王智超，吳雨瀟，王振興，劉麗耘，張 秀，李 光，王 飛＊＊

（1. 成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院 成都 610075；2. 成都中醫(yī)藥大學國際教育學院 成都 610075；3. 曲靖市中醫(yī)醫(yī)院 曲靖 655000）

中醫(yī)證候動物模型是以中醫(yī)理論體系為指導，對疾病的病因和病理等重要特征進行模擬復制，同時具備西醫(yī)疾病和中醫(yī)證候雙重特征的實驗動物[1]，其關(guān)鍵在動物證候與人體證候的相似性[2]。證候是疾病過程中某一階段可被觀察到外在表現(xiàn)的概括，是不斷處于動態(tài)變化中的表征集合。但是，從中醫(yī)病證結(jié)合動物模型發(fā)展歷史來看[3]，研究大多忽視了“疾病過程中證候演變規(guī)律”這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，嚴重阻礙了對疾病證候本質(zhì)的研究及臨床應(yīng)用推廣。

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續(xù)氣流受限為特征的肺系疾病，與氣道和肺組織對煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，屬于“肺脹”的范疇[4]。目前，以辨證論治為基礎(chǔ)的COPD 病證結(jié)合模型存在諸多問題，嚴重制約著中醫(yī)藥防治COPD 的基礎(chǔ)研究。例如，藥物模擬的“證”與人體證候是否一致，如地塞米松磷酸鈉造陰虛痰飲證[5]、腺嘌呤加SO2誘發(fā)腎不納氣證[6]；復合因素相兼不利于模型制備的穩(wěn)定性、重復性，亦忽視了動物本身體質(zhì)因素等問題，如多個低溫因素疊加造COPD 寒飲蘊肺證[7]；證候判定中缺乏客觀定量、定性化的證候宏觀表征分析用以證明大鼠COPD 模型的證候歸屬。目前，國內(nèi)外廣泛使用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合煙熏制備COPD 疾病動物模型[8-9]，但此種動物模型缺乏明確的宏觀表征分析，中醫(yī)證候歸屬不明。

因此，本實驗采用COPD 經(jīng)典造模方法，以“因、脈、證、治”研究思路為出發(fā)點，同時引入宏觀表征和時間概念，對大鼠宏觀表征定量分析并分析COPD 動物模型的中醫(yī)證候演變規(guī)律，從而完整地挖掘疾病發(fā)展過程“證”的動態(tài)變化，找到證候變化的時間窗[10]，為慢性阻塞性肺疾病的中醫(yī)證候演變規(guī)律研究提供一定的參考。

1 實驗材料

1.1 實驗對象

SPF 級雄性SD 大鼠30 只，體重（150±10）g，購自于成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟腑病證實驗室動物房，室內(nèi)12 h/12 h 光照/避光循環(huán)飼養(yǎng)，溫度為（22±1）℃，房內(nèi)相對濕度約40%，同時給予標準飼料和飲用水，動物福利按照國際相關(guān)實驗動物法規(guī)實施。

1.2 試劑

脂多糖購自于美國Sigma 公司，香煙購自于四川中煙公司（每支香煙焦油含量14mg、Nicotine 含量1.1 mg、CO含量14 mg）。

1.3 儀器

自制煙熏箱（40*60*20 cm3），改良曠場籠具（70*70*20 cm3，底部黑色方格7*7 cm2），單反相機購自于日本Canon 公司，臺式機購自于美國HP 公司，抓力測量儀器、WMT-100 Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)購自于成都泰盟公司，全自動血氣分析儀購自于美國Medica公司，Eclipse Ci顯微鏡購自于日本Nikon公司。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后，通過水迷宮游泳剔除體力不達標大鼠后，按隨機數(shù)表法[11]將大鼠分為空白組和模型組。采用LPS 聯(lián)合煙熏法經(jīng)典造模方法復制COPD 模型，造模第1 天、第15 天，氣道滴注LPS 100 ul（1 μg/μl），滴注日不吸煙；空白組給予等體積生理鹽水氣道滴注。將大鼠放入自制煙熏箱內(nèi)進行煙熏，每次持續(xù)1 小時、每天兩次，共計30 天；空白組不吸煙。造模結(jié)束，采集各時段宏觀表征后麻醉大鼠，行腹主動脈取血進行血氣分析，隨后右股動脈放血處死大鼠。

2.2 一般情況

試驗期間，重點觀察大鼠活動情況、對外界反應(yīng)性、呼吸狀況、精神狀態(tài)、毛色毛質(zhì)、大小便、爪色舌色、進食量、飲水量、體重等指標，記錄大鼠死亡情況。

2.3 HE染色

取大鼠左側(cè)肺臟中葉，經(jīng)多聚甲醛固定48 h 后，石蠟包埋，制片（4μm 厚）；經(jīng)HE 染色后，置于顯微鏡下觀察病理改變。

2.4 呼吸頻率

安靜狀態(tài)下，將大鼠輕柔抓起，使用相機對大鼠胸腹面進行拍攝（1 min）。導入電腦后，慢速回放計數(shù)呼吸頻率。每2 周拍攝一次，共計3 次?；顒雍蠛粑l率在游泳后進行，余步驟同上。

2.5 抓力測定

大鼠置于抓力板上，待大鼠穩(wěn)定抓住抓力板時及時加力后拉，測取抓力，測量3次取平均值。

2.6 曠場試驗

將大鼠置于安靜、暗光的測試房內(nèi)10 min 后，將大鼠放置于曠場固定一處，遙控打開相機記錄數(shù)據(jù)，導入電腦后計數(shù)大鼠水平移動及直立次數(shù)。

2.7 負重力竭游泳實驗

室內(nèi)暗光，運用Morris 水迷宮系統(tǒng)進行實驗。按大鼠體重10%將鉛塊系于大鼠腹部后，從固定位置放入水池，直至全身力竭（鼻頭沉入水下持續(xù)10 s）后取出。每2周實驗一次，共計3次。

2.8 舌象、爪色、腹部毛色

采用標準白色背景布裁剪后制作攝影棚，光源采用佳能閃光燈（600EX II-RT）全功率輸出引閃；使用灰卡設(shè)置白平衡后，數(shù)碼相機調(diào)至M 檔，自動對焦，以F2.8、1/100s、ISO 100 條件采集圖像，導入電腦后做色彩校正[12]處理。

2.8.1 舌象

用彎鑷將其舌頭輕微夾出，露出舌根拍照。導入電腦后，使用Photoshop CS6 打開圖片，按照實際像素放大圖片后，選取舌面全部圖像，記錄直方圖中紅色值（R）、綠色值（G）、藍色值（B），計算出r 值（r =R/(R + G + B)，代表其紅色程度。

2.8.2 爪色

用彎鑷將其右側(cè)足底輕微夾緊拍照，余步驟同2.8.1。

2.8.3 腹部毛色

充分暴露大鼠腹面后拍照，余步驟同2.8.1。選取腹部自肋弓下緣至雙足部圖像，記錄直方圖中亮度值（L），代表其毛色亮度。

2.9 舌質(zhì)和舌下絡(luò)脈評分

參考尹軍祥等血瘀證舌象評級標準[13]，舌質(zhì)：紅潤記0 分、紅潤略暗記1 分、紫暗記2 分、紫黑記3 分；舌下絡(luò)脈：色紅記0 分、約1/3 舌體長記1 分、<1/2 長記2分、> 1/2 記3 分、> 2/3 記4 分。將圖片按實際像素裁剪后分別交由2位實驗員盲法打分，取平均值。

圖1 大鼠肺組織HE染色（×200）

2.10 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

空白組：大鼠動作敏捷、對外界刺激做出敏感反應(yīng)、無明顯扎堆現(xiàn)象；呼吸平穩(wěn)、無氣促；精神狀態(tài)良好、皮毛光澤白亮、無脫毛；便質(zhì)柔軟成型、小便清亮且量適中；進食量適中。

模型組：第一次滴注聯(lián)合煙熏后，大鼠反應(yīng)性降低、抵抗抓力下降、出現(xiàn)扎推現(xiàn)象；呼吸氣促、精神變差，皮毛無光、出現(xiàn)少量脫毛；大便偏干、小便色黃；食量減少。第二次滴注聯(lián)合煙熏結(jié)束后，大鼠出現(xiàn)明顯遲鈍、對外界刺激無明顯回應(yīng)，扎堆現(xiàn)象明顯，對灌胃抓取等無抵抗或抵抗較弱；呼吸氣促、鼻翼煽動、口腔內(nèi)分泌物明顯增多；皮毛色暗并出現(xiàn)大量脫落；便干量少、小便量少色黃；進食量下降，飲水量下降。并隨著造模完成后觀察時間的延長，上述體征逐漸加重。

3.2 HE染色

空白組：肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管粘膜完整，纖毛排列整齊，炎性浸潤少，見圖1（A）。模型組：肺組織中肺泡壁廣泛可見增厚，并伴有炎性細胞浸潤，支氣管腔內(nèi)可見較多壞死脫落的支氣管上皮細胞，部分支氣管上皮細胞水腫變性，細胞腫脹，胞質(zhì)呈空泡狀，支氣管壁周圍可見大量炎性細胞浸潤，見圖1（B）。

表1 大鼠血氣分析比較（±s，n=15）

表1 大鼠血氣分析比較（±s，n=15）

注：與空白組相比，*P＜0.01，**P＜0.001（以下圖、表標注均同）

組別空白組模型組pH值7.40±0.02 7.36±0.04 PaO2 97.13±3.79 87.13±6.69**PaCO2 41.36±6.72 49.50±2.24*

3.3 血氣分析

與空白組比較，模型組動脈血pH 值、氧分壓（PaO2）均顯著降低（P<0.001），二氧化碳分壓（PaCO2）升高（P<0.01）。

3.4 大鼠體表宏觀表征

3.4.1 體質(zhì)量

脾胃虧虛則運化無力，氣虛運化失常則可見動物飲食減少、體重下降，出現(xiàn)消瘦的表征。本次試驗中，空白組體重逐步穩(wěn)定增長；模型組體重增長幅度緩慢，且平均體重較空白組偏低，在第一次LPS 滴注（15天）后及造模完成（30天）后模型組體重較同時段空白組明顯降低，見圖2（A），P < 0.01，提示模型組大鼠出現(xiàn)了消瘦表征。

3.4.2 呼吸頻率

COPD 穩(wěn)定期患者常以喘息、氣短、呼吸頻率加快等癥狀為主，肺為氣之主，腎為氣之根，肺腎虧虛則大鼠可見呼吸頻率加快、活動后喘息氣緊等表征。空白組：大鼠呼吸頻率正常且平均，活動后呼吸均勻。模型組：呼吸頻率明顯加快，活動后呼吸頻率較空白組活動后呼吸變淺且加快（P<0.001），且與上一次呼吸頻率相比，呼吸頻率上升亦有統(tǒng)計學意義，見圖2（B）、表2，P < 0.05，表明模型組大鼠出現(xiàn)了喘息氣促等表征，且隨著觀察時間延長與上一次呼吸頻率相比出現(xiàn)了明顯的加快（見表2，P<0.01）。

3.4.3 抓力測定

乏力是COPD 后期常見癥狀，也是氣虛的代表性癥狀，通過對大鼠肌力測定，可評價其乏力程度。本次試驗中，模型組大鼠前上肢抓力較空白組下降明顯，見圖2（C）、表3，P<0.001，隨時間推移抓力持續(xù)下降，且在造模后期（30天）抓力較前一次觀測有明顯下降（P<0.01），表明乏力表征在觀察后期更為嚴重。

表2 大鼠呼吸頻率表征比較（±s，n=15）

表2 大鼠呼吸頻率表征比較（±s，n=15）

注：與模型組相比，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01，▲▲▲P < 0.001（以下圖、表標注均同）

呼吸頻率/(次/min)安靜狀態(tài)下30天141.47±6.42 269.73±7.15**91.07±5.38 143.6±14.26**▲▲活動后組別空白組模型組空白組模型組1天143.13±7.69 202.73±11.01**85.13±5.11 104.47±4.64**15天142.07±6.97 228.53±25.41**85.73±9.65 112.93±7.59**▲▲

表3 大鼠抓力表征比較（±s，n=15）

表3 大鼠抓力表征比較（±s，n=15）

組別空白組模型組1天11.99±1.95 8.18±0.82**15天12.45±1.49 7.81±0.56**30天13.10±1.10 6.57±0.71**▲▲

表4 大鼠毛色亮度表征比較（±s，n=15）

表4 大鼠毛色亮度表征比較（±s，n=15）

組別空白組模型組1天183.14±6.90 170.59±3.36**15天174.00±5.54 153.54±6.32**▲▲▲30天177.51±5.97 140.86±6.60**▲▲▲

表5 大鼠活躍度表征比較（±s，n=15）

表5 大鼠活躍度表征比較（±s，n=15）

曠場試驗水平移動距離直立次數(shù)組別空白組模型組空白組模型組1天14.6±1.40 10±1.51 2.6±0.83 2.07±1.33 15天16.27±1.98 8.8±1.37▲▲▲3.07±0.88 0.93±0.70▲▲30天17.2±1.78 6.8±2.04▲▲▲3±0.92 1.53±1.06▲▲

3.4.4 腹部毛色亮度值

肺在體合皮毛，皮膚毛發(fā)干枯無光是氣虛血瘀臨床常見癥狀。本次試驗中，空白組大鼠腹部毛色亮度較為均一、變化小。模型組大鼠腹部毛色亮度值較空白組偏低，見圖2（D）、表4，P<0.001，且亮度值逐漸下降（P<0.001）。

3.4.5 曠場試驗

曠場試驗是行為學實驗的一部分，其主要觀察動物對外界環(huán)境的適應(yīng)能力、探索能力，反應(yīng)動物的情緒變化，從某程度上反應(yīng)大鼠活躍度及懶動狀態(tài)。模型組大鼠直立次數(shù)較空白組逐漸降低，見圖2（E），P<0.01，這表明大鼠對外界新環(huán)境的不敏感。水平行走距離較空白組有明顯縮短，提示模型組大鼠懶動的表征，見圖2（E）、表5，P<0.001。

3.4.6 負重力竭游泳實驗

通過游泳時間和距離的分析，可觀察動物活動耐力情況，并與抓力測定共同評價大鼠乏力程度。與空白組力竭游泳相比，模型組力竭游泳時間、距離明顯縮短，見圖2（G）、表6，P<0.001。隨著時間推移模型組大鼠力竭游泳時間、距離逐漸下降（P < 0.01）且從游泳距離看30 天觀察期較前活動距離明顯下降（P <0.001），表明隨著時間延長大鼠耐力下降更為明顯，并與抓力實驗相互印證了疾病末期氣虛乏力表征的嚴重程度。

3.4.7 舌色、爪色

舌象是證候的關(guān)鍵組成部分，是中醫(yī)診斷學的特色診法，因此在動物表征的觀測中舌象也是重要指征。其包括了舌色和舌底靜脈長度兩部分內(nèi)容作為量化評分的標準。我們可以看到空白組舌色淡紅而潤、爪色紅而有光澤；模型組舌色暗紅、爪色暗紅而干瘦。模型組大鼠爪色、舌色R 值明顯高于空白組（P<0.001）；舌色r 比值在造模后15 天與空白組相比顯著降低（P < 0.01），爪色r 比值在造模后30 天與前一次r比值降低具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），這提示在造模過程中大鼠舌色、爪色暗紅，血行不暢的瘀血表征且造模后30天較前一次紅色更深，表明瘀血表征在后期表現(xiàn)更為嚴重。見表7。

3.4.8舌質(zhì)和舌下絡(luò)脈評分

空白組舌質(zhì)鮮紅而潤、舌下絡(luò)脈清晰；模型組舌質(zhì)暗紅而干、舌下絡(luò)脈迂曲且粗長。模型組從造模1天后舌下絡(luò)脈瘀滯評分較空白組開始出現(xiàn)增高（P <0.01），自造模后15 天評分較空白組明顯增高（P <0.001），舌質(zhì)評分在造模后15 天與空白組相比升高具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表8、圖3。

表6 大鼠力竭游泳表征比較（±s，n=15）

表6 大鼠力竭游泳表征比較（±s，n=15）

負重力竭游泳實驗游泳時間/秒游泳距離/cm組別空白組模型組空白組模型組1天452.79±43.48 379.46±14.83**5621.57±648.83 4018.12±471.89**15天442.81±29.24 280.04±40.82**▲▲▲5856.73±857.84 3329.65±621.92**▲▲30天454.42±47.82 217.75±35.43**▲▲▲5925.75±588.79 2446.83±308.91**▲▲▲

圖2 大鼠體表宏觀表征

表7 舌色、爪色RGB比值（±s，n=15）

表7 舌色、爪色RGB比值（±s，n=15）

組別r值空白組模型組組別造模后15天132.80±9.74 105.83±5.59**造模后30天133.77±10.10 94.50±9.29**造模后1天0.55±0.02 0.54±0.01造模后15天0.56±0.02 0.53±0.02*造模后30天0.54±0.02 0.53±0.021舌色R值造模后1天138.36±6.63 120.75±5.69**爪色R值造模后1天179.19±8.805 148.16±10.604**造模后15天171.04±8.233 138.11±7.973**r值空白組模型組造模后30天174.63±7.694 126.48±8.631**造模后1天0.44±.012 0.43±.015造模后15天0.44±.014 0.44±.011造模后30天0.44±.014 0.41±.043▲

4 討論

病證結(jié)合動物模型為疾病的證候?qū)嵸|(zhì)研究提供了新媒介。目前，該類模型主要采用多因素造模方法模擬中醫(yī)病因?qū)W發(fā)病，但是造模因素復雜、中醫(yī)特色不鮮明、缺乏有效公認的定量定性觀測指標、穩(wěn)定性及可重復性差等問題阻礙了對證候本質(zhì)研究[14-15]。因此，選用可納入中醫(yī)病因?qū)W的造模方法，采用可定量、定性分析癥狀、判斷證候歸屬的四診手段，構(gòu)建與動物模型相適應(yīng)的指標體系、量化標準，獲取穩(wěn)定、可重復構(gòu)建證候模型具有重要意義。王永炎院士對此提出四診信息所反映的整體狀態(tài)是證候模型評價的標準[16]，動物表征就是模型動物的某些體表特征表現(xiàn)人體癥狀[17]，這符合中醫(yī)學“視其外應(yīng)，以知其內(nèi)臟”的整體診病思想，為證候模型判定提供了新思路。

表8 舌質(zhì)分級評分（±s，n=15）

表8 舌質(zhì)分級評分（±s，n=15）

組別空白組模型組舌質(zhì)舌下絡(luò)脈造模后1天0.46±0.63 0.66±0.72造模后15天0.46±0.63 1.46±0.63**造模后30天0.26±0.45 2.33±0.61**造模后1天0.60±0.73 1.13±0.51*造模后15天0.40±0.50 2.33±0.72**造模后30天0.80±0.67 3.13±0.83**

圖3 舌下絡(luò)脈演變圖像

本實驗采用煙熏聯(lián)合氣道滴注LPS 的造模方式，通過HE染色、血氣分析從現(xiàn)代醫(yī)學角度證實COPD疾病模型的成功制備。對動物模型的宏觀表征定量分析提示COPD 模型大鼠首先出現(xiàn)了平靜及游泳后呼吸頻率加快、喘息氣促、動則尤甚的表征；體重減輕、增幅小的消瘦表征；毛色亮度值偏低等毛發(fā)干枯、無光澤的表征；力竭游泳時間距離縮短、活動能力不足、四肢抓力下降的神疲乏力、懶動、肌力下降等表征。隨著觀察時間延長，大鼠上述表征并未得到明顯好轉(zhuǎn)，且舌質(zhì)、舌色及舌下絡(luò)脈評分出現(xiàn)了明顯血瘀征象。從疾病模型反應(yīng)證候特征的宏觀表征入手是四診信息的連續(xù)全面收集的關(guān)鍵，也是對證候中相關(guān)癥狀體征客觀評價的核心。

基于對大鼠生物表征的連續(xù)動態(tài)觀測，本研究認為LPS聯(lián)合煙熏長期作用于肺臟，肺失宣降而發(fā)本病，肺在體合毛而見毛發(fā)干枯；子盜母氣，脾失健運而消瘦；久病臟腑功能減退，故神疲乏力、少氣懶動；氣虛運血無力，血行遲緩脈絡(luò)瘀滯，而見舌暗紅脈絡(luò)瘀阻。從病因?qū)W角度出發(fā)[18]作為顆粒物暴露的煙草燃燒以鼻竅、口咽為侵入途徑，初期損傷人體一身之氣，肺為華蓋當先受其害；后期入血伏于陰分而攜瘀挾滯，痹阻肺絡(luò)。LPS近年來從中醫(yī)病因?qū)W角度被認為是外源性污穢之血[19]，作用于動物可致血瘀。

綜上所述，本實驗通過以公認的造模因素及實驗動物為載體、連續(xù)相關(guān)定量評價指標體系為依據(jù)，參考“生物表征”及“因、脈、證、治”的理論為基礎(chǔ)的研究思路建立證候模型。煙熏聯(lián)合LPS 制備COPD 穩(wěn)定期疾病大鼠模型既與西醫(yī)病理改變相一致，又具備中醫(yī)病因特征，其證候演變早期以氣虛為重，晚期由虛致瘀出現(xiàn)了氣虛血瘀的證候表征。本次實驗以西醫(yī)病因病理造模方法為出發(fā)點，具有良好的穩(wěn)定性及重復性，使實驗結(jié)果趨于穩(wěn)定且具有可比性，同時克服了造模方法缺乏中醫(yī)病因?qū)W支持的缺陷，并對動物宏觀表征的定量化分析，使病證結(jié)合模型更加具有邏輯性、客觀性和科學性[20]，對COPD 穩(wěn)定期益氣活血方藥的機制研究、證候本質(zhì)的挖掘工作具有一定的科研應(yīng)用價值。