組織，行CD45免疫熒光染色，檢測腫瘤組織中是否含有人源免疫細胞。結果發(fā)現CD45染色陽性的免疫細胞散在分布于腫瘤組織中，而未混合人PBMC的PDX模型中，未檢測到免疫細胞（圖3）。

本 研 究 分 別 選 擇 了 CTC15035、CTC160049、LUPF143的PDX模型腫瘤細胞來構建人源化免疫PDX腫瘤模型，其中CTC15035和CTC160049為PD-L1不同陽性表達水平的PDX腫瘤模型，LUPF143為PD-L1表達陰性的PDX腫瘤模型。人源化免疫PDX腫瘤模型的編號與原PDX模型編號保持一致。

圖3 人源化免疫PDX模型腫瘤組織的CD45免疫熒光染色（×200）Fig 3 CD45 immunof l uoresence staining in the tumor tissue of PDX model with humanized immunity (×200)

2.4 采用PBMC人源化免疫肺癌模型評估PD-1抑制劑的效果

CTC15035模型PD-L1表達呈強陽性（++），給予PD-1抑制劑后，腫瘤生長明顯被抑制，初次給藥后21 d PD-1抑制劑的TGI為82.6%；CTC160049模型PD-L1表達呈陽性（+），同樣看到PD-1抑制劑對腫瘤有一定的抑制作用，初次給藥后21 d PD-1抑制劑的TGI為11.9%；LUPF143模型PD-L1表達陰性（-），至初次給藥后42 d仍未觀察到PD-1抑制劑對腫瘤的抑制作用（圖4）。

圖4 PD-1抑制劑在人源化免疫腫瘤模型中的效果評價Fig 4 Evaluation of PD-1 inhibitors in PDX models with humanized immunity

3 討論

近年來，腫瘤免疫治療技術發(fā)展迅速，其中以PD-1/PD-L1為靶點的免疫檢查點抑制劑已在肺癌臨床治療中取得了突破性的進展，PD-1抑制劑派姆單抗和納武單抗已在中國獲批用于轉移性NSCLC的一線/二線治療。但是，PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的臨床療效有限。

本研究建立了能用于評估PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑療效的人源化免疫肺癌PDX動物模型，對于肺癌的抗腫瘤免疫治療的轉化醫(yī)學研究具有重要意義，為腫瘤免疫及其微環(huán)境的研究提供了一個動物模型的研究平臺。

傳統(tǒng)的PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑療效臨床前評價的指標體系是采用鼠源同系動物模型或人源腫瘤細胞系異種移植動物模型，但這些腫瘤模型存在著諸多缺陷。比如鼠源同系動物模型的免疫系統(tǒng)和人的免疫系統(tǒng)存在一定的差異，不能反映藥物在人體里的免疫作用機制。人源腫瘤細胞系在長期體外培養(yǎng)條件下，表現出均一的組織學特征，其生物學特性和分子特征已經和原發(fā)腫瘤相差甚遠。利用新鮮腫瘤標本，將腫瘤組織塊異種移植至免疫缺陷小鼠皮下，建立PDX模型，最大限度地保留了腫瘤的原有特性，是目前腫瘤新藥研究及轉化醫(yī)學研究最理想的動物模型[15,27]。許多實驗研究[28-31]表明，PDX腫瘤組織經過連續(xù)傳代，仍然保持與原始腫瘤相似的腫瘤特性，如腫瘤標志物、蛋白表達譜、基因組水平、藥物敏感性等。免疫系統(tǒng)人源化小鼠就是指通過移植人的造血干細胞或免疫組織、細胞，在小鼠體內重建人類免疫系統(tǒng)。近年來人們建立了有效的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，應用于人類免疫應答及相關疾病的研究。這種人源化小鼠模型還可應用于感染、腫瘤、移植等多個領域[12,32]。

本課題先在SCID小鼠上建立人肺癌PDX腫瘤動物模型，并將成熟的人PBMC與腫瘤細胞共培養(yǎng)，然后將共培養(yǎng)后的PBMC再與新鮮消化的腫瘤細胞混合直接注射于NCG小鼠皮下，使人的PBMC在小鼠腫瘤局部出現，成為腫瘤浸潤的免疫細胞，同時創(chuàng)建了腫瘤免疫微環(huán)境，由此建立了人源化免疫的肺癌PDX模型。本方法克服了通過尾靜脈注射PBMC[33-34]可能導致的宿主免疫排斥反應，同時保證了免疫治療藥物藥效方面數據的準確性。

臨床試驗數據（KEYNOTE-042研究）[35]表明：PD-1抑制劑如帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療必須有伴隨診斷，僅PD-L1表達≥1%的患者可以從治療中獲益，并且PD-L1表達水平越高，受益越多。我們選用PD-1抑制劑信迪利單抗對不同PD-L1表達水平的人源化免疫肺癌PDX模型進行腫瘤干預，觀察藥物療效，以此驗證我們建立的該模型能在動物體內評估PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的療效。實驗數據顯示：PD-L1表達陽性的人源化免疫肺癌PDX模型的腫瘤生長能被PD-1抑制劑抑制，并且PD-L1表達水平越高，TGI越大；但是，本實驗挑選的模型數量較少，證據尚不充分，有待在更多的不同PD-L1表達水平的模型加以驗證。

本研究的PBMC人源化免疫肺癌PDX動物模型可能可以幫助指導臨床用藥，比如預測NSCLC患者能否從PD-L1/PD-1免疫治療中獲益，以及研究是否有預測PD-1/PD-L1抑制劑臨床療效的其他生物學標志物；同時，該模型可以作為預測其他免疫治療方法臨床療效的新平臺。