安云鶴，安 濤，武會娟，程小艷，馬 凱，陳爾凝，高麗娟

(1. 北京市理化分析測試中心 北京市基因測序與功能分析工程技術研究中心 北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100089； 2. 北京太和婦產醫(yī)院，北京 100195)

人體腸道內棲居著數以萬億計的微生物，統(tǒng)稱為腸道菌群，這些菌群在繁衍的過程中逐漸達到種類和數量的平衡,該平衡與機體正常代謝密切相關。這種平衡一旦被打破，會導致多種疾病的發(fā)生，如炎癥性腸道疾病、壞死性小腸結腸炎、糖尿病、肥胖、癌癥、過敏和哮喘等[1-4]。腸道菌群的建立始于出生，生命初期的腸道微生物區(qū)系會影響成年后的機體健康狀況[5]。因此，近幾年新生兒腸道微生物區(qū)系的定植規(guī)律及其影響因素成為人們日益關注的對象。

分娩方式是影響腸道菌群變化的主要因素之一[6]，也是目前的研究熱點之一。盡管國際上已經有比較多的關于剖宮產對嬰幼兒腸道菌群定殖影響的研究，但國內關于此方面的研究起步較晚，且方法多采用定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)或傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，且僅限于對特定菌種的比對分析[7-9]。本研究采用以高通量、速度快、成本低等為特點迅速發(fā)展的新一代測序技術，研究剖宮產和自然分娩兩種不同的分娩方式，對北京地區(qū)258例0～3歲嬰幼兒腸道微生物變化的影響，同時分析了兩種分娩方式造成的腸道微生物變化與年齡和身體質量指數(BMI)的相關性，旨在探討分娩方式造成的腸道微生物變化對0～3歲嬰幼兒生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

258例0～3歲健康嬰幼兒腸道糞便樣品取自北京海淀區(qū)、昌平區(qū)、豐臺區(qū)、石景山等社區(qū)，其中剖宮產樣品為97例、自然分娩的樣品為161例。所有志愿者均已簽署知情同意書。新鮮樣品收集于無菌糞便采集管中，冰上運輸，并于2 h內進行糞便DNA的提取，剩余糞便樣品或不能立即提取的糞便樣品置于-80℃保存。

1.2 糞便DNA提取

使用糞便基因組DNA提取試劑盒(天根，DP328)提取糞便樣本中的細菌基因組DNA，具體操作按照說明書進行。

1.3 文庫構建和測序

利用ExTaq酶對16S rRNA基因的V3可變區(qū)進行PCR擴增。擴增引物為：Forward: 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′, Reverse: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。每一條前向引物的5′末端均加入10 bp的一段barcode序列，用于區(qū)分不同條件的擴增產物。擴增條件是： 95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性1 min，48 ℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min，25 cycles；72 ℃ 再延伸10 min。將擴增產物按照每個100 ng的質量進行混合后，對混合產物進行末端補平加A、連接接頭和少量擴增進行富集。對構建好的文庫進行Agilent 2 100和QPCR質檢，合格后用于Miseq 2×150 bp的測序。

1.4 分析軟件

對測序得到的原始數據進行過濾，去掉接頭和低質量的測序序列，得到可用于后續(xù)分析的高質量數據，并用fastqc軟件對數據進行質量評估，使用FLASH軟件對高質量數據進行組裝，獲得更多含barcode的測序序列。再使用QIIME軟件根據barcode序列將該組裝結果回歸樣品，并對每個樣品的序列數進行統(tǒng)計。然后使用uclust軟件根據序列相似性(閾值為97%)進行聚類，得到OTU(操作分類單元)序列，并進行優(yōu)化和分類。本研究使用稀釋曲線表征樣品的測序深度；利用greengenes數據庫(201305版本)并根據分類學分析結果，分析樣品在各分類水平上的物種組成比例情況；物種豐度的顯著性差異用秩和檢驗，以Pvalue進行篩選；最后通過主成分分析以及關聯(lián)性分析表征腸道微生物的變化與年齡、BMI等參數的關系。

2 結果與分析

2.1 不同分娩方式0～3歲嬰幼兒腸道菌群的組成

將258例入組的嬰幼兒腸道樣品按照分娩方式分為自然分娩(161例)和剖宮產(97例)兩組，每組的平均測序reads數分別為136 393和106 642，從稀釋曲線來看，幾乎所有樣品都能達到測序的平臺期，即數據都已達到飽和狀態(tài)。圖1-A表明，在門水平上，自然分娩和剖宮產的微生物組成大致相同，主要由厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門和擬桿菌門組成，但在菌種的組成比例上有所不同。相比剖宮產的嬰幼兒，自然分娩的嬰幼兒糞便中含有更高比例的變形菌門(9.37% VS 6.89%)和放線菌門(16.86% VS 13.92%)，而厚壁菌門的比例(61.16% VS 67.17%)相對較低。在屬水平上(圖1-B)，菌群的變化與門水平類似。兩種分娩方式的腸道菌屬組成均包括雙歧桿菌屬、克雷伯氏菌屬、普氏糞桿菌屬、艾克曼菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬和巨單胞菌屬等，但這些菌屬的具體組成比例是有差別的。相比剖宮產的嬰幼兒，自然分娩的嬰幼兒糞便中含有更高比例的雙歧桿菌屬(15.74% VS 13.01%)、克雷伯氏菌克雷伯氏菌屬(2.13% VS 1.15%)和擬桿菌屬(8.32% VS 7.12%)，而普氏糞桿菌屬(10.78% VS 12.32%)、厚壁菌屬(4.18% VS 5.69%)和梭菌屬(1.53% VS 2.25%)的比例相對較低。

A:在門水平上，腸道菌群的組成情況；B:在屬水平上，腸道菌群的組成情況

圖1不同分娩方式嬰幼兒腸道菌群的組成情況

Figure 1 The composition of intestinal flora in infants with different delivery modes

2.2 不同分娩方式0～3歲嬰幼兒腸道菌群的豐度變化

在門水平上，自然分娩與剖宮產相比，豐度具有顯著變化(P<0.05)的微生物種類有放線菌門、厚壁菌門、柔膜菌門和酸桿菌門。其中，放線菌門(圖2-A)、酸桿菌門(圖2-B)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(16.86%、0.00204%)高于剖宮產嬰幼兒(13.92%、0%)；而厚壁菌門(圖2-C)和柔膜菌門(圖2-D)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(61.16%、0.051%)低于剖宮產嬰幼兒(67.17%、0.074%)。

A：放線菌門;B:酸桿菌門;C:厚壁菌門;D:柔膜菌門

圖2門水平不同分娩方式引起顯著變化的腸道菌群種類

Figure 2 Microbes with significant differences in different mode of delivery in phylum level

在屬水平上，自然分娩與剖宮產相比，共有22種微生物發(fā)生了顯著性變化(P<0.05)，其中包括雙歧桿菌屬、梭菌屬、毛螺菌屬、桿菌屬、帕拉普氏菌屬、嗜胨菌屬、普氏菌屬和羅斯氏菌屬8種菌屬。其中，雙歧桿菌屬(圖3-A)和毛螺菌屬(圖3-B)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(15.74%、1.68%)高于剖宮產嬰幼兒(13.01%、1.04%)；而梭菌屬(圖3-C)、桿菌屬(圖3-D)、帕拉普氏菌屬(圖3-E)、嗜胨菌屬(圖3-F)、普氏菌屬(圖3-G)和羅斯氏菌屬(圖3-H)在自然分娩嬰幼兒腸道糞便中的含量(1.53%、0.0063%、0.0049%、0.0087%、0.86%、1.29%)低于剖宮產嬰幼兒(2.25%、0.018%、0.028%、0.0041%、1.04%、1.66%)。

A:雙歧桿菌屬;B:毛螺菌屬;C:梭菌屬;D:桿菌屬;E:帕拉普氏菌屬;F:嗜胨菌屬;G:普氏菌屬;H:羅斯氏菌屬

圖3屬水平不同分娩方式引起顯著變化的腸道菌群種類

Figure 3 Microbes with significant differences in different mode of delivery in genus level

2.3 不同分娩方式與嬰幼兒年齡、BMI指數的相關性分析

首先，在整體水平上對0～3歲所有嬰幼兒腸道樣品進行了主成分分析，結果(圖4)發(fā)現無論是否考慮到菌群的相對含量，即加權(圖4-A)或不加權(圖4-B)的情況，剖宮產和自然分娩并沒有明顯的分群現象，二者呈大體一致的分散狀態(tài)，即它們的群落組成在整體水平上并沒有明顯的區(qū)別。

A:加權分析;B:不加權分析

圖4不同分娩方式嬰幼兒腸道菌群主成分分析

Figure 4 Principal component analysis of intestinal flora of infants with different modes of delivery

然后將樣品按照年齡段分為0～0.5、0.5～1、1～1.5、1.5～2、2～2.5和2.5～3歲6組，觀察剖宮產和自然分娩兩種不同分娩方式，隨著嬰幼兒年齡的增長是否會造成腸道微生物的改變。從圖5可以看到，在嬰幼兒0～0.5歲時，剖宮產的腸道微生物種類要高于自然分娩的微生物種類，剖宮產的嬰幼兒腸道微生物OTU數量是319，自然分娩的OTU數量是189.5。隨著嬰幼兒年齡的增長，在嬰幼兒0.5歲之后一直到3歲的5個時間段內，兩種分娩方式的腸道微生物種類數量基本相同，二者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖5 不同分娩方式造成的嬰幼兒腸道菌群變化與年齡的相關性分析

接下來，又對這些樣品按照嬰幼兒發(fā)育的身體質量指數(BMI)進行了分組，從而評價剖宮產和自然分娩兩種不同分娩方式造成的腸道微生物變化對嬰幼兒發(fā)育和健康情況的影響。從圖6可以看到，將樣品分為超輕、正常、超重和肥胖4組，在正常組中，剖宮產與自然分娩的腸道微生物種類即OTU數量分別為241.7和280.8，二者沒有顯著性差異；在肥胖和超輕的嬰幼兒腸道中，剖宮產的微生物種類數量高于自然分娩，它們的OTU數量分別是232.6 VS 215.5、281 VS 270；而在超重的嬰幼兒樣品中，剖宮產(OTU數量為154)的微生物種類低于自然分娩(OTU數量為237)，但所有這些差異均沒有顯著性(P>0.05)。

圖6 不同分娩方式造成的嬰幼兒腸道菌群變化與BMI的相關性分析

3 討論與結論

研究發(fā)現剖宮產嬰兒的腸道菌群定殖模式與自然分娩嬰兒的腸道菌群定殖模式不同[10]。有研究表明剖宮產嬰兒在出生后一年內擬桿菌屬缺失或延遲定殖[11-12]，以梭狀芽胞桿菌為主的嬰兒腸道細菌與分娩方式無關[13]。而另外一項發(fā)展中國家進行的研究表明，剖宮產分娩的嬰兒擬桿菌屬存在早期定殖的情況，這可能是由于周圍環(huán)境中的糞便細菌造成的，比如自然分娩的嬰兒腸道中，放線菌門的多樣性較高[14]。但這些菌群差異與分娩方式之間的關系仍然不清楚。這些研究中觀察到的相互矛盾的結果可能并非都歸因于用于檢測嬰兒早期腸道菌群的技術，因為厭氧屬或兼性厭氧菌可以同時通過依賴于培養(yǎng)的方法和獨立于培養(yǎng)的技術比如測序技術進行檢測。有研究對來自Pubmed、Medline、Embase和Web of Science四大數據庫的相關研究進行了篩選和整合，分析嬰兒出生后第一年分娩方式對其腸道微生物菌群變化的影響[15]。結果表明從出生到90 d，剖宮產分娩的嬰兒與自然分娩的嬰兒相比，放線菌門和擬桿菌門(如雙歧桿菌屬和擬桿菌屬)的多樣性顯著降低，但來自厚壁菌門的一些菌屬(以梭菌屬和乳酸桿菌屬為主)的豐度變化與分娩方式不相關。這與我們的研究結果類似，放線菌門和雙歧桿菌屬在剖宮產分娩的嬰幼兒腸道中含量明顯低于自然分娩的嬰幼兒，而厚壁菌門和梭菌屬在剖宮產分娩的嬰幼兒腸道中含量明顯升高。但我們沒有觀察到擬桿菌屬和乳酸桿菌屬的顯著變化。這種變化除了可能與檢測技術有關外，其他因素如出生地、母體陰道或皮膚微生物群、嬰兒喂養(yǎng)類型、出生體重、出生時的胎齡、出生后住院、產前服用益生菌和產前預防性抗生素等都會影響嬰兒腸道微生物菌群的模式[16]。例如，出生后抗生素的使用與梭菌屬的相對豐度較高、雙歧桿菌和擬桿菌數量減少有關[6,17-18]。缺乏與母體陰道微生物群的接觸，可能是剖宮產分娩嬰兒中厚壁菌門屬的豐度較高，擬桿菌門屬的定殖較晚的原因。之前的研究表明，擬桿菌屬可能在分娩期間從母體腸道傳播到新生兒[19-20]。剖腹產會減少嬰兒出生后第一個小時的母乳喂養(yǎng)，這可能破壞嬰兒腸道微生物群的多樣性和定殖模式。母乳喂養(yǎng)的嬰兒體內雙歧桿菌屬的含量更高。最近的研究表明，母乳中含有有益于腸道微生物群的因素，如母乳低聚糖(HMO)，通過刺激雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長來發(fā)揮益生元的作用，從而選擇性地改變腸道的微生物組成[21]。

此外，我們還發(fā)現兩個劣勢菌門的顯著變化：酸桿菌門和柔膜菌門，希望能引起研究者的關注。酸桿菌門是新近被分出的一門細菌，其在腸道生境中的研究相對較少，但已經確定酸桿菌門在環(huán)境樣本如土壤生境系統(tǒng)的維持中發(fā)揮重要作用[22]。而柔膜菌門在腸道微生物的研究中大多與疾病的發(fā)生發(fā)展相關[23]。但是這些劣勢菌在嬰幼兒的生長發(fā)育中究竟發(fā)揮多大的作用還有待于探討。

總之，剖宮產嬰幼兒腸道中厚壁菌門的豐度升高、放線菌門以及雙歧桿菌屬的豐度降低，均提示腸道菌群功能的改變。有研究指出嬰兒腸道微生物菌群的早期發(fā)育在宿主免疫系統(tǒng)的成熟、抵御病原體和提供營養(yǎng)方面起著重要作用[24]。有人認為，先天性和適應性免疫反應會影響腸道細菌組成。出生后腸道功能和免疫發(fā)育在很大程度上受腸道微生物菌群的影響，有研究表明早期微生物菌群的定殖可能影響晚期疾病的發(fā)生[25]。West等人觀察到嬰兒期的微生物多樣性較低，這先于過敏性疾病的發(fā)生[26]。Azad等人發(fā)現食物致敏的嬰兒，其3個月和1年時腸道微生物群中腸桿菌科較豐富，擬桿菌科較不豐富[27]。最新的研究表明[28]，通過評估嬰兒時期的腸道菌群，或許可以預測有超重或者肥胖風險的兒童?？茖W家們選取了165例嬰兒，并分析了他們成長到12歲的BMI數據，他們發(fā)現，在生命初期，腸道微生物群組成和后來的BMI指數之間存在某種聯(lián)系，隨著孩子年齡的增長，這種聯(lián)系變得強烈，特別是2歲時最為強烈，但此時的嬰幼兒對于以后是否發(fā)胖并不會表現出明顯的表型。我們的結果也表明，0～3歲嬰幼兒腸道微生物種類數量的變化不足以對嬰幼兒的生長發(fā)育造成顯著性差異，二者之間沒有相關性。并且，我們發(fā)現，0～3歲嬰幼兒腸道微生物種類數量的變化也不會隨著年齡的增長而使差異變得顯著。但有研究用meta分析的方法發(fā)現剖宮產與成年期BMI指數的增加，如超重和肥胖有很強的相關性[29]。這些結果提示，腸道微生物的變化是疾病的一個早期信號，這也為腸道微生物作為疾病早期預警的生物標記物奠定了一定的數據基礎。

綜上所述，剖宮產和自然分娩不影響0～3歲嬰幼兒腸道菌群組成，但是剖宮產會造成嬰幼兒腸道雙歧桿菌屬等益生菌的含量減低。這種個別菌群的變化在0～3歲之間，不會隨著嬰幼兒年齡的增長而在整體水平上造成顯著性差異，并且對嬰幼兒的BMI指數也不會造成顯著性差異。但剖宮產造成的某些菌群相對豐度的變化，是否會在嬰幼兒3歲以后造成其腸道菌群的顯著性變化，以及是否影響嬰幼兒對疾病的易感性以及恢復進度，還有待于進一步研究。因此，剖宮產作為一種終止異常妊娠的應急手段，還是要慎重選擇。