柏海濤 陳文兵 劉歡

膿毒癥(sepsis)是臨床常見的急危重癥，急性肝損傷( acute liver injury，ALI)是膿毒癥最早見的靶器官損傷[1]，炎癥因子的大量激活是膿毒癥患者器官損傷的主要機制，急性肝損傷也與炎癥因子的過度激活密切相關(guān)[2]，抑制炎癥反應保護肝功能在膿毒癥的治療中已經(jīng)被證實[3]。核因子 κB( nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路是膿毒癥炎癥因子激活釋放的主要調(diào)節(jié)通路[4]，白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是多酚類化合物，主要來源于花生 、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗炎、抗氧化的作用，可以作為動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑[5]。本研究觀察白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肝損傷的保護作用，并探討NF-κB炎性通路在其中的可能作用。

資料與方法

一、實驗材料和方法

健康雄性SD大鼠購于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心，體質(zhì)量210 ～ 240 g，共 40只，在動物中心清潔級適應性喂養(yǎng)3 d后，進行后續(xù)實驗造模和研究。

二、方法

(一)膿毒癥造模 40只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(10只)和造模組(30只)，盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)制作膿毒癥大鼠實驗模型。簡述如下：備皮消毒后，30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿腹正中線做1.5 cm切口，找到盲腸，游離腸系膜，距盲腸末端1/3處用 4 號手術(shù)線結(jié)扎，穿刺盲腸腸管，將盲腸還納腹腔，關(guān)閉腹腔，術(shù)后皮下注射生理鹽水抗休克治療。10只假手術(shù)組大鼠僅僅分離盲腸，不做結(jié)扎和穿孔。術(shù)后30只造模SD 大鼠隨機分為膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預組，每組15只，白藜蘆醇干預組大鼠于術(shù)后60 min尾靜脈注射無菌白藜蘆醇(40 mg/kg，美國sigama公司產(chǎn)品)，假手術(shù)組和膿毒癥模型組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。24 h后進行相關(guān)指標檢測。

(二)外周血總膽紅素(TBil)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)的ELISA法檢測

大鼠外周血TBil、AST、ALT、TNF-α、IL-6表達使用ELISA法檢測。ELISA檢測試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司(批號：20180514、20180418、20180522、20180407、20180523)，造模前和造模24 h后抽取大鼠尾靜脈血液0.4 mL，交由檢驗科嚴格按照試劑盒說明書操作，加入相關(guān)試劑，上海巴玖實業(yè)有限公司SAF-680T酶標儀檢測各樣品的吸光度值變化，對照標準品，計算各樣品TBil、AST、ALT、TNF-α和IL-6的表達水平。

(三)肝組織細胞細胞核P65的Western blot檢測 造模24 h后，所有大鼠均斷頸處死，取50 mg肝組織，液氮下研磨后，PBS洗滌2次，細胞核蛋白提取CelLyticTMNuCLEARTM試劑盒購自美國sigma公司(批號：20180422)，嚴格按照試劑盒說明書操作，提取細胞核蛋白，加入蛋白裂解液，取10 μg核蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入兔抗鼠P65抗體(購自上?？党缮锕こ逃邢薰荆枺?01800317)孵育12 h，加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗(購自美國sigma公司，批號：201800226)，化學發(fā)光后使用Quantity One V4.3.0軟件，掃描條帶，以組蛋白為內(nèi)參計算各樣品的相對表達量。

三 、統(tǒng)計分析

選用SPSS 18. 0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用t檢驗，多組均數(shù)比較使用方差分析，組間相互比較使用LSD-t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、三組造模后存活率比較

假手術(shù)組無大鼠死亡，存活率為100.0%，膿毒癥模型組死亡6只，存活9只，存活率為60.0%，白藜蘆醇干預組死亡4只，存活11只，存活率為73.3%，三組間存活率具有顯著性差異(P<0.05)。

二、三組大鼠肝功能指標的比較

造模前三組TBil、AST和ALT表達水平無顯著性差異(P>0.05)，造模24 h后假手術(shù)組TBil、AST和ALT無顯著性變化(P>0.05)，膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預組TBil、AST和ALT均顯著升高(P<0.01)，但白藜蘆醇干預組TBil、AST和ALT均顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)。見表1。

三、三組大鼠TNF-α、IL-6表達的比較

假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預組造模前外周血TNF-α和IL-6表達無顯著性差異(P>0.05)，造模24 h后假手術(shù)組TNF-α和IL-6表達顯著低于白藜蘆醇干預組(P<0.01)，白藜蘆醇干預組TNF-α和IL-6表達又顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)。見表2。

四、三組造模24 h后肝組織細胞細胞核P65的表達

肝組織細胞核P65相對灰度值在假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預組為0.22±0.05、0.48±0.11、0.34±0.07，各組間具有顯著性差異(P<0.01)。其中假手術(shù)組肝組織細胞細胞核P65表達顯著低于白藜蘆醇干預組，白藜蘆醇干預組又顯著低于膿毒癥模型組。

討 論

膿毒癥激發(fā)的全身炎癥綜合征是伴發(fā)多器官功能障礙的重要原因[6]，研究已發(fā)現(xiàn)膿毒癥急性肝損傷患者體內(nèi)炎癥反應的激活[7]，NF-κB信號通路是機體內(nèi)一條重要的炎性調(diào)節(jié)通路[8]，在膿毒癥時處于激活狀態(tài)，并且可以參與到肝損傷的致病過程中，李徽徽等[9]的實驗研究顯示抑制NF-κB信號通路可以對抗大鼠膿毒癥導致的急性肝損傷。白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，其抗炎作用已被大多數(shù)實驗所證實[10]，研究顯示白藜蘆醇可以顯著降低氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及炎癥反應，對急性肝損傷小鼠發(fā)揮保護作用[11]。本研究也觀察到了白藜蘆醇干預組肝功能指標顯著低于膿毒癥模型組，說明了膿毒癥時給予白藜蘆醇對模型鼠肝組織具有保護作用。

表1 三組TNF-α和IL-6表達的比較

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01；與膿毒癥模型比較,▲▲P<0.01。造模24h后與造模前比較,##P<0.01

表2 三組TNF-α和IL-6表達的比較

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01；與膿毒癥模型比較,▲▲P<0.01。造模24 h后與造模前比較,##P<0.01

NF-κB信號通路中的主要效應蛋白是P65和P50，二者形成二聚體進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)下游炎性因子例如TNF-α和IL-6 等的表達，因此研究中檢測細胞核中P65蛋白的表達就可以反應出NF-κB信號通路的激活情況[12]。本研究的檢測顯示模型組大鼠肝組織細胞核P65表達顯著高于假手術(shù)組，其中白藜蘆醇干預組肝組織細胞細胞核P65表達顯著低于非干預的膿毒癥模型組，說明了白藜蘆醇抑制了NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白P65的核移位，下游的炎癥因子TNF-α和IL-6也相應的在白藜蘆醇干預組顯著低于膿毒癥模型組。綜合上述研究提示了白藜蘆醇對膿毒癥大鼠肝損傷的保護作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來實現(xiàn)的，但是其具體的機制還需要進一步實驗來證實。