王 齊，朱冠婭，謝 挺，葛 奎，牛軼雯

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科，上海 200011；2. 廣東省惠州市中心人民醫(yī)院燒傷外科，惠州 516001；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷整形科，上海市燒傷研究所，上海 200025

在糖尿病狀態(tài)下，糖代謝紊亂可導(dǎo)致組織局部的微環(huán)境發(fā)生一定的變化。研究[1]顯示，糖尿病創(chuàng)面愈合過程中，慢性遷延的炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)遲滯是其主要的病理特征。炎癥反應(yīng)階段，創(chuàng)面中的炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的浸潤(rùn)數(shù)量及促炎功能均存在一定的不足[2]。腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）是生理狀態(tài)下維持細(xì)胞代謝功能的主要能量物質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)下也可被作為損傷信號(hào)分子釋放到胞外以調(diào)控多種細(xì)胞效應(yīng)[3]。ATP通過激活嘌呤受體介導(dǎo)嘌呤信號(hào)，在炎癥細(xì)胞的趨化、吞噬和分泌等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，從而參與創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)[4-5]；由此推測(cè)，ATP代謝在創(chuàng)面愈合過程中與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。然而在糖尿病創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)階段，ATP代謝及嘌呤信號(hào)是否發(fā)生了改變？如若改變，其與糖尿病創(chuàng)面的遷延難愈是否存在一定聯(lián)系？基于此，本研究通過觀察在糖尿病創(chuàng)面愈合的炎癥反應(yīng)階段，創(chuàng)面組織中ATP代謝、嘌呤信號(hào)的改變以及外源性應(yīng)用ATP后對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合情況的影響，探索糖尿病創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸機(jī)制及可能的干預(yù)策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠96只[購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011]，體質(zhì)量為20～25 g。該實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)籠中，使用許可證：SYXK（滬）2011-0113。于25℃、濕度50%～60%、12 h明暗交替條件下，小鼠自由進(jìn)食、飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，所有動(dòng)物相關(guān)操作均遵循國(guó)家及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部有關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)定及條例。

鏈腺佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó)Sigma公司），3M透明敷料（美國(guó)3M公司），免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及糖尿病小鼠模型建立 96只雄性C57BL/6J小鼠被隨機(jī)分為4組，包括糖尿病空白對(duì)照組（DC組）、糖尿病ATP干預(yù)組（DA組）、正?？瞻讓?duì)照組（NC組）和正常ATP干預(yù)組（NA組），每組24只；其中DC組和DA組小鼠按照文獻(xiàn)[6]建立糖尿病小鼠模型，具體操作如下：禁食24 h后，每日向該組小鼠腹腔

注射1次STZ（50 mg/kg），連續(xù)5 d；采集小鼠在建模前、STZ注射3 d后及建模后連續(xù)8周（1次/周）的尾靜脈血，測(cè)定其隨機(jī)血糖并稱量體質(zhì)量；若建模前小鼠的血糖水平＜8.9 mmol/L，建模后每次監(jiān)測(cè)的血糖水平均≥16.7 mmol/L，體質(zhì)量明顯下降且出現(xiàn)多飲、多尿、體毛發(fā)黃，則視為糖尿病模型誘導(dǎo)成功。此外，于上述時(shí)間點(diǎn)對(duì)正常小鼠（NC組和NA組）行血糖水平監(jiān)測(cè)。

1.2.2 全層皮膚缺損創(chuàng)面模型制作 糖尿病模型建立成功后，參照文獻(xiàn)[7]制作全層皮膚缺損創(chuàng)面模型。所有小鼠經(jīng)腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉，而后剔盡其背部體毛，用脫毛膏去除殘存鼠毛；脫毛24 h后，再次向小鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉，而后使用9 mm直徑滅菌環(huán)鉆于其背部正中制造1個(gè)全層皮膚缺損創(chuàng)面。分別向DC組和NC組小鼠的背部創(chuàng)面上滴加雙蒸水（20 μL）作空白對(duì)照，向NA組和DA組滴加100 mmol/L ATP溶液20 μL行ATP干預(yù)。靜置數(shù)分鐘，待滴加溶液吸收后于創(chuàng)面加蓋3M透明敷料。分別于傷后第1、3、7、14日隨機(jī)挑選每組小鼠6只，切取創(chuàng)緣皮膚標(biāo)本后，用頸椎脫臼法處死小鼠。隨后，用10%緩沖福爾馬林溶液固定部分創(chuàng)緣皮膚組織標(biāo)本，并于1周內(nèi)制成蠟塊用于后期組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；部分新鮮標(biāo)本則分裝于1.5 mL離心管并于-80℃超低溫冰箱保存，用于檢測(cè)ATP、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）含量以及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的水平。

1.2.3 中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)觀察 取各組創(chuàng)緣傷后第1、3日的石蠟塊樣本，切片、脫蠟后行蘇木精 - 伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色），于光學(xué)顯微鏡下觀察第1、3日的創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，每張切片隨機(jī)選取創(chuàng)緣周圍 5個(gè)視野，計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞（分葉核）數(shù)量。

1.2.4 MPO水平檢測(cè) 按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書步驟，檢測(cè)各組創(chuàng)緣傷后第1、3日的創(chuàng)面愈合中MPO的含量。

1.2.5 ATP、ADP和AMP含量檢測(cè) 分別稱取創(chuàng)緣傷后第1日NC組及DC組標(biāo)本各1 g，加入15倍體積的甲醇 - 水溶劑（體積比4:1）和瓷珠，于快速研磨儀用 30 Hz的頻率研磨 3 min，在 4 ℃、14 000×g離心15 min，收取上清液。再向殘?jiān)屑尤?5倍體積的甲醇 -水溶劑（體積比4:1），按上述方法重復(fù)提取1次，合并2次提取的上清液。取400 μL上清液經(jīng)氮?dú)鈸]干后，加入100 μL 50%乙腈水溶液復(fù)溶，而后于4 ℃、14 000×g離心15 min，取上清液進(jìn)行超高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析。

采用HyperCarb PGC色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）用于分離待測(cè)物質(zhì)。流動(dòng)相中A為10 mmol/L乙酸銨的水溶液（pH=9，氨水調(diào)節(jié)），B為10 mmol/L乙酸銨的90%乙腈水溶液（pH=9，氨水調(diào)節(jié)）。采用梯度洗脫，起始流動(dòng)相為3%B，12 min后升至100%B并維持14 min，而后返回至3%B維持18 min平衡色譜柱，流速為0.3 mL/min。采用sMRM模式對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本同時(shí)檢測(cè)分析，通過AB Sciex公司Analyst軟件控制儀器、采集數(shù)據(jù)并進(jìn)一步對(duì)ATP、ADP和AMP含量進(jìn)行定量分析。

1.2.6 Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及 P2Y2表達(dá)的觀察 將傷后第1、3日創(chuàng)緣組織石蠟樣本切片、脫蠟后，用免疫組織化學(xué)染色分別標(biāo)記Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及P2Y2，并按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。隨意選取各組創(chuàng)緣組織石蠟切片標(biāo)本6張，每張切片于高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，粗略評(píng)估Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及P2Y2陽性表達(dá)的細(xì)胞量。

1.2.7 創(chuàng)面愈合評(píng)價(jià) 于全層皮膚缺損創(chuàng)面模型制作當(dāng)日及傷后第1、3、7、14日，用無菌透明塑料薄膜臨摹各組小鼠背部創(chuàng)面周徑后進(jìn)行圖像掃描，通過Image J軟件計(jì)算創(chuàng)面的面積，并用創(chuàng)面愈合百分比評(píng)估創(chuàng)面愈合情況。計(jì)算公式為：創(chuàng)面愈合百分比= （初始創(chuàng)面面積－觀察日創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.8 組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組傷后第7日創(chuàng)緣組織的H-E染色切片標(biāo)本，于光學(xué)顯微鏡下觀察愈合皮膚組織中肉芽生長(zhǎng)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及計(jì)數(shù)

創(chuàng)面組織經(jīng)H-E染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)階段的糖尿病創(chuàng)面的膠原纖維較纖細(xì)，排列紊亂稀疏，創(chuàng)緣組織炎癥細(xì)胞的集中分布較少；經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示，傷后第1日，糖尿病創(chuàng)面（DC組）中的中性粒細(xì)胞數(shù)量少于正常創(chuàng)面（NC組）（P=0.000），傷后第3日則多于NC組（P=0.002）（圖 1）。

圖1 DC組和NC組小鼠傷后第1、3日的創(chuàng)面中性粒細(xì)胞分布及計(jì)數(shù)（×200，H-E染色）Fig 1 Distribution and counting of neutrophils in the DC and NC groups on the fi rst and third day after being wounded (×200, H-E staining)

2.2 創(chuàng)面組織MPO水平檢測(cè)

與NC組相比，傷后第1日，DC組創(chuàng)面中MPO的含量較低（P=0.000），傷后第3日則DC組創(chuàng)面中MPO的含量較高（P=0.000）（圖2）。

圖2 ELISA檢測(cè)DC組和NC組小鼠傷后第1、3日創(chuàng)面的MPO含量Fig 2 MPO level in the DC and NC groups on the fi rst and third day after being wounded by ELISA

2.3 創(chuàng)面組織中ATP、ADP和AMP含量檢測(cè)

通過UPLC-MS/MS檢測(cè)DC組及NC組小鼠第1日創(chuàng)面中ATP、ADP和AMP的含量，結(jié)果顯示DC組小鼠創(chuàng)面中的ATP含量明顯低于NC組（P=0.010），而ADP、AMP含量在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 UPLC-MS/MS檢測(cè)DC組和NC組小鼠傷后第1日創(chuàng)緣組織中ATP、ADP及AMP含量Tab 1 Level of ATP、ADP and AMP in the DC and NC groups on the fi rst day after being wounded by UPLC-MS/MS

2.4 創(chuàng)面組織中Connexin43、Pannexin1陽性表達(dá)的觀察

研究[8]顯示，Connexin43、Pannexin1均表達(dá)于細(xì)胞膜。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記上述2種蛋白，觀察其在創(chuàng)緣組織細(xì)胞中的陽性表達(dá)情況。結(jié)果顯示，創(chuàng)面中Connexin43和Pannexin1的表達(dá)高峰出現(xiàn)在傷后第1日和第3日，隨后其表達(dá)量逐漸下降；且在傷后第1日和第3日，DC組小鼠創(chuàng)緣組織中Pannexin1及Connexin43的表達(dá)量均低于NC組（圖 3）。

圖3 免疫組織化學(xué)法觀察DC組和NC組小鼠傷后第1、3日創(chuàng)緣組織細(xì)胞中Connexin43、Pannexin1陽性表達(dá)（×200）Fig 3 Positive expressions of Connexin43 and Pannexin1 in tissues of wound margin of the DC and NC groups on the first and third day after being wounded by immunohistochemistry (×200)

2.5 創(chuàng)緣組織中CD39陽性表達(dá)的觀察

通過免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記CD39后發(fā)現(xiàn)，傷后第1日和第3日，DC組小鼠創(chuàng)緣組織細(xì)胞中CD39陽性表達(dá)量明顯低于NC組（圖4）。

圖4 免疫組織化學(xué)法觀察DC組和NC組小鼠傷后第1、3日創(chuàng)緣組織細(xì)胞中CD39陽性表達(dá)（×200）Fig 4 Positive expression of CD39 in tissues of wound margin of the DC and NC groups on the fi rst and third day after being wounded by immunohistochemistry (×200)

2.6 創(chuàng)緣組織中P2X7和P2Y2陽性表達(dá)的觀察

研究[9-10]顯示，P2X7和P2Y2受體主要表達(dá)于細(xì)胞膜。通過免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記P2X7和P2Y2受體觀察其在創(chuàng)緣組織細(xì)胞中的陽性表達(dá)，傷后第1日和第3日，DC組小鼠創(chuàng)緣組織細(xì)胞中P2X7、P2Y2受體的陽性表達(dá)量均低于NC組（圖5）。

圖5 免疫組織化學(xué)法觀察DC組和NC組小鼠傷后第1、3日創(chuàng)緣組織細(xì)胞中P2X7、P2Y2受體的陽性表達(dá)（×200）Fig 5 Positive expressions of P2X7 and P2Y2 receptors in tissues of wound margin of the DC and NC groups on the first and third day after being wounded by immunohistochemistry (×200)

2.7 創(chuàng)面愈合分析

通過動(dòng)態(tài)觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合過程發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比，糖尿病組小鼠的創(chuàng)面愈合過程有明顯延遲；而相較于DC組，DA組小鼠的糖尿病創(chuàng)面的愈合速度明顯加快。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，隨著時(shí)間的推移，4組小鼠的創(chuàng)面面積逐漸縮?。▓D6），愈合率從傷后第7日起出現(xiàn)明顯差異；傷后第14日，DA組小鼠的創(chuàng)面愈合百分比為（86.630±4.200） %，顯著高于DC組[ （72.390±2.862） %]（P=0.000），但仍低于NA組[ （98.998±1.650） %]（P=0.000），而NC組和NA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖6 4組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合情況Fig 6 Wound healing conditions of the mice in the four groups at different time points

表2 4組小鼠傷后第1、3、7、14日的創(chuàng)面愈合率比較Tab 2 Wound healing rate on the fi rst, third, 7th and 14th days after being wounded in each group

2.8 組織學(xué)形態(tài)觀察

于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠傷后第7日的創(chuàng)緣組織顯示，NC組和NA組小鼠的創(chuàng)緣組織可見大量新生肉芽組織及新生毛細(xì)血管，DC組小鼠創(chuàng)緣組織中僅可見少量肉芽組織，且膠原結(jié)構(gòu)稀疏紊亂，血管樣結(jié)構(gòu)較少；而與DC組相比，DA組小鼠肉芽組織中膠原結(jié)構(gòu)相對(duì)整齊且血管樣結(jié)構(gòu)較多，但仍不及NC和NA組（圖7）。

圖7 光學(xué)顯微鏡下觀察4組小鼠傷后第7日創(chuàng)緣組織中肉芽組織生長(zhǎng)和新生血管分布情況（×200，H-E染色）Fig 7 Growth of granulation tissue and distribution of neovascularization in the wound tissues of the mice in the four groups on the 7th day after being wounded by the light microscope (×200, H-E staining)

3 討論

當(dāng)外源性皮膚組織受損后，損傷刺激因子將啟動(dòng)炎癥 - 修復(fù) - 重塑進(jìn)程，最終達(dá)到創(chuàng)面的愈合。研究[11-12]顯示，組織細(xì)胞受損后會(huì)釋放多種具有免疫調(diào)節(jié)活性的內(nèi)源性物質(zhì)，即損傷相關(guān)模式分子（damage associated molecular patterns，DAMPs），參與協(xié)同激活先天免疫系統(tǒng)及調(diào)節(jié)獲得性免疫方向，對(duì)組織修復(fù)或異常重構(gòu)進(jìn)行調(diào)控。其中，ATP不僅是生理狀態(tài)下維持細(xì)胞代謝功能的主要能量物質(zhì)，應(yīng)激狀態(tài)下也可作為DAMPs分子實(shí)現(xiàn)對(duì)多種細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)控[13]。胞外ATP的主要來源有2種途徑，即受損、壞死細(xì)胞的直接釋放或特定信號(hào)介導(dǎo)的可控性釋放[14-15]。一般來說，幾乎所有組織細(xì)胞在特定的刺激下均可釋放ATP至胞外[5,16-17]。同時(shí)，受損組織局部的高濃度ATP在嘌呤受體P2的介導(dǎo)下可趨化炎癥細(xì)胞至創(chuàng)面組織啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，從而參與急性炎癥反應(yīng)過程[18-20]；而后，胞外ATP在嘌呤轉(zhuǎn)換酶CD39的作用下被水解為AMP或腺苷以終止P2信號(hào)[13]，且低濃度ATP或其降解產(chǎn)物（AMP和腺苷）可參與后續(xù)的組織修復(fù)重建過程[21-23]。作為創(chuàng)面愈合的起始階段，炎癥反應(yīng)過程有效順利的進(jìn)行與創(chuàng)面的如期愈合直接關(guān)聯(lián)[24]，那么在糖尿病創(chuàng)面早期炎癥階段，ATP代謝及嘌呤信號(hào)通路是否存在一定的異常呢？本研究通過免疫組織化學(xué)染色法觀察發(fā)現(xiàn)，在糖尿病創(chuàng)面愈合的早期炎癥階段（傷后第1日），ATP釋放通道蛋白（Pannexin1、Connexin43）、胞外ATP水解酶（CD39）及嘌呤信號(hào)受體P2（P2X7、P2Y2）的表達(dá)均較正常創(chuàng)面明顯減少；通過UPLC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖尿病創(chuàng)面組織中ATP、ADP及AMP的含量在傷后第1日低于正常創(chuàng)面；而在損傷早期給予小鼠創(chuàng)面外源性ATP后，則明顯加快了糖尿病創(chuàng)面的愈合速度。繼而提示，在急性損傷早期放大胞外ATP信號(hào)可在一定程度上加快糖尿病創(chuàng)面愈合。

前期研究[25-26]表明，相較于正常創(chuàng)面，糖尿病創(chuàng)面的早期炎癥反應(yīng)（傷后第1日）存在一定的不足，而在炎癥轉(zhuǎn)歸階段（傷后第3日），炎癥消退也呈現(xiàn)出一定的遲滯。作為中性粒細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志，MPO也是評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的常用指標(biāo)[27]。本研究通過對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)并評(píng)估MPO水平來對(duì)比糖尿病創(chuàng)面與正常創(chuàng)面愈合過程中炎癥反應(yīng)的差別，結(jié)果顯示：正常創(chuàng)面組織在傷后第1日可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，MPO水平較高，傷后第3日則中性粒細(xì)胞數(shù)量及MPO水平均下降；而與正常創(chuàng)面相比，糖尿病創(chuàng)面組織在傷后第1日的中性粒細(xì)胞數(shù)量及MPO水平均明顯偏低，傷后第3日則反之。上述結(jié)果再次提示，糖尿病創(chuàng)面的早期炎癥反應(yīng)不足，啟動(dòng)時(shí)相較正常創(chuàng)面有所延遲，且炎癥消退也較正常創(chuàng)面有所遲滯。

通過UPLC-MS/MS檢測(cè)創(chuàng)面ATP及其代謝產(chǎn)物（ADP、AMP）含量發(fā)現(xiàn)，傷后第1日，糖尿病創(chuàng)面含量均低于正常創(chuàng)面組織。但由于檢測(cè)方法的局限性，現(xiàn)有手段測(cè)定結(jié)果所顯示的為胞內(nèi)胞外總量，難以具體界定胞內(nèi)和胞外ATP的相應(yīng)含量，而真正起到啟動(dòng)急性炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氧化呼吸爆發(fā)的為胞外ATP[3]。因此，本研究進(jìn)一步結(jié)合創(chuàng)緣組織中ATP釋放通道蛋白、胞外ATP水解酶及嘌呤信號(hào)受體P2的表達(dá)來進(jìn)行綜合分析，間接評(píng)估胞外ATP的代謝水平。

皮膚組織損傷后，ATP不僅可以通過破損的細(xì)胞膜被動(dòng)釋放至損傷組織，還可通過細(xì)胞膜上的ATP釋放通道進(jìn)行可控性釋放。Pannexin1和Connexin43是組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)的2種ATP釋放通道蛋白，經(jīng)其釋放的ATP在中性粒細(xì)胞趨化過程中扮演著重要角色[28]。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，傷后第1、3日糖尿病創(chuàng)面組織細(xì)胞中Pannexin1和Connexin43陽性表達(dá)量明顯低于正常創(chuàng)面，提示炎癥反應(yīng)階段經(jīng)通道釋放至胞外的ATP相對(duì)較少。CD39又稱外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1（ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1，ENTPD1），能夠催化水解胞外ATP為ADP及AMP[13]。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，傷后第1、3日糖尿病創(chuàng)面組織細(xì)胞中CD39的陽性表達(dá)量亦明顯低于正常創(chuàng)面，提示糖尿病創(chuàng)面中ATP的分解代謝能力也處于較低水平。綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)階段相比于正常創(chuàng)面，糖尿病創(chuàng)面組織中胞外ATP代謝狀態(tài)低迷。

研究[23]顯示，組織中的胞外ATP主要通過激活嘌呤受體P2來激活嘌呤信號(hào)發(fā)揮作用，其也是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)。在創(chuàng)面愈合炎癥反應(yīng)階段，胞外ATP激活P2Y2受體與中性粒細(xì)胞的趨化、遷移、激活及氧化呼吸爆發(fā)密切相關(guān)[29]；且被激活的P2X7受體可參與多種炎癥細(xì)胞趨化因子和炎癥介質(zhì)的釋放[30-32]。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，傷后第1、3日糖尿病創(chuàng)面組織細(xì)胞中P2Y2和P2X7受體的陽性表達(dá)量明顯低于正常創(chuàng)面，提示在炎癥反應(yīng)階段的嘌呤信號(hào)也呈低水平狀態(tài)。

本研究通過進(jìn)一步給予小鼠創(chuàng)面外源性ATP觀察糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在傷后第14日糖尿病組小鼠的創(chuàng)面愈合速度雖然不及正常組小鼠，但DA組明顯高于DC組，提示外源性補(bǔ)充ATP可在一定程度上加快糖尿病創(chuàng)面的愈合。同時(shí)，通過組織學(xué)觀察傷后第7日各組小鼠的創(chuàng)面組織發(fā)現(xiàn)，DA組小鼠的新生血管數(shù)量較多且組織膠原排列更加整齊，提示外源性補(bǔ)充ATP可在一定程度上加速糖尿病創(chuàng)面的膠原沉積和血管新生。但上述情況與愈合早期炎癥反應(yīng)的時(shí)效性是否有直接聯(lián)系，仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，在糖尿病創(chuàng)面愈合過程的炎癥反應(yīng)階段，ATP代謝及嘌呤信號(hào)水平均呈低水平狀態(tài)，外源性補(bǔ)充ATP可加速糖尿病創(chuàng)面的愈合；繼而提示，胞外ATP代謝與創(chuàng)面炎癥修復(fù)進(jìn)程相關(guān)，且在急性損傷早期放大胞外ATP信號(hào)可促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。而究竟能否通過調(diào)控創(chuàng)面ATP代謝狀態(tài)，放大糖尿病創(chuàng)面急性炎癥期的嘌呤信號(hào)，以提高糖尿病創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的時(shí)效性，將有待于后續(xù)研究進(jìn)一步分析。