汪吳珺，劉智群，楊 勤，金小晶＊＊

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 南京 210000；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院 南京 210000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種革蘭氏陰性細(xì)菌病原體，易定植于胃粘膜，部分感染者會(huì)發(fā)展成慢性淺表性胃炎[1]。存在于Hp 表面的脂多糖（LPS）被認(rèn)為是引起Hp 感染的主要致病因子，其具有很 強(qiáng) 的趨化作用[2]。Kawahara 等[3]發(fā)現(xiàn)Hp 和LPS 可刺激豚鼠胃竇細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)，并誘導(dǎo)其中的炎癥反應(yīng)。

TLR4 是一種跨膜蛋白，屬于模式識(shí)別受體家族。TLR4 可以識(shí)別LPS 并激活NF-kB 等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[4]。Alvarez-Arellano L 等[5]經(jīng)試驗(yàn)證明，人感染Hp后，胃黏膜上可檢測到TLR4 表達(dá)增加。JAK2 可通過保守的JAK-STAT 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)出信號(hào)[6]。實(shí)驗(yàn)證明，Hp 含有的LPS 能夠募集和激活JAK2，從而催化p-STAT3[7]。因此，STAT3激活的一種新機(jī)制可能是通過TLR4/JAK2/STAT3。TLR4 能夠通過誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生來激活JAK2/STAT3。

因此，本研究通過構(gòu)建小鼠Hp 相關(guān)性胃炎的模型，并給予不同的藥物治療，觀察治療前后Hp 感染的療效及TLR4/JAK2/STAT3 含量變化情況，探討新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑治療Hp相關(guān)性胃炎的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物品系及菌株

SPF級(jí)6-8周C57BL/6（B6）小鼠50只，每組10只，雌雄各半，體質(zhì)量（20 ± 2）g，室溫保持在（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度為65%，按正常晝夜節(jié)律調(diào)整光照時(shí)間。小鼠由江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室（SYXK（蘇）2017-0069）提供，實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)及組織取材均在江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

HpSS1（Helicobacter pylori Sydney strain 1）菌株由江蘇省人民醫(yī)院消化科惠贈(zèng)，接種于哥倫比亞培養(yǎng)基（加入10%的脫纖維羊血），培養(yǎng)時(shí)的氣體條件為5%O2、10%CO2和85%N2，培養(yǎng)48-72 h，逐日觀察結(jié)果，培養(yǎng)物經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)判定陽性。

1.2 藥物

新蒲飲由川連6 g、蒲公英20 g、木香10 g、連翹20 g、檳榔10 g、百合30 g、生甘草9 g 組成，藥材均購于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院。將上藥浸泡、煎煮2次、取汁,去除殘?jiān)?4℃保存。奧美拉唑腸溶膠囊，常州四藥制藥有限公司,批號(hào)：H10950086。阿莫西林膠囊，珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司,批號(hào)：H20003263?？死顾胤稚⑵?，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：H9990376。

1.3 主要試劑與儀器

恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)：HWS-250，采購自上海精宏公司；超凈臺(tái)，型號(hào)：VS，采購自AIRTECH 公司；制冰機(jī)，型號(hào)：SIM-F40AY-P，采購自日本松下公司；烘箱，型號(hào)：MDL115，采購自德國Binder公司；酶標(biāo)儀，BioTek，型號(hào)：XSZ-02；Cari Zeiss 倒置顯微鏡，型號(hào)：Primovert，采購自Cari Zeiss公司；離心機(jī)，LDZ5-2，采購自Beijing Medical Centrifuge Factory 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)5 天，第6 天禁食12 小時(shí)后用灌胃器喂以5%NaHCO30.5 mL。15 min 后灌入菌液0.3 mL，2小時(shí)后給食。隔日一次，共3 次。感染后定植4 周。4周后每組取出2只小鼠進(jìn)行尿素酶檢測以及吉姆薩染色觀察小鼠感染情況。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

模型建立后，將50 只C57BL/6（B6）小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（10 只）、模型組（10 只）和給藥組（30 只）。將30 只給藥組小鼠隨機(jī)分為純中藥組、中西結(jié)合組、西藥組，小鼠連續(xù)給藥14天；對(duì)照組、模型組小鼠連續(xù)生理鹽水灌胃14天。2 周后各組隨機(jī)抽取2只小鼠做病理切片觀察炎癥情況，模型組、純中藥組、中西結(jié)合組、西藥組各小鼠以快速尿素酶法檢測胃組織Hp 感染，做吉姆薩染色觀察Hp分布及定植情況。

2.3 給藥

根據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值”直接換算，新蒲飲水煎后配制成濃度為0.68 g/mL的混懸液；用蒸餾水將奧美拉唑片配成濃度為0.26 mg/mL的混懸液、濃度為6.5 mg/mL的克拉霉素混懸液、濃度為13 mg/mL 的阿莫西林混懸液，純中藥組灌注新蒲飲混懸液；中西結(jié)合組灌注奧美拉唑混懸液30 min后，再灌注新蒲飲混懸液；西藥組先灌注奧美拉唑混懸液，30 min 后再灌注克拉霉素混懸液及阿莫西林混懸液，對(duì)照組與模型組灌注生理鹽水。給藥體積：灌胃0.1 mL/10 g,一天2次。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 快速尿素酶檢測

取胃竇部小彎側(cè)組織一塊行快速尿素酶試驗(yàn)，具體方法參照Hp 快速診斷試劑盒（尿素酶法）使用說明書，5 min 內(nèi)試劑由黃色變紅且紅暈擴(kuò)散，則尿素酶試驗(yàn)陽性。

2.4.2 吉姆薩染色法

將取出的胃黏膜標(biāo)本經(jīng)石臘包埋、切片。Giemsa染色方法[8]如下:①常規(guī)脫臘進(jìn)水,流水沖洗至切片清晰;②直接入1%Giemsa 染液中染色20-30min;③自來水洗去染液后直接入95%乙醇中分化后;④100%乙醇脫水;⑤常規(guī)透明(二甲苯),中性樹膠封片。高倍鏡(400倍)下找Hp,鏡下見典型細(xì)菌(呈小的短桿狀,稍彎曲紫蘭色)者診斷為Hp 陽性,Hp 感染的程度主要根據(jù)其累及的范圍判定。按悉尼系統(tǒng)規(guī)定輕、中度為單個(gè)細(xì)菌或少量細(xì)菌,累及范圍少于2/3 活檢材料;重度為大量細(xì)菌累及范圍大于2/3 活檢中的胃腺窩;在本研究中，將未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染的定為陰性，輕、中度定為弱陽性，重度定為陽性。

所有患者干預(yù)前、干預(yù)后6個(gè)月使用中文版糖尿病自我管理行為量表進(jìn)行評(píng)價(jià)。干預(yù)前由研究小組成員當(dāng)場發(fā)放并收回，干預(yù)后6個(gè)月時(shí)與患者電話隨訪時(shí)進(jìn)行量表的填寫及回收。

2.4.3 免疫組化評(píng)估TLR4、p-JAK2、p-STAT3

圖1 各小鼠胃組織粘膜Hp定植及炎癥情況

將組織樣本在10%甲醛中固定24 小時(shí)并石蠟包埋。使用高溫抗原去掩蔽技術(shù)使去石蠟化的組織載玻片進(jìn)行抗原修復(fù)。使用以下一抗：兔多克隆抗體抗TLR4（bs-1021R,1：100 稀釋;Bioss Antibodies）、兔多克隆 抗 p-STAT3（bs-1658R, 1：100 稀 釋; Bioss Antibodies）和兔多克隆抗p-JAK2（bs-1658R,1：100 稀釋; Bioss Antibodies）。通過應(yīng)用生物化三乙基二抗（Vectastain Universal Elite ABC Kit，Peterborough，United Kingdom）30 分鐘檢測結(jié)合的抗體。所有樣品均由兩位獨(dú)立的病理學(xué)家進(jìn)行讀片。

2.4.4 蛋白質(zhì)印跡分析

制備細(xì)胞裂解物，并通過BCA 蛋白質(zhì)測定試劑測量蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)（10-30μg）在8%或12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)在含有0.1%吐溫20（PBST）的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中的5%無脂奶粉中在室溫下封閉2小時(shí)。然后，將膜與含有3%無脂奶粉的一抗在PBS 中在4℃溫育過夜。洗滌膜，然后用1：3000 稀釋的各HRP-綴合的二抗孵育2 小時(shí)，并再次用PBST 洗 滌。TLR4、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、GAPDH 抗體均購買自Abcam 公司。用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯示表達(dá)的蛋白質(zhì)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

通過SPSS 軟件（版本22.0）和GraphPad Prism（版本5.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。通過Student's t 檢驗(yàn)分析兩個(gè)樣品的平均值的差異。P<0.05顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 小鼠胃組織吉姆薩染色法檢測結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 Hp治療效果

3.1.1 快速尿素酶結(jié)果

統(tǒng)計(jì)后可發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組Hp 感染陽性0 例；模型組陽性8例；純中藥組陽性4例，陰性4例；中西結(jié)合組陽性3例，陰性5例；西藥組陽性2例，陰性6例。

3.1.2 吉姆薩染色結(jié)果

電鏡下顯示：對(duì)照組未見明顯的Hp 聚集，相比之下，模型組胃黏膜表面可見大量的Hp 聚集成簇，呈稍彎曲紫蘭色、小的短桿狀；純中藥組可見部分Hp 聚集成團(tuán)，中西結(jié)合組和西藥組僅可見少量散在的Hp。見表1、圖1。

3.2 胃組織病理觀察

圖2 各組小鼠胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE染色,×400)

圖3 各組小鼠黏膜組織TLR4、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)（與對(duì)照組相比，#P<0.01，與模型組比較，*P<0.05）

本研究通過HE 染色法觀察各組之間胃組織病理變化情況。光鏡下顯示：對(duì)照組小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞完整，固有層內(nèi)有密集排列的腺體，個(gè)別小鼠胃黏膜底部可見少量散在的淋巴細(xì)胞，較少的炎性細(xì)胞浸潤到胃粘膜中；模型組細(xì)胞排列紊亂，粘膜下可見較明顯的血管擴(kuò)張充血腫脹，并伴有大量嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞存在于細(xì)胞間質(zhì)中，甚至可見部分組織腺體萎縮及不同程度的異型性；與模型組相比，純中藥組血管充血腫脹有所緩解，散在的炎癥細(xì)胞減少；中西結(jié)合組和西藥組細(xì)胞排列整齊，粘膜下血管稍有充血，僅見少量散在的炎癥細(xì)胞。見圖2。

3.3 不同治療方案對(duì)TLR4/JAK2/STAT3 信號(hào)通路的影響

首先，本研究提取各組小鼠胃黏膜蛋白進(jìn)行免疫組化分析和Western Blotting。與對(duì)照組相比，模型組胃粘膜蛋白TLR4 表達(dá)明顯增加，而JAK2 與STAT3 表達(dá)沒有明顯改變，但p-JAK2 與p-STAT3 表達(dá)顯著升高，與模型組相比，治療組的TLR4、p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)量都相應(yīng)減少，而JAK2、STAT3 的表達(dá)量未見明顯變化。與純中藥組相比，中西結(jié)合組TLR4、p-JAK2、p-STAT3 的蛋白表達(dá)更低，提示中西結(jié)合組降低TLR4、p-JAK2、p-STAT3 作用更強(qiáng)。西藥組與中西結(jié)合組TLR4、p-JAK2、p-STAT3 之間的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示中西結(jié)合組與西藥組效果相當(dāng)。結(jié)果見圖3。

免疫組化結(jié)果示：對(duì)照組小鼠胃黏膜組織未見TLR4、p-JAK2、p-STAT3 表達(dá)；模型組可見TLR4、p-JAK2、p-STAT3 有大量陽性表達(dá)；經(jīng)不同方案治療后，中西結(jié)合組和西藥組相較于模型組，小鼠胃黏膜組織TLR4、p-JAK2、p-STAT3 表達(dá)明顯減少，純中藥組也可見表達(dá)量減少，但減少程度不明顯。見圖4～6。

4 討論

圖4 各組小鼠胃黏膜組織TLR4蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×400)

圖5 各組小鼠胃黏膜組織p-JAK2蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖6 各組小鼠胃黏膜組織p-STAT3蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×400)

目前，Hp 是公認(rèn)的引起胃部炎癥的主要致病因素[9]，胃炎的炎癥程度不僅與胃黏膜上Hp 的分布密度和數(shù)量相關(guān)，同時(shí)也可因Hp 菌株釋放大量的空泡毒素，損害胃上皮細(xì)胞空泡，從而加速胃黏膜炎癥形成[10]。Hp 相關(guān)性胃炎在中醫(yī)中沒有正式的病名，大多根據(jù)患者的主要癥狀歸類于“痞證”“吞酸”“嘈雜”等[11]。隨著研究中藥治療Hp 相關(guān)性胃炎主要機(jī)理的程度不斷加深，研究藥物從單味藥到中藥復(fù)方，研究方法從體外藥效研究到體內(nèi)藥效研究，研究層面從組織水平到細(xì)胞分子水平，都證明了中醫(yī)藥在治療Hp感染相關(guān)性疾病中起著一定的積極作用[12-14]。

中國第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告中指出可以應(yīng)用中藥聯(lián)合西藥，作為根除Hp 感染的探索治療方法，并提出“中西結(jié)合”這一術(shù)語[15]。近年來許多研究結(jié)果表明，與單純應(yīng)用西藥或中藥治療相比，“中西結(jié)合”在治療Hp 相關(guān)性胃炎方面能夠充分結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn)，有效提高Hp 根除率，改善患者臨床癥狀[16]。因此，本研究通過建立Hp相關(guān)性胃炎小鼠的模型，并分別給予新蒲飲、新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑及西藥三聯(lián)治療后，觀察不同給藥方法對(duì)Hp清除的療效。

早期研究表明TLR4 活化是由細(xì)菌分泌的LPS 引起的細(xì)菌感染引起的[17]。且大量存在于多形核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，T 細(xì)胞和B 細(xì)胞中[18]。炎癥細(xì)胞中的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)可能導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子，免疫抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生[19]。有研究表明，TLR4的活化促進(jìn)復(fù)雜信號(hào)通路的激活，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）（p38，JNK 和ERK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和GTP 酶[20]。Janus激酶中JAK2是細(xì)胞增殖、分化、存活和衰老的重要因子。JAK2 還調(diào)節(jié)其他信號(hào)分子，包括RAS，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）等[21]。STAT3 是STAT 家族的成員，JAK2 一旦被激活，其自身的磷酸化（p-JAK2）可與STAT3 創(chuàng)建對(duì)接位點(diǎn)，從而激活誘導(dǎo)STAT3 的磷酸化（p-STAT3）[22]。p-STAT3 可形成二聚體并易位至細(xì)胞核并調(diào)節(jié)參與促進(jìn)細(xì)胞存活的靶基因（例如，c-Myc）的轉(zhuǎn)錄[23]。然而Hp 介導(dǎo)的STAT3 激活的分子機(jī)制尚未完全清[24]。有報(bào)道顯示，Hp 陽性的胃炎患者表現(xiàn)出p-STAT3 增加，并且隨著Hp 的根除，這些患者中p-STAT3 的表達(dá)顯著降低，提示p-STAT3在Hp 相關(guān)性胃炎中的重要作用[25]。有研究表明可通過抑制JAK2/STAT3 磷酸化從而抑制TLR4 的信號(hào)通路，最終抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[26]。綜上所述，本研究使用新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑治療Hp 相關(guān)性胃炎，可通過抑制TLR4 的活化，進(jìn)而抑制JAK2、STAT3 的激活，最終減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)通過快速尿素酶檢測以及病理吉姆薩染色證明小鼠造模成功。首先，統(tǒng)計(jì)小鼠治療前后滅幽情況，分析不同藥物對(duì)Hp 的清除效果；其次，觀察胃粘膜中TLR4、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 變化情況，分析新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑?qū)p 相關(guān)性胃炎TLR4/JAK2/STAT3 通路的影響。經(jīng)藥物治療干預(yù)后，相較于模型組，純中藥組、中西結(jié)合組以及西藥組胃組織蛋白中的TLR4、p-JAK2、p-STAT3 含量都有不同程度的降低，而JAK2、STAT3的含量均未見明顯變化；中西結(jié)合組和西藥組效果相當(dāng)，TLR4、p-JAK2、p-STAT3表達(dá)低于純中藥組。

隨著社會(huì)進(jìn)步，人際交往越來越頻繁，Hp 感染引起的相關(guān)性胃炎已經(jīng)成為影響現(xiàn)代人生活質(zhì)量的一個(gè)重要因素，因此，研究Hp 相關(guān)性胃炎的發(fā)生和治療也受到越來越多的重視。通過我們的研究可以發(fā)現(xiàn)，新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑可以通過TLR4/JAK2/STAT3 通路治療Hp相關(guān)性胃炎。