杜臣臣　謝俊霞　王俊

[摘要]目的 探討4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）對(duì)未分化和分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞鐵相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

方法將MO3.13細(xì)胞分為對(duì)照組和PMA組。對(duì)照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，PMA組的培養(yǎng)液內(nèi)加入終濃度為100nmol/L的PMA，每3d換1次液。培養(yǎng)7d后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）和鐵調(diào)節(jié)蛋白1（IRP1）的表達(dá)水平。

結(jié)果與對(duì)照組相比，PMA組細(xì)胞TfR1和IRP1的表達(dá)水平均顯著降低（t=3.002、2.654，P<0.05）。

結(jié)論100nmol/L的PMA可引起少突膠質(zhì)細(xì)胞TfR1和IRP1的表達(dá)降低，這種變化可能與IRP1的調(diào)節(jié)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]乙酸鹽類;少突神經(jīng)膠質(zhì);受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白;鐵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)1

[中圖分類號(hào)]R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2020）01-0014-03

帕金森?。≒D）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射異常等[1-2]。有研究結(jié)果表明，鐵沉積和氧化應(yīng)激是PD的兩個(gè)主要的病理特征[3-4]。鐵對(duì)于細(xì)胞發(fā)育和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)生理過程至關(guān)重要，例如氧氣運(yùn)輸、DNA合成、線粒體呼吸、髓磷脂合成和神經(jīng)遞質(zhì)代謝等[5-6]。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成髓鞘的細(xì)胞，它是由少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPCs）分化而形成的[7-8]。鐵蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要儲(chǔ)存蛋白，且在少突膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到最高表達(dá)水平。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的鐵調(diào)節(jié)細(xì)胞[9-11]。4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）是一種廣泛用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的蛋白激酶C（PKC）激活劑，它可以結(jié)合PKC，并激活PKC，隨后導(dǎo)致一系列的細(xì)胞反應(yīng)。有研究結(jié)果表明，未分化的MO3.13細(xì)胞在加入含100nmol/L的PMA的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d后，檢測(cè)到髓磷脂堿性蛋白（MBP）的免疫反應(yīng)性大幅度上調(diào)[12]。然而，PMA是否影響少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鐵相關(guān)蛋白的表達(dá)，目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PMA對(duì)MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鐵相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從而為PD的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞購自于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶均購自美國Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，PMA、兔抗屬單克隆一抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）和鐵調(diào)節(jié)蛋白1（IRP1）均購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自Absin公司，青霉素-鏈霉素溶液（100×）購自江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品。所使用的儀器包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)和Western顯影儀等。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將放置在液氮中的未分化MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞凍存管快速轉(zhuǎn)移至37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行融化。在超凈工作臺(tái)中將融化的未分化MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞凍存管中吸出，轉(zhuǎn)至離心管中，再補(bǔ)入10mL的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，用于稀釋凍存液中的有害成分。將離心管放于離心機(jī)中，以1000r/min離心5min，沉淀細(xì)胞。棄上清，重新加入細(xì)胞培養(yǎng)液，用滴管吹打細(xì)胞后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長至90%融合時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板中，用MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，將原有的細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，加入含100nmol/LPMA的無血清培養(yǎng)液，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d換1次液，培養(yǎng)7d后，采用免疫熒光攝片的方法檢測(cè)到成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物MBP的表達(dá)率大于90%，證明未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為對(duì)照組（未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞）和PMA組（分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞）。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鐵相關(guān)蛋白表達(dá)

提取兩組細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算每個(gè)樣本的上樣量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用100g/L的脫脂奶粉室溫封閉2h，再分別加入β-actin（1∶10000）、TfR1（1∶1000）和IRP1（1∶1000）抗體，4℃下在搖床上孵育過夜。以TBST洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下在搖床上孵育1h。再以TBST洗膜3次后，用ECL發(fā)光劑顯影。應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以TfR1/β-actin和IRP1/β-actin的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPadPrism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

結(jié)果表明，PMA組細(xì)胞TfR1和IRP1蛋白的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.002、2.654，P<0.05）。見表1。

3討論

鐵是生物體正常代謝所必需的微量元素，對(duì)大腦的發(fā)育至關(guān)重要[2，13]。不同的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞由不同的鐵相關(guān)蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)鐵的攝取。在人類中，無論是未分化的還是分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞，鐵的轉(zhuǎn)入都是通過TfR1介導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）或鐵蛋白的攝取[14-15]。TfR1也被稱為CD71，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在細(xì)胞表面上廣泛表達(dá)，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵攝取的主要受體[16]。有研究表明，TfR1是細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，是參與鐵吸收和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)的必需蛋白質(zhì)[17-18]。IRPs是鐵代謝相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的最重要的因素[19]。在鐵缺乏期間，IRP1通過與鐵反應(yīng)元件（IRE）的一小部分mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合來提高鐵水平，從而調(diào)節(jié)其翻譯并維持體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)[20]。IRP1與IRE結(jié)合可以抑制mRNA的翻譯或增加mRNA的穩(wěn)定性。當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，IRE結(jié)構(gòu)存在于TfR1mRNA的3′非翻譯區(qū)。當(dāng)IRP1與IRE結(jié)合時(shí)，TfR1mRNA的穩(wěn)定性將得到提高，進(jìn)而增加TfR1的表達(dá)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMA可同時(shí)降低分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞IRP1與TfR1的蛋白表達(dá)。推測(cè)PMA首先通過降低細(xì)胞IRP1的表達(dá)，進(jìn)而使IRP1與TfR1mRNA的3′非翻譯區(qū)的IRE結(jié)合率降低，從而降低細(xì)胞TfR1的表達(dá)，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和成熟需要一系列相互作用來調(diào)控OPCs的增殖和分化以及髓鞘的形成，而鐵在這一過程中起到了決定性的作用[22]。少突膠質(zhì)細(xì)胞需要鐵參與髓鞘生成和作為酶的輔酶因子[23]。有研究表明，鐵缺乏會(huì)對(duì)細(xì)胞周期起抑制作用，但當(dāng)鐵濃度超過一定的閾值后，增殖就會(huì)停止，分化就開始了。當(dāng)增殖的OPCs暴露于高水平的鐵時(shí)，細(xì)胞停止分裂并進(jìn)行分化[24]。TfR1是少突膠質(zhì)細(xì)胞中唯一調(diào)控鐵轉(zhuǎn)入的蛋白，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用PMA對(duì)未分化的MO3.13細(xì)胞進(jìn)行分化后，TfR1和IRP1的表達(dá)顯著降低。分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞的TfR1表達(dá)降低，表明分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)入能力降低。故本文結(jié)果表明，未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)鐵的吸收能力大于分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞，分化后的少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)鐵的需求減少，不會(huì)再攝取更多的鐵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為PD的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]LIANTenghong，GUOPeng，ZUOLijun，etal.Tremor-dominantinParkinsondisease：therelevancetoironmetabolismandinflammation[J].FrontiersinNeuroscience，2019，13：255.

[2]PESCHB，CASJENSS，WOITALLAD，etal.ImpairmentofmotorfunctioncorrelateswithneurometaboliteandbrainironalterationsinParkinsonsdisease[J].Cells（Basel，Switzerland），2019，8（2）：96-102.

[3]JIANGHong，SONGNing，WANGJun，etal.Peripheralirondextraninduceddegenerationofdopaminergicneuronsinratsubstantianigra[J].NeurochemistryInternational，2007，51（1）：32-36.

[4]ZECCAL，CASELLAL，ALBERTINIA，etal.NeuromelanincanprotectagainstironmediatedoxidativedamageinsystemmodelingironoverloadofbrainagingandParkinsonsdi-sease[J].JournalofNeurochemistry，2008，106（4）：1866-1875.

[5]LIUC，LIANGMC，SOONGTW，etal.Nitricoxide，ironandneurodegeneration[J].FrontiersinNeuroscience，2019，13：114.

[6]BENARROCHEE.Brainironhomeostasisandneurodegenerativedisease[J].Neurology，2009，72（16）：1436-1440.

[7]BERGLESDE，RICHARDSONWD.Oligodendrocytedevelopmentandplasticity[J].ColdSpringHarborPerspectivesinBiology，2015，8（2）：a020453.

[8]SNAIDERON，MBIUSW，CZOPKAT，etal.MyelinmembranewrappingofCNSaxonsbyPI（3，4，5）P3-dependentpolarizedgrowthattheinnertongue[J].Cell，2014，156（1/2）：277-290.

[9]CONNORJR，MENZIESSL，STMARTINSM，etal.Cellulardistributionoftransferrin，ferritin，andironinnormalandagedhumanbrains[J].JournalofNeuroscienceResearch，1990，27（4）：595-611.

[10]TODORICHB，ZHANGXS，SLAGLE-WEBBB，etal.Tim-2isthereceptorforH-ferritinonoligodendrocytes[J].JournalofNeurochemistry，2008，107（6）：1495-1505.

[11]CONNORJR.Ironacquisitionandexpressionofironregulatoryproteinsinthedevelopingbrain：manipulationbyethanolexposure，irondeprivationandcellulardysfunction[J].DevelopmentalNeuroscience，1994，16（5/6）：233-247.

[12]BOSCIAF，DAVANZOC，PANNACCIONEA，etal.SilencingorknockingouttheNa（+）/Ca（2+）exchanger-3（NCX3）impairsoligodendrocytedifferentiation[J].CellDeathandDifferentiation，2012，19（4）：562-572.

[13]NDAYISABAA，KAINDLSTORFERC，WENNINGGK，etal.Ironinneurodegeneration—causeorconsequence[J]？FrontNeurosci，2019，13：180.

[14]MILLSE，DONGXP，WANGFD，etal.Mechanismsofbrainirontransport：insightintoneurodegenerationandCNSdisorders[J].FutureMedicinalChemistry，2010，2（1）：51-64.

[15]CONNELLGJ，DANIALJS，HAASTRUTHERSCX.Evaluationoftheironregulatoryprotein-1interactome[J].Biometals，2018，31（1）：139-146.

[16]GREENECJ，ATTWOODK，SHARMANJ，etal.Transferrinreceptor1upregulationinprimarytumoranddownregulationinbenignkidneyisassociatedwithprogressionandmortalityinrenalcellcarcinomapatients[J].Oncotarget，2017，8（63）：107052-107075.

[17]RICHARDSONDR，KALINOWSKIDS，LAUS，etal.Cancercellironmetabolismandthedevelopmentofpotentironchelatorsasanti-tumouragents[J].BiochimicaetBiophysicaActa，2009，1790（7）：702-717.

[18]DANIELSTR，BERNABEUE，RODRIGUEZJA，etal.Thetransferrinreceptorandthetargeteddeliveryoftherapeuticagentsagainstcancer[J].BiochimicaetBiophysicaActa-GeneralSubjects，2012，1820（3，SI）：291-317.

[19]LIHuihui，LIUYutong，SHANGLongcheng，etal.Ironregulatoryprotein2modulatestheswitchfromaerobicglycolysistooxidativephosphorylationinmouseembryonicfibroblasts[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2019，116（20）：9871-9876.

[20]WANGJ，PANTOPOULOSK.Regulationofcellularironmetabolism[J].BiochemicalJournal，2011，434（3）：365-381.

[21]ZHOUZD，TANEK.Ironregulatoryprotein（IRP）-ironresponsiveelement（IRE）signalingpathwayinhumanneurodegenerativediseases[J].MolecularNeurodegeneration，2017，12（1）：75-87.

[22]PANDURE，PAPR，VARGAE，etal.Relationshipofironmetabolismandshort-termcuprizonetreatmentofC57BL/6mice[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2019，20（9）：2257-2274.

[23]PINERODJ，CONNORJR.Ironinthebrain：animportantcontributorinnormalanddiseasedstates[J].Neuroscientist，2000，6（6）：435-453.

[24]KULPKS，GREENSL，VULLIETPR.Irondeprivationinhibitscyclin-dependentkinaseactivityanddecreasescyclinD/CDK4proteinlevelsinasynchronousMDA-MB-453humanbreastcancercells[J].ExperimentalCellResearch，1996，229（1）：60-68.

（本文編輯 馬偉平）