李勝軍　林巖　宗金寶　劉世國　宋衛(wèi)青

[摘要]目的探討HSPA1Lrs2227956位點單核苷酸多態(tài)性與子癇前期遺傳易感性的關(guān)系。

方法采用TaqMan探針實時熒光PCR技術(shù)，對山東地區(qū)漢族女性中800例子癇前期（PE）病人和1000例正常妊娠孕婦的外周血DNA進(jìn)行擴(kuò)增，比較兩組HSPA1Lrs2227956位點基因型分布和等位基因頻率。

結(jié)果PE組和正常孕婦組HSPA1Lrs2227956位點的基因型分布和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與正常孕婦組比較，輕度PE組、重度PE組以及早發(fā)型PE、晚發(fā)型PE組HSPA1Lrs2227956位點的基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性（P>0.05）。

結(jié)論HSPA1Lrs2227956位點多態(tài)性與PE的遺傳易感性沒有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]先兆子癇;HSPA1L基因;多態(tài)性，單核苷酸;疾病遺傳易感性

[中圖分類號]R714.24;R363.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2020）01-0026-04

子癇前期（PE）是一種妊娠期特發(fā)性疾病，可以伴有多種臟器的功能損害[1]，其發(fā)病率在初產(chǎn)婦為3.0%～7.0%，經(jīng)產(chǎn)婦為0.8%～5.0%，嚴(yán)重威脅著母兒的生命健康[2]。PE的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但研究表明其發(fā)病與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫失衡、遺傳因素等有關(guān)[3-8]。系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)會誘導(dǎo)熱休克蛋白70（HSP70）表達(dá)升高[9]。并且，PE病人血清、血漿以及胎盤組織中都有高水平的HSP70表達(dá)[10]。已有研究證實，多種基因的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與PE發(fā)病及遺傳易感性具有密切關(guān)系[11-12]。本研究選取HSP基因中一個標(biāo)簽位點rs2227956，探討其多態(tài)性與PE遺傳易感性的相關(guān)性，旨在為PE的臨床診斷及治療提供遺傳學(xué)依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取800例已經(jīng)確診的PE病人作為病例組，1000例足月分娩的正常孕婦作為對照組，兩組年齡匹配，且均來源于2016年10月—2018年10月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院、煙臺毓璜頂醫(yī)院、濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、聊城市人民醫(yī)院、臨沂市人民醫(yī)院、棗莊市婦幼保健院、菏澤市立醫(yī)院等山東各地醫(yī)院產(chǎn)科住院的中國漢族妊娠婦女。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國“國家高血壓教育計劃”[13]，分度及分型參考相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。其中輕度PE病人181例，重度PE病人619例;早發(fā)型PE病人426例，晚發(fā)型PE病人374例。對照組為沒有PE病史、足月分娩、產(chǎn)后隨訪亦未發(fā)生PE的正常孕婦。兩組孕婦均排除前置胎盤、胎膜早破、先兆流產(chǎn)、輔助生殖、巨大兒及雙胎妊娠，均無慢性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病、甲狀腺疾病以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等全身性疾病病史。

兩組孕婦臨床資料均完整，包括年齡、月經(jīng)初潮年齡、妊娠次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、收縮壓、舒張壓、入院孕周、分娩孕周、臨床癥狀以及實驗室檢查指標(biāo)等，且所有研究對象均簽署知情同意書。本研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2研究方法

采集研究對象外周肘靜脈血2mL于EDTA抗凝管中，用試劑盒提取基因組DNA，然后采用TaqMan探針實時熒光PCR技術(shù)對HSPA1L基因rs2227956位點多態(tài)性進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系包括：20×SNP探針1.25μL，2×PCRMasterMix12.5μL，模板DNA和去除DNA酶水11.25μL，總反應(yīng)體系共25μL。實驗所用探針、引物及MasterMix均購買于美國ABI公司。其中rs2227956位點上游引物序列為5′-AATGGTATTCTCAATGTC-ACAGCCA-3′，下游引物序列為5′-GGACAAGA-

GCACCGGCAAGGTGAAC-3′。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3min;95℃、15s，60℃、1min，共45個循環(huán)，在C1000TM熱循環(huán)儀和CFX96TM實時系統(tǒng)（BioGRad，California，USA）中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。最后通過BioRadCFXmanager3.0軟件讀取基因型。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg（HWE）遺傳平衡分析，計量資料比較采用Studentst檢驗，兩組間基因型頻率及等位基因頻率的比較采用Pearsonsχ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組一般基礎(chǔ)資料比較

病例組和對照組入院孕周、分娩孕周、新生兒體質(zhì)量和血壓比較差異有顯著意義（t=-38.603～78.883，P<0.01），而年齡、月經(jīng)初潮年齡、孕次和流產(chǎn)次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2兩組基因型分布和等位基因頻率比較

對照組HSPA1Lrs2227956位點的基因型分布和等位基因頻率均符合HWE遺傳平衡定律（χ2=2.671，P=0.102），說明該研究所選取樣本具有群體代表性。病例組與對照組相比，基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.901，P=0.637），等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.286，P=0.593，OR=0.956，95%CI=0.813～1.126）。見表2。

2.3輕度、重度PE組與對照組基因型分布和等位基因頻率的比較

輕度PE病人與對照組、重度PE病人與對照組基因型分布與等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（輕度PE與對照組基因型分布比較，χ2=0.085，P=0.958;等位基因頻率比較，χ2=0.090，P=0.764，OR=1.043，95%CI=0.794～1.370。重度PE與對照組基因型分布比較，χ2=1.495，P=0.474;等位基因頻率比較，χ2=0.613，P=0.434，OR=0.932，95%CI=0.781～1.112）。見表2。

2.4早發(fā)型、晚發(fā)型PE組與對照組基因型分布和等位基因頻率的比較

早發(fā)型PE組與對照組、晚發(fā)型PE組與對照組基因型分布與等位基因頻率比較差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義（早發(fā)型PE與對照組基因型分布比較，χ2=0.956，P=0.620;等位基因頻率比較，χ2=0.810，P=0.368，OR=0.912，95%CI=0.746～1.115。晚發(fā)型PE與對照組基因型分布比較，χ2=0.701，P=0.704;等位基因頻率比較，χ2=0.006，P=0.936，OR=1.008，95%CI=0.820～1.240）。見表2。

3討論

PE是一種以高血壓和蛋白尿為特征的妊娠期特發(fā)性疾病，可累及肝、腎、胎盤、神經(jīng)系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等多種臟器和系統(tǒng)，嚴(yán)重危及母嬰的生命安全[1]。該病發(fā)病機(jī)制不明。越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在PE發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6-8]。妊娠會使孕婦處于一種普遍的適度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，而PE病人處于一種過度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)[16]。并且，PE病人血清中的IL-1β、IL-2、IL-6和IFN-γ等炎癥因子水平比正常孕婦明顯升高[17-19]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致活性氧增多[20-21]，通過一系列病理生理變化參與PE的發(fā)生發(fā)展[22]。

熱休克蛋白（HSP）是熱休克反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄合成的一組蛋白，可以增強(qiáng)細(xì)胞對應(yīng)激的耐受性，穩(wěn)定細(xì)胞蛋白內(nèi)環(huán)境[23]。迄今為止，HSP有3大家族被廣泛研究：低分子量HSP家族、HSP70家族、HSP90家族[24]。其中HSP70是含量最豐富的一類，其保守性和可誘導(dǎo)性最強(qiáng)。HSP70是重要的分子伴侶，對于維持細(xì)胞的正常機(jī)制是必不可少的，其具有參與蛋白質(zhì)折疊、介導(dǎo)細(xì)胞自我保護(hù)、抗細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等作用[25-26]。已有研究結(jié)果證實，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)會誘導(dǎo)HSP70表達(dá)升高[9，27]，并且，PE病人的血清、血漿以及胎盤組織中HSP70表達(dá)也升高[10]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)HSP70與高血壓及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[28]。

人體中編碼HSP70家族成員的基因共有3個：HSPA1A、HSPA1B以及HSPA1L，它們均位于6p21.3[29]。其中HSPA1A和HSPA1B編碼同一種蛋白熱休克誘導(dǎo)性蛋白產(chǎn)物，而HSPA1L編碼非熱休克誘導(dǎo)性蛋白產(chǎn)物，兩種蛋白產(chǎn)物有90%的氨基酸序列相同[30]。研究發(fā)現(xiàn)多種基因與PE發(fā)病相關(guān)，具有遺傳易感性，包括Survivin基因、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因、VLeiden因子基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因等，這些不同基因的SNP位點多態(tài)性影響著PE的發(fā)病及遺傳易感性[11]。由于HSPA1L編碼的蛋白產(chǎn)物HSP70與炎癥反應(yīng)、缺血低氧、氧化應(yīng)激等參與PE發(fā)生發(fā)展的重要因素密切相關(guān)，HSP70在PE病人的血清、血漿以及胎盤組織中表達(dá)也升高，提示HSP70在PE的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用;HSP70與高血壓及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān);PE的發(fā)病還與多種基因相關(guān)，具有遺傳易感性，推測編碼HSP70蛋白的基因HSPA1L可能與PE發(fā)病有關(guān)。本文選取了HSPA1L基因中一個標(biāo)簽性SNP位點rs2227956進(jìn)行研究，探討HSPA1L基因rs2227956位點的多態(tài)性與PE的遺傳易感性是否具有相關(guān)性，旨在為PE的臨床預(yù)測以及治療提供遺傳學(xué)依據(jù)。

本文研究結(jié)果顯示，PE組病人和正常對照組HSPA1Lrs2227956位點的基因型分布和等位基因頻率差異無顯著性。為進(jìn)一步探討該位點與PE遺傳易感性關(guān)系，將PE組孕婦分為輕度、重度PE以及早發(fā)型、晚發(fā)型PE，并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，輕度、重度PE病人與對照組比較以及早發(fā)型、晚發(fā)型PE病人與對照組比較，HSPA1Lrs2227956位點的基因型分布和等位基因頻率差異均無顯著性。表明HSPA1Lrs2227956位點的多態(tài)性在PE的發(fā)生發(fā)展中可能并不起關(guān)鍵性作用，尚不能認(rèn)為該位點的多態(tài)性與PE的遺傳易感性相關(guān)。

本文研究結(jié)果可能會受多種因素的影響。首先，研究對象均來自于山東省漢族人群，因此本文研究結(jié)果不適用于其他地區(qū)、其他人群或人種;其次，由于PE是一種復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，可能會受多種基因、多個位點的共同作用或相互作用的影響;另外，環(huán)境因素也可能會影響研究結(jié)果。因此，還需要更多地區(qū)、更多種族人群、更多基因位點、納入環(huán)境因素影響甚至功能性的研究，來進(jìn)一步驗證本研究的結(jié)果，加深對PE發(fā)病的認(rèn)識，以便更好地指導(dǎo)其臨床診斷和治療。

[參考文獻(xiàn)]

[1]MOLBW，ROBERTSCT，THANGARATINAMS，etal.Pre-eclampsia[J].TheLancet，2016，387（10022）：999-1011.

[2]孫成娟，張為遠(yuǎn).子癇前期易感基因的研究進(jìn)展[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2008，43（12）：951-954.

[3]RANAS，KARUMANCHISA，LINDHEIMERMD.Angiogenicfactorsindiagnosis，management，andresearchinpreeclampsia[J].Hypertension，2014，63（2）：198-202.

[4]JEBBINKJ，WOLTERSA，F(xiàn)ERNANDOF，etal.MoleculargeneticsofpreeclampsiaandHELLPsyndrome-areview[J].BiochimicaetBiophysicaActa，2012，1822（12）：1960-1969.

[5]KAMALI-SARVESTANIE，KIANYS，GHARESI-FARDB，etal.AssociationstudyofIL-10andIFN-gammagenepo-

lymorphismsinIranianwomenwithpreeclampsia[J].JournalofReproductiveImmunology，2006，72（1/2）：118-126.

[6]PATILSB，KODLIWADMATHMV，KODLIWADMATHSM.Lipidperoxidationandantioxidantactivityincomplicatedpregnancies[J].ClinicalandExperimentalObstetrics&Gynecology，2009，36（2）：110-112.

[7]SIDDIQUIIA，JALEELA，TAMIMIW，etal.Roleofoxidativestressinthepathogenesisofpreeclampsia[J].ArchivesofGynecologyandObstetrics，2010，282（5）：469-474.

[8]REDMANCW，SACKSGP，SARGENTIL.Preeclampsia：anexcessivematernalinflammatoryresponsetopregnancy[J].AmericanJournalofObstetricsandGynecology，1999，180（2Pt1）：499-506.

[9]SAGHAFIN，POURALIL，GHAVAMIGHANBARABADIV，etal.Serumheatshockprotein70inpreeclampsiaandnormalpregnancy：asystematicreviewandmeta-analysis[J].InternationalJournalofReproductiveBiomedicine，2018，16（1）：1-8.

[10]MOLVARECA，PROHASZKAZ，NAGYB，etal.Associationofelevatedserumheat-shockprotein70concentrationwithtransienthypertensionofpregnancy，preeclampsiaandsuperimposedpreeclampsia：acase-controlstudy[J].JournalofHumanHypertension，2006，20（10）：780-786.

[11]趙靜，李筱梅，王鳳羽.Klotho基因-395A/G多態(tài)性與子癇前期的相關(guān)性研究[J].中國婦幼保健，2014，29（6）：931-933.

[12]HARAMK，MORTENSENJH，NAGYB.GeneticaspectsofpreeclampsiaandtheHELLPsyndrome[J].JournalofPregnancy，2014（2014）：910751.

[13]GIFFORDRW，AUGUSTPA，CUNNINGHAMG，etal.ReportoftheNationalhighbloodpressureeducationprogramworkinggrouponhighbloodpressureinpregnancy[J].AmericanJournalofObstetricsandGynecology，2000，183（1）：S1-S22.

[14]李笑天.子癇前期的定義、分類及其循證依據(jù)[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2018，34（5）：471-474.

[15]ALVAREZFERNANDEZI，PRIETOB，RODRIGUEZVA，etal.Newbiomarkersindiagnosisofearlyonsetpreeclampsiaandimminentdeliveryprognosis[J].ClinicalChemistryandLaboratoryMedicine，2014，52（8）：1159-1168.

[16]REDMANCW，SARGENTIL.Pre-eclampsia，theplacentaandthematernalsystemicinflammatoryresponse-areview[J].Placenta，2003，24（SupplA）：S21-S27.

[17]TOSUNM，CELIKH，AVCIB，etal.Maternalandumbilicalserumlevelsofinterleukin-6，interleukin-8，andtumornecrosisfactor-alphainnormalpregnanciesandinpregnanciescomplicatedbypreeclampsia[J].TheJournalofMaternal-fetal&NeonatalMedicine，2010，23（8）：880-886.

[18]SZARKAA，JANOSRIGOJ，LEVENTEL，etal.Circulatingcytokines，chemokinesandadhesionmoleculesinnormalpregnancyandpreeclampsiadeterminedbymultiplexsuspensionarray[J].BMCImmunology，2010，11：59.

[19]KALINDERISM，PAPANIKOLAOUA，KALINDERIK，etal.Elevatedserumlevelsofinterleukin-6，interleukin-1betaandhumanchorionicgonadotropininpre-eclampsia[J].AmericanJournalofReproductiveImmunology，2011，66（6）：468-475.

[20]KALYANARAMANB.Teachingthebasicsofredoxbiologytomedicalandgraduatestudents：oxidants，antioxidantsanddiseasemechanisms[J].RedoxBiology，2013，1：244-257.

[21]MATSUBARAK，MATSUBARAY，HYODOS，etal.Roleofnitricoxideandreactiveoxygenspeciesinthepathogenesisofpreeclampsia[J].JournalofObstetricsandGynaecologyResearch，2010，36（2）：239-247.

[22]CINDROVA-DAVIEST.Gaborthanawardlecture2008：pre-eclampsia-fromplacentaloxidativestresstomaternalendothelialdysfunction[J].Placenta，2009，30（SupplA）：S55-S65.

[23]KHANDIAR，MUNJALAK，IQBALHM，etal.Heatshockproteins：therapeuticperspectivesininflammatorydisorders[J].RecentPatentsonInflammation&AllergyDrugDiscovery，2017，10（2）：94-104.

[24]EKAMBARAMP.HSP70expressionanditsroleinpreeclampticstress[J].IndianJournalofBiochemistry&Biophysics，2011，48（4）：243-255.

[25]POCKLEYAG.Heatshockproteinsasregulatorsoftheimmuneresponse[J].Lancet，2003，362（9382）：469-476.

[26]ZHENGJP，LYUY，LIRF，etal.Interactionofheatshockprotein70（HSP70）polymorphismsandoccupationalhazardsincreasestheriskofhypertensionincokeovenworkers[J].OccupationalandEnvironmentalMedicine，2018，75（11）：807-813.

[27]林培紅.HSP70、NF-κB與子癇前期發(fā)病的關(guān)系[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（31）：13-15，20.

[28]RODRIGUEZITURBEB，PONSH，QUIROZYA，etal.Autoimmunityinthepathogenesisofhypertension[J].NatureReviewsNephrology，2014，10（1）：56-62.

[29]FEKETEA，VRA，BGIK，etal.IspreeclampsiaassociatedwithhigherfrequencyofHSP70genepolymorphisms[J]？EuropeanJournalofObstetrics&GynecologyandReproductiveBiology，2006，126（2）：197-200.

[30]SAIKIAS，BAROOAHP，BHATTACHARYYAM，etal.Polymorphismsinheatshockproteinsa1Banda1L（HOM）asriskfactorsforoesophagealcarcinomainNortheastIndia[J].AsianPacificJournalofCancerPrevention：APJCP，2015，16（18）：8227-8233.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）