張軍建 張礦召

研究表明，HCV NS3蛋白與HCV相關(guān)的肝細(xì)胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系[1],但其確切機(jī)制尚不明確。端粒酶(telomerase)的激活是細(xì)胞惡變和異常增殖的標(biāo)志，HCV NS3蛋白可以激活肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的端粒酶活性，可能是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[2]。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HCV NS3蛋白的人正常肝細(xì)胞模型，用于研究HCV NS3基因?qū)θ苏８渭?xì)胞的增殖情況以及對端粒酶的影響。

材料與方法

一、材料

(一)細(xì)胞株、質(zhì)粒和菌株 人正常肝細(xì)胞株L02購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，質(zhì)粒pcDNA3.1(+)與大腸埃希菌菌株DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自Thermo Fisher Scientific 公司，用于目的基因的插入和擴(kuò)增。

(二)酶與試劑 胎牛血清、胰酶、G418、1640培養(yǎng)基和脂質(zhì)體Lipofectamine2000系美國Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ購自MBI 公司；T4 DNA 連接酶購自大連寶生物公司；Qiagen Plasmid Midi 試劑盒質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen 公司；PCR 試劑盒、RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒、DNA 分子質(zhì)量標(biāo)記均為Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；MTT為Amresco公司產(chǎn)品； HCV NS3 單克隆抗體(MA1-21376)購自美國Invitrogen公司；端粒酶檢測試劑盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)購自德國Roche公司。

二、方法

(一)質(zhì)粒構(gòu)建 以HCV基因亞型2a的JFH1病毒株為HCV NS3擴(kuò)增模板，利用軟件設(shè)計PCR 引物，引物兩端分別加上Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的片段進(jìn)行序列測定確認(rèn)PCR 擴(kuò)增無誤。分別對鑒定后的HCV NS3平端基因片段和pcDNA3.1(+)用內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，并用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆進(jìn)行測序鑒定。鑒定后的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并將pcDNA3.1(+)/HCV NS3質(zhì)粒用試劑盒提取和純化。

(二)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000說明書操作。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：10%滅火胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2。將pcDNA3.1(+)/HCV NS3質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，另外設(shè)定沒有轉(zhuǎn)染的L02細(xì)胞為對照組。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含有400 mg/L G418的培養(yǎng)基進(jìn)行加壓篩選，當(dāng)對照組細(xì)胞完全死亡后，改用150 mg/L G418的選擇培養(yǎng)基維持篩選，將篩選后的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株挑選單個克隆，用RT-PCR的方法鑒定后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

(三)蛋白質(zhì)印跡檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中HCV NS3蛋白表達(dá) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗3次后，用RIPA裂解細(xì)胞，離心后取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實驗。首先進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉2 h，PBST洗膜3次，用一抗HCV NS3 單克隆抗體HCV NS3(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次,用相對應(yīng)二抗室溫孵育1 h(1∶5 000稀釋), PBST洗膜3次后用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。

(四)MTT法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)后對細(xì)胞的增殖影響 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，pcDNA3.1(+)細(xì)胞，pcDNA3.1(+)/HCV NS3細(xì)胞接種至96孔板，每孔5000個細(xì)胞,每種細(xì)胞32個孔，一共4塊96孔板，分別在24、48、72、96 h檢測細(xì)胞增殖情況。方法為吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗兩遍后，加5 g/L的MTT 20 μL到每個孔，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在每孔中加入150 μL DMSO，輕輕振蕩10 min后用酶標(biāo)儀測定各孔的A值(波長490 nm)。

(五)細(xì)胞hTERT mRNA檢測 人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase , hTERT)活性的檢測嚴(yán)格按照端粒酶檢測試劑盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)說明書進(jìn)行。收集3組細(xì)胞，并用冷的PBS洗滌3遍，細(xì)胞裂解后抽提細(xì)胞總RNA，然后PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物按照試劑盒進(jìn)行雜交和ELISA實驗，結(jié)果用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定(波長450 nm)。

結(jié) 果

一、分組

本實驗研究中一共有3組細(xì)胞，即空白細(xì)胞組(L02細(xì)胞)，陰性對照組[轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的LO2細(xì)胞，標(biāo)記為pcDNA3.1(+)細(xì)胞]和實驗組[轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)/HCV NS3質(zhì)粒，可以穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白HCV NS3的L02細(xì)胞株，標(biāo)記為pcDNA3.1(+)/HCV NS3細(xì)胞]。

二、細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后HCV NS3蛋白表達(dá)的檢測

細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，用蛋白質(zhì)印跡檢測3組細(xì)胞的HCV NS3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，可以在pcDNA3.1(+)/HCV NS3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株檢測到HCV NS3蛋白(72KD)的表達(dá)，而pcDNA3.1(+)細(xì)胞和L02細(xì)胞沒有。說明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株pcDNA3.1(+)/HCV NS3建立成功。見圖1。

注：1.L02細(xì)胞；2.pcDNA3.1(+)細(xì)胞；3.pcDNA3.1(+)/HCV細(xì)胞

圖1蛋白質(zhì)印跡檢測3組細(xì)胞HCV NS3蛋白的表達(dá)

三、MTT法檢測HCV NS3對L02細(xì)胞的增殖的影響

24、48、72、96 h 4個時間點L02細(xì)胞和pcDNA3.1(+)細(xì)胞的增殖情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)，而pcDNA3.1(+)/HCV NS3細(xì)胞在48、72、96 h表現(xiàn)出了明顯的增殖優(yōu)勢，與LO2細(xì)胞和pcDNA3.1(+)細(xì)胞相比，48、72和96 h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。

表1 MTT實驗檢測3組細(xì)胞的增殖

四、HCV NS3對L02細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)的影響

3組細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行以雜交為基礎(chǔ)的ELISA檢測。結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)/HCV細(xì)胞的A450為(1.933±0.027)明顯高于pcDNA3.1(+)的(0.809±0.017)和L02細(xì)胞的(0.735±0.033)，說明pcDNA3.1(+)/HCV細(xì)胞中的hTERT mRNA的表達(dá)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

目前，沒有疫苗可以預(yù)防HCV感染，這就使得針對HCV的研究尤為重要[5-11]。

HCV NS3蛋白已被證實與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。Kasprzak 等[12]發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)的HCV NS3 蛋白可通過抑制P21的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Zhu等[13]證實HCV可以激活端粒酶活性，從而增加宿主細(xì)胞癌變行為的可能性?；诖?，本研究以人永生化的正常肝細(xì)胞L02作為研究對象，構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/HCV NS3重組質(zhì)粒，并建立了可以穩(wěn)定表達(dá)HCV NS3蛋白的L02細(xì)胞株，以更準(zhǔn)確的模擬病毒的慢性感染過程。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡檢測， 有HCV NS3蛋白的表達(dá)，提示細(xì)胞株造模成功。在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中,觀察到pcDNA3.1(+)/HCV NS3細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞大小不同，偶可觀察到多核巨細(xì)胞，生長速度快，傳代時間變短等特點。經(jīng)MTT法檢測，重組了HCV NS3基因的L02細(xì)胞生長速度明顯增快，說明HCV NS3蛋白可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。

hTERT是人端粒酶復(fù)合物的催化亞單位[14-15]。本研究中使用的L02細(xì)胞是永生化的人正常肝細(xì)胞，故未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也可以檢測到hTERT mRNA的表達(dá)，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HCV NS3基因的L02細(xì)胞株檢測到的hTERT mRNA的表達(dá)量要明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些結(jié)果提示HCV NS3蛋白可以上調(diào)L02細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)。前期研究表明，端粒延伸不再縮短會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增值，因此， hTERT基因的上調(diào)和引起的端粒酶激活可能是HCV NS3蛋白促進(jìn)正常肝細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制。