童也，張小晴，許斌，劉曉偉

1蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233000；2東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，已經(jīng)成為兒童與青少年第2大癌癥相關(guān)死亡因素[1]。骨肉瘤患者應(yīng)用傳統(tǒng)的手術(shù)治療方式效果不理想且生存率低于20%。隨著骨肉瘤治療手段的不斷改進(jìn)，目前通過新輔助化療聯(lián)合手術(shù)的方式使患者整體生存率較以往有所提高，但5年生存率仍低于70%[2]，因此尋找新的治療手段成為研究重點(diǎn)。近年研究[3～7]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的基因主要有HER2、RB1、PTEN、EGFR、P53等。泛素羧基末端水解酶(BAP1)是泛素羧基末端水解酶家族中的成員，參與多種生物學(xué)功能，如底物的去泛素化、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、DNA的損傷修復(fù)等。最近研究[8]發(fā)現(xiàn)，BAP1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程高度相關(guān)，并且在腫瘤組織中主要發(fā)揮抑制作用。目前關(guān)于BAP1與骨肉瘤相關(guān)性的研究較為缺乏，2019年6～9月，本研究通過生物信息統(tǒng)計(jì)法分析BAP1抑制的骨肉瘤細(xì)胞芯片數(shù)據(jù)，并通過基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析方法尋找與BAP1抑制相關(guān)的核心基因，探索BAP1在骨肉瘤中發(fā)揮的作用，為骨肉瘤的治療方案提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及預(yù)處理 從GEO數(shù)據(jù)庫中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載人骨肉瘤細(xì)胞系U20S原始基因芯片數(shù)據(jù)集(編號(hào)及平臺(tái)文件分別為GSE58209與GPL570)。該數(shù)據(jù)集包含3例BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞樣本(實(shí)驗(yàn)組)與6例未經(jīng)特殊處理的骨肉瘤細(xì)胞樣本(對(duì)照組)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)R軟件中Affy包讀入，RMA算法對(duì)數(shù)據(jù)做標(biāo)準(zhǔn)化處理。用平臺(tái)文件GPL570對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中探針信息進(jìn)行注釋。數(shù)據(jù)中存在多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因名的情況，通過取多個(gè)探針基因表達(dá)平均值的方法來合并探針。最后，基于最近鄰居值算法(KNN)，經(jīng)由R軟件中Immpute包補(bǔ)充數(shù)據(jù)集中的缺失值。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后檢測(cè)BAP1的干擾效率發(fā)現(xiàn)，BAP1在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，表明實(shí)驗(yàn)中研究者對(duì)BAP1的干擾是有效的。

1.2 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因的篩選 預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，使用R軟件中Limma包對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。篩選條件為變化倍數(shù) |log2(fold change)| > 1且校正后的P<0.05。

1.3 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因本體功能及代謝通路分析 采用R軟件中clusterProfiler包[9]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析。GO富集分析分為3個(gè)功能組分，包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組成。在富集分析過程中，使用費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)(Fisher′exact test)來檢驗(yàn)差異基因在某個(gè)網(wǎng)絡(luò)中是否富集，設(shè)置校正后的P<0.05作為篩選條件。

1.4 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 差異表達(dá)基因提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，最小有效結(jié)合分?jǐn)?shù)設(shè)為0.4。分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用該軟件中CytoHubba插件尋找網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的核心差異基因(度值最高的基因)。

2 結(jié)果

2.1 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因 共篩選出BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞的差異表達(dá)基因461個(gè)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中上調(diào)的差異表達(dá)基因有64個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)基因有397個(gè)，上調(diào)與下調(diào)差異表達(dá)基因中變化最顯著的前15個(gè)基因見表1。

2.2 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞差異基因生物學(xué)功能及代謝通路 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因主要參與DNA復(fù)制、核分裂和細(xì)胞器裂變等生物學(xué)過程；差異表達(dá)基因主要定位于紡錘體和染色體區(qū)域；差異表達(dá)基因的主要分子功能有DNA復(fù)制起始點(diǎn)結(jié)合與作用于DNA的催化活性。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，共有5條代謝通路被富集到，富集分析最有意義的代謝通路與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制有關(guān)。

2.3 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞核心差異表達(dá)基因 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)見圖1。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的度值最高的前10個(gè)基因從高到底分別為CDK1(分值：105)、CDC6(分值：88)、TOP2A(分值：87)、CDC45(分值：85)、MCM2(分值：81)、NCAPG(分值：80)、EXO1(分值：80)、NDC80(分值：79)、RFC4(分值：79)、DTL(分值：78)，這些基因?yàn)楹诵牟町惢?，最核心差異基因?yàn)镃DK1，見圖2。10個(gè)核心差異基因在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)情況見表2。

表1 符合納入條件的上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的前15位mRNA

注：★代表上調(diào)的基因。

圖1 BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心差異基因

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的10個(gè)核心差異基因

3 討論

BAP1是泛素羧基末端水解酶家族中的一員，去除底物蛋白的泛素化修飾是其基本功能。BAP1還可以通過依賴或不依賴其去泛素化功能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和DNA損傷應(yīng)答等。最近研究[10]發(fā)現(xiàn)，BAP1在多種腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用，BAP1突變導(dǎo)致該基因的功能缺失容易引發(fā)惡性腫瘤綜合征。也有研究[11，12]表明，在惡性間皮瘤與侵襲性腦膜瘤中，BAP1被檢測(cè)到處于等位基因失活狀態(tài)，提示BAP1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了重要角色，BAP1基因突變或者功能失活會(huì)提高腫瘤的發(fā)生率。

SPINK6屬于Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，通過調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的活性對(duì)人體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生影響，在各種生理、病理過程中起到重要的調(diào)控作用[13]。Zheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SPINK6 mRNA在腫瘤和高度轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，異位SPINK6表達(dá)提高了鼻咽癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力，促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝臟轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞與BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞的差異表達(dá)基因中，SPINK6上調(diào)最為顯著。表明骨肉瘤細(xì)胞在BAP1抑制的條件下，可能會(huì)引發(fā)SPINK6表達(dá)的上調(diào)，從而提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，導(dǎo)致骨肉瘤患者預(yù)后不良。CNN1即鈣調(diào)蛋白1，參與調(diào)控平滑肌的收縮與細(xì)胞增殖。既往研究[15～17]發(fā)現(xiàn)，CNN1在多種腫瘤組織中下調(diào)，CNN1的正常表達(dá)可以抑制腫瘤的增殖與侵襲能力。本研究中篩選出的BAP1抑制的骨肉瘤細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞的差異表達(dá)基因中CNN1顯著下調(diào)，進(jìn)一步印證了CNN1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，提示CNN1有望成為骨肉瘤患者的預(yù)后標(biāo)志物。

對(duì)BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明差異表達(dá)基因主要參與的生物學(xué)過程有DNA復(fù)制、核分裂和細(xì)胞器裂變。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示富集分析最有意義的代謝通路與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制有關(guān)。提示BAP1在骨肉瘤細(xì)胞中受抑制的情況下，主要通過影響骨肉瘤細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制以及細(xì)胞周期從而對(duì)骨肉瘤的進(jìn)展產(chǎn)生一定的影響。

為了尋找在BAP1抑制條件下骨肉瘤細(xì)胞中較為重要的差異基因，在STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件中構(gòu)建了差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)，并找出該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的核心差異基因，度值前10位的基因從高到低分別為CDK1、CDC6、TOP2A、CDC45、MCM2、NCAPG、EXO1、NDC80、RFC4、DTL，其中度值最高的核心差異基因是CDK1。CDK1是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1，同時(shí)也是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，在真核細(xì)胞周期的 G1/S 和 G2/M 期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用[18]。CDK1可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有絲分裂以及細(xì)胞周期的過程，激活相關(guān)癌癥通路，影響骨肉瘤患者的疾病進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，CDK1在經(jīng)過BAP1抑制后，是下調(diào)的。提示，在BAP1抑制條件下，骨肉瘤細(xì)胞CDK1表達(dá)同時(shí)下調(diào)，二者協(xié)同影響骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因共461個(gè)，其中64個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)、397個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)基因主要參與DNA復(fù)制、核分裂和細(xì)胞器裂變等生物學(xué)過程，影響細(xì)胞周期和DNA復(fù)制等相關(guān)代謝通路。BAP1敲低的骨肉瘤細(xì)胞中的核心差異基因?yàn)镃DK1。進(jìn)一步的研究將觀察核心差異基因在其他BAP1抑制的人骨肉瘤數(shù)據(jù)集中的表達(dá)以驗(yàn)證當(dāng)前研究結(jié)果的可靠性；結(jié)合骨肉瘤的臨床數(shù)據(jù)與二代測(cè)序數(shù)據(jù)，通過臨床預(yù)測(cè)模型來進(jìn)一步分析BAP1與骨肉瘤的預(yù)后相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示BAP1在骨肉瘤中所扮演的角色提供有價(jià)值的基礎(chǔ)工作。