李菁蒴　湯蘇珍　劉雅寧　陳鵬

[摘要]目的分析一個(gè)中國(guó)北方視網(wǎng)膜色素變性（RP）家系病人的臨床表型及致病基因突變，尋找致病基因突變位點(diǎn)，探討表型與基因型之間的關(guān)系。

方法收集中國(guó)北方地區(qū)的一個(gè)RP家系的臨床資料，共有11例家庭成員參與研究，其中包括5例病人和6例正常成員。完善該家系內(nèi)所有參與研究成員的眼科檢查，提取該家系中全部成員的外周血基因組DNA，選取先證者進(jìn)行視覺(jué)系統(tǒng)相關(guān)目標(biāo)區(qū)域全外顯子組測(cè)序，最終通過(guò)家系內(nèi)共分離驗(yàn)證致病突變，進(jìn)一步分析該突變與病人表型間的關(guān)系。

結(jié)果臨床檢查顯示該家系內(nèi)5例病人均符合典型的RP表型，目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序顯示核受體亞科2第E組第3個(gè)成員（[STBX]NR2E3）基因c.166G>A突變，該突變導(dǎo)致了[STBX]NR2E3基因所編碼蛋白第56號(hào)氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼幔╬.56，G>R）;保守性分析顯示該突變?cè)诟魑锓N中高度保守，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明該突變具有較高的致病性。

結(jié)論該家系內(nèi)符合典型RP表型病人目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了[STBX]NR2E3基因上一個(gè)已知的突變（c.166G>A，p.56，G>R），該突變?cè)诩蚁祪?nèi)共分離。

[關(guān)鍵詞]視網(wǎng)膜變性;色素細(xì)胞;點(diǎn)突變;高通量核苷酸序列分析;[STBX]NR2E3基因

[中圖分類號(hào)]R774.13;R394

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2020）01-0030-05

視網(wǎng)膜色素變性（RP）是以早期夜盲，隨后出現(xiàn)漸進(jìn)性視野缺損、視網(wǎng)膜色素沉著、視盤(pán)蠟黃色、視網(wǎng)膜電圖呈熄滅型以及中心視力下降等為主要臨床特征的常見(jiàn)致盲性遺傳眼病[1]。在世界范圍內(nèi)RP的發(fā)病率為1/3800～1/3500，在我國(guó)其發(fā)病率約為1/3784，全世界至少有100萬(wàn)病人[2]。此組疾病是導(dǎo)致人類視力障礙最主要的疾病之一。近年來(lái)，由于其致盲率有所上升，以及人類基因圖譜的成功建立，RP日益受到眼科學(xué)者的關(guān)注。已知的RP致病基因或位點(diǎn)多達(dá)100個(gè)，目前已經(jīng)克隆50多個(gè)基因并闡述了其功能。至2015年，已被定位克隆的常染色體顯性遺傳RP的致病基因有25個(gè)[3]。至今已知基因?qū)е鲁Ｈ旧w顯性RP（ADRP）約占60%，仍有40%的ADRP病人尚未確定致病基因[4-6]。因此，對(duì)ADRP致病基因的定位和克隆仍需進(jìn)行深入的研究[7]。

本文研究對(duì)1個(gè)中國(guó)北方ADRP家系進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域外顯子測(cè)序，以期找到該病的致病基因和突變位點(diǎn)，并探討該病的臨床表型與基因型的關(guān)系，旨在為ADRP的病人治療帶來(lái)福音?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集山東省臨沂市1個(gè)ADRP家系，該家系共有3代11人，其中RP病人5例，均經(jīng)詳細(xì)全面的眼科檢查如視力、視野、眼底等明確診斷為ADRP。參與本研究的共有11例家系成員，包括5例病人，6例表型正常者。本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言，

血液標(biāo)本的采集和病人的臨床檢查均征得家系成員同意后進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1提取外周血基因組DNA采集所有家系成員的外周靜脈血2～5mL，注入EDTA抗凝管內(nèi)，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?采用全血DNA小量抽提試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）進(jìn)行外周血DNA提取。

1.2.2目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序取該家系中先證者的基因組DNA，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)捕獲人類視覺(jué)系統(tǒng)異常相關(guān)單基因遺傳病的523個(gè)基因的外顯子區(qū)域，然后對(duì)富集的外顯子文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。將突變的基因通過(guò)4個(gè)正常人的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行過(guò)濾：包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/）、千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp：//ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/）、Hapmap8數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）及炎黃數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//yh.genomics.org.cn/）。

1.2.3PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序?qū)⒔?jīng)過(guò)分析篩選得到的獲選變異位點(diǎn)分別利用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。PCR反應(yīng)條件：94℃、3min;94℃、40s，53℃、40s，72℃、60s，35個(gè)循環(huán);72℃10min。然后，應(yīng)用Sanger測(cè)序法分別對(duì)每例家系成員的基因組DNA模板與核受體亞科2第E組第3個(gè)成員（NR2E3）引物的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物測(cè)序。

2結(jié)果

2.1臨床特征

該家系為ADRP，共有11例家系成員（圖1），其中包括5例RP病人（Ⅰ1，Ⅱ1，Ⅱ5，Ⅲ1，Ⅲ3）和6例健康成員（Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅱ3，Ⅱ4，Ⅱ6，Ⅲ2）。眼科檢查顯示，5例病人的臨床表型均符合典型的RP的臨床特征。該家系內(nèi)5例病人的臨床表現(xiàn)較為相似，均自幼夜盲，并在10歲左右出現(xiàn)明顯的視野縮窄及視力下降。先證者Ⅱ1目前雙眼最佳矯正視力均為0.1;其雙眼眼底表現(xiàn)符合典型的RP改變，包括視乳頭色蒼白、視網(wǎng)膜血管迂曲變細(xì)、視網(wǎng)膜萎縮及后極部大量骨細(xì)胞樣色素沉著等。見(jiàn)表1。

2.2目標(biāo)區(qū)域外顯子組基因測(cè)序

針對(duì)家系內(nèi)先證者（Ⅱ1）進(jìn)行的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序所達(dá)到的覆蓋率為99.91%，平均測(cè)序深度為61.4X。目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序共捕獲到837個(gè)單核苷酸變異（SNVs）和82個(gè)插入/缺失變異（Indels）。經(jīng)過(guò)4個(gè)SNP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比過(guò)濾，鑒于常染色體顯性遺傳的RP較少見(jiàn)，只保留千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基因頻率小于0.05的突變，共篩選出8個(gè)可能與該家系發(fā)病相關(guān)的變異，這8個(gè)突變分別位于6個(gè)基因：NR2E3、BBS4、BBS9、PMM2、PDE6A、CIB2。見(jiàn)表2。

2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，該家系中5例病人均存在NR2E3基因的第2外顯子的突變，核苷酸改變?yōu)閏.166G>A，氨基酸改變?yōu)閜.56，G>R（圖2）;而家系中的6例正常人均不存在該突變。多次測(cè)序結(jié)果表明，該突變位點(diǎn)并不是因?yàn)閿U(kuò)增或測(cè)序錯(cuò)誤引進(jìn)的。應(yīng)用點(diǎn)突變預(yù)測(cè)程序SIFT和PolyPhen的預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示，該突變導(dǎo)致了NR2E3蛋白功能“deleterious”級(jí)的損壞，從而引起了病人RP的發(fā)生。該突變?yōu)橐阎蛔?，不是新突變?/p>

3討論

RP的遺傳方式較為復(fù)雜，目前已知有ADRP、常染色體隱性遺傳RP（ARRP）、X-連鎖遺傳RP（XLRP）[8]、雙基因型遺傳RP（digenicRP）和線粒體遺傳RP（mitochondrialRP）等5種。ADRP占RP的20%～25%，目前共克隆出了25個(gè)致病基因，由于ADRP危害較為嚴(yán)重，發(fā)病率較高，近年來(lái)已經(jīng)成為眼科遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)[9]。視紫紅質(zhì)（RHO）是最早被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致RP突變的致病基因[10]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種致病突變，90%以上的RHO突變是錯(cuò)義突變，另外一些是缺失或移碼突變[11]。在北美和歐洲人群中，RHO突變是導(dǎo)致ADRP最常見(jiàn)的原因，占20%～25%。在日本，RHO突變率卻較低，僅為2.5%[12]。

NR2E3基因突變占ADRP致病突變的2%～6%，定位15q23～q25，含有8個(gè)外顯子，編碼410種氨基酸的蛋白質(zhì)[13]。該蛋白質(zhì)也是配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，只在成人視網(wǎng)膜外核層表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)換、胚胎發(fā)育和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。NR2E3突變的病人的臨床特征是后發(fā)性ARRP。最近有研究顯示，NR2E3突變與ADRP有明顯的關(guān)系[14]。NR2E3突變的ADRP病人除了具有典型的ADRP臨床表現(xiàn)外，還有眼底高熒光，很少或幾乎沒(méi)有視網(wǎng)膜下色素沉著[15]。

NR2E3由5個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域在所有核激素受體中都是進(jìn)化上保守的。N末端的結(jié)構(gòu)域1和2含有高度可變的A/B結(jié)構(gòu)域，其有助于通過(guò)激活因子（AF-1）結(jié)構(gòu)域的配體與非依賴性DNA結(jié)合;結(jié)構(gòu)域3是核受體最保守的區(qū)域，含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）。DNA結(jié)合區(qū)還含有P-盒以及D-盒，P-盒允許核受體結(jié)合獨(dú)特的DNA應(yīng)答元件位點(diǎn)并調(diào)節(jié)基因表達(dá)，D-盒被認(rèn)為參與蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)構(gòu)域4包含可變鉸鏈區(qū)并且通常是核受體中最獨(dú)特的序列。結(jié)構(gòu)域5位于C末端部分，包括幾個(gè)結(jié)構(gòu)域：LBD、同源和異源二聚化結(jié)構(gòu)域、核定位和配體依賴性激活因子（AF-2）結(jié)構(gòu)域。

配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域由12個(gè)α-螺旋組成，其折疊可以產(chǎn)生配體結(jié)合的疏水口袋[16]。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DBD位于第39～130位密碼子之間，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的突變發(fā)生在第56位密碼子，其位點(diǎn)在NR2E3上的位置處于功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)[17]。

p.G56R突變位于NR2E3蛋白的DBD中，而DBD有助于核受體的同聚和異聚。該位點(diǎn)突變會(huì)影響

NR3E3同源二聚體的形成。在ADRP病人中，p.G56R突變體蛋白在CRX介導(dǎo)的光感受器特異性基因表達(dá)中起抑制作用，這就是其導(dǎo)致RP發(fā)生的原因。本文研究中5例病人的臨床表型均符合典型的RP臨床特征，主要包括視乳頭色蒼白、視網(wǎng)膜血管迂曲變細(xì)、視網(wǎng)膜萎縮及后極部大量骨細(xì)胞樣色素沉著等。目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)是一種新型的基因組分析技術(shù)，該技術(shù)使用一套核苷酸探針捕獲基因組上的目標(biāo)序列，然后使用通用引物對(duì)這些捕獲到的序列進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量生物信息學(xué)分析[18]。本研究通過(guò)目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序及Sanger測(cè)序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析和變異過(guò)濾策略，成功地發(fā)現(xiàn)了RP致病基因NR2E3（c.166G>A，p.56，G>R）的突變位點(diǎn)。該突變導(dǎo)致了NR2E3基因所編碼蛋白第56位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼幔╬.L51>P），該突變?cè)赗P家系內(nèi)共分離。

RP危害嚴(yán)重且目前尚無(wú)有效治愈方法，發(fā)現(xiàn)RP可能的致病基因和有害突變，并進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)防和基因治療顯得尤為重要[19]。目前已知基因?qū)е碌腁DRP約占60%，仍有40%的ADRP病人尚未確定其致病基因。因此，對(duì)ADRP致病基因的定位和克隆仍需進(jìn)行深入研究[20]。該病雖然是單基因遺傳病，但遺傳異質(zhì)性高，有1/3～1/2的病例有遺傳背景[21]。應(yīng)用傳統(tǒng)的診斷方法很難在分子水平做出正確的診斷。新一代測(cè)序技術(shù)能夠準(zhǔn)確地、全面地發(fā)現(xiàn)基因組中的各種DNA異常、遺傳重組突變和其他各種突變等[22]。

自新一代測(cè)序技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，我國(guó)在眼遺傳性疾病致病基因的研究中取得前所未有的成果[23-24]。

全外顯子測(cè)序是指將基因組中外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。全部外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子的交界區(qū)雖然只占全基因的1%，但是大多數(shù)與遺傳表型相關(guān)的功能性變異位于外顯子區(qū)，應(yīng)用該技術(shù)已經(jīng)找到了很多孟德?tīng)栠z傳疾病的致病基因。致病基因的確定不僅有助于早期診斷和早期采取預(yù)防措施，還可以診斷不同的致病基因從而采取不同的治療措施，如針對(duì)先天性黑矇致病基因RPE65的基因治療可明顯改善臨床病人的病情[25-27]。已有研究在RP、先天性青光眼和先天性白內(nèi)障等單基因遺傳性疾病中發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。還有研究應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了RP的致病基因SLC7M4[28]。另外，在近視、原發(fā)性青光眼和年齡相關(guān)性黃斑變性等復(fù)雜性基因遺傳性疾病中亦發(fā)現(xiàn)了新的相關(guān)性致病基因，如與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼相關(guān)的基因ABCAI和PMM2[29]。當(dāng)前遺傳學(xué)及基因組學(xué)研究上的新突破，使得我們能夠從基因?qū)用嬲J(rèn)識(shí)到遺傳性疾病的成因，從而使遺傳性眼科疾病的基因診斷和治療成為可能[30]。

綜上所述，本文對(duì)RP家系進(jìn)行的基因檢測(cè)顯示，NR2E3（c.166G>A，p.56，G>R）基因上的突變位點(diǎn)可能導(dǎo)致了RP的發(fā)病。本研究結(jié)果不僅豐富了RP致病基因NR2E3的圖譜，而且將為常染色體顯性遺傳性RP的基因治療、產(chǎn)前診斷和預(yù)防提供重要的參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]高鳳娟，張圣海，胡方圓，等.視網(wǎng)膜色素變性的致病基因研究進(jìn)展[J].中華眼底病雜志，2018，34（6）：605-610.

[2]李潤(rùn)璞，黃一飛，劉鐵城，等.原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性伴發(fā)癥狀的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，40（5）：487-490.

[3]趙玉霞，李克秋，王建海，等.一個(gè)遺傳性視網(wǎng)膜色素變性家系的基因變異分析[J].國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2019，42（1）：1-5.

[4]王曉光，劉海軍，張少弛，等.視網(wǎng)膜色素變性和視錐-視桿細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良患者的基因型及臨床表型分析[J].中華眼底病雜志，2018，34（6）：526-535.

[5]張軼，黃熙，張軍軍，等.光遺傳學(xué)在視網(wǎng)膜色素變性治療中的研究進(jìn)展[J].中華眼底病雜志，2018，34（6）：601-604.

[6]張芷萌.結(jié)晶樣視網(wǎng)膜色素變性研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2018，36（7）：559-563.

[7]SNCHEZM，VALEROPL，POZOMD，etal.Andfo-

veoschisiscausedbyamutationintheMFRPgene：afamilialstudy[J].OphthalmicGenetics，2019，40（3）：1-5.

[8]亢鴻飛，白楠，梅世月.一個(gè)視網(wǎng)膜色素變性家系的基因診斷和產(chǎn)前診斷[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2018，35（2）：184-187.

[9]楊琳，蔡小軍，柯敏，等.視網(wǎng)膜色素變性黃斑區(qū)外層視網(wǎng)膜管狀結(jié)構(gòu)的OCT特征及臨床意義[J].臨床眼科雜志，2019，27（4）：304-306.

[10]白周現(xiàn)，劉莉娜，胡爽，等.一個(gè)導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性的RHO基因新突變的鑒定[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2019，36（3）：234-237.

[11]鄒媛媛，汪建濤，李筱榮，等.玻璃體腔移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)及膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白和視紫紅質(zhì)表達(dá)的影響[J].中華眼底病雜志，2016，32（6）：596-600.

[12]SMIRNOVVM，MARKSC，DRUMAREI，etal.Severeretinitispigmentosawithposteriorstaphylomainafamilywithc.886C>Ap.（Lys296Glu）RHOmutation[J].OphthalmicGenetics，2019，40（4）：365-368.

[13]GARAFALOAV，CALZETTIG，CIDECIYANAV，etal.ConevisionchangesintheenhancedS-ConesyndromecausedbyNR2E3genemutations[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience，2018，59（8）：3209-3219.

[14]MAHAJAND，VOTRUBAM.AnovelNR2E3genemutationinautosomalrecessiveretinitispigmentosawithcysticmaculopathy[J].ActaOphthalmologica，2018，96（4）：e535-e536.

[15]ESCHERP，VACLAVIKV，MUNIERFL，etal.PresenceofatripleconcentricautofluorescenceringinNR2E3-p.G56R-linkedautosomaldominantretinitispigmentosa（ADRP）[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience，2016，57（4）：2001-2002.

[16]白周現(xiàn)，胡爽，孔祥東，等.NR2E3基因純合新突變致Goldmann-Favre綜合征一家系[J].中華眼底病雜志，2018，34（6）：541-545.

[17]KUNIYOSHIK，HAYASHIT，SAKURAMOTOH，etal.NewtruncationmutationoftheNR2E3geneinaJapanesepatientwithenhancedS-conesyndrome[J].JapaneseJournalofOphthalmology，2016，60（6）：476-485.

[18]童永清，李艷.高通量測(cè)序平臺(tái)發(fā)展及在臨床分子診斷中的應(yīng)用與展望[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2019，42（2）：73-76.

[19]高青.視網(wǎng)膜色素變性疾病的藥物治療基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2018，36（1）：70-74.

[20]張珂凡，曲秀霞.干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜退行性疾病[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2018，36（11）：871-877.

[21]劉家琪，王英，蔣鵬飛，等.枸杞丹參對(duì)視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)及CRYABmRNA的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，16（14）：14-15.

[22]饒書(shū)權(quán)，杜廷福，許琪.外顯子組測(cè)序在人類疾病中的應(yīng)用[J].遺傳，2014，36（11）：1077-1086.

[23]韋懿蕓，曾繁娟，龐麗紅，等.外顯子測(cè)序聯(lián)合Sanger測(cè)序行X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷家系分析及產(chǎn)前診斷1例報(bào)告[J].廣西醫(yī)學(xué)，2019，41（14）：1770-1773.

[24]HUYanshan，SONGHui，LIYin，etal.Whole-exomesequencingidentifiesnovelmutationsingenesresponsibleforretinitispigmentosain2nonconsanguineousChinesefamilies[J].InternationalJournalofOphthalmology，2019，12（6）：915-923.

[25]李啟英，張君，龐爽，等.外顯子測(cè)序技術(shù)在人類疾病中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2019，27（3）：381-384.

[26]LEMEURG，LEBRANCHUP，BILLAUDF，etal.Safetyandlong-termefficacyofAAV4genetherapyinpatientswithRPE65lebercongenitalamaurosis[J].MolecularTherapy：theJournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy，2018，26（1）：256-268.

[27]MIRALDIUTZV，COUSSARG，ANTAKIF，etal.GenetherapyforRPE65-relatedretinaldisease[J].OphthalmicGenetics，2018，39（6）：671-677.

[28]NEVELINGK，COLLINRW，GILISSENC，etal.Next-generationgenetictestingforretinitispigmentosa[J].HumanMutation，2012，33（6）：963-972.

[29]吳若豪，邱坤銀，李棟方，等.一例Ⅰa型先天性糖基化障礙病患兒的PMM2基因變異分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2019，36（4）：314-317.

[30]范祥雨.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在眼科疾病研究中的應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2018，36（7）：553-558.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）