王艷,鄭末,王碩瑩,馬麗,曾妮,黃少祥

天津市第五中心醫(yī)院,天津 300450

全球肺癌的死亡率和發(fā)生率均居癌癥之首[1]，非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%左右，其治療方法主要以手術(shù)治療和化療為主，隨著靶向治療的逐漸發(fā)展，非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后得到極大改善[2]，但是其生存率依然偏低，因此探索非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展的作用機制具有重要的臨床意義[3]。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，近年發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)。上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin)屬于鈣黏著素超家族成員，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏著和相互作用，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[4,5]。黏蛋白1(MUC1)屬于黏蛋白家族成員，是一種高糖基化的跨膜蛋白，在腫瘤組織中表達異常，主要發(fā)揮促進腫瘤細(xì)胞的增殖、耐藥和轉(zhuǎn)移的作用[6,7]。半胱氨酸-組氨酸富裕蛋白(PINCH)屬于黏著斑蛋白家族成員，富含半胱氨酸和組氨酸的氨基酸區(qū)域能夠形成鋅指結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞之間黏附和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡抑制聯(lián)系密切[8]。E-cadherin、MUC1及PINCH均為黏附分子家族成員，介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞基質(zhì)間相互作用，參與細(xì)胞的黏附和遷移等功能，在多種腫瘤中，三者均參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響腫瘤細(xì)胞的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。目前E-cadherin、MUC1及PINCH在非小細(xì)胞肺癌中的表達變化及其是否參與了肺癌發(fā)生發(fā)展過程尚不明確。本研究觀察了非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin、MUC1和PINCH的表達變化情況，并分析了癌組織中E-cadherin、MUC1和PINCH的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年5月～2019年2月在天津市第五中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者77例，男40例、女37例，年齡39～72(52.18±9.78)歲。既往有吸煙史19例。肺腺癌47例、肺鱗癌30例。根據(jù)肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第八版)：Ⅰ期35例、Ⅱ期18例、Ⅲ期15例、Ⅳ期9例。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的分化程度：低分化51例、中分化17例、高分化9例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。肺癌直徑≤5 cm 48例，>5 cm 29例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷確診為非小細(xì)胞肺癌；②臨床資料完整；③初次診斷為非小細(xì)胞肺癌，并且在入院之前未接受過放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能異常；②確診為肺癌，但是合并有其他類型腫瘤；③孕婦或者處于哺乳期；④存在精神障礙，對治療的依從性較差；⑤非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)患者；⑥無法進行手術(shù)患者。臨床研究開展前均與患者取得聯(lián)系，并與其簽署知情同意書。臨床研究的開展經(jīng)過院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 受檢組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的檢測 采用實時熒光定量PCR法。術(shù)中切除非小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織，同時切除距離肺癌組織邊緣5 cm以上的正常組織作為對應(yīng)的癌旁組織。術(shù)中切除組織后立即將組織放置到凍存管中，投入到液氮中快速冷凍，并在液氮中長期保存。待所有入組患者的臨床樣本采集完全后，將所有腫瘤組織及其癌旁組織樣本從液氮中取出，根據(jù)臨床組織樣本的重量加入足量的TRIzol溶液、按說明書步驟提取受檢組織總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄法對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備相應(yīng)的cDNA。然后以β-actin作為內(nèi)參，通過熒光定量PCR法檢測E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA，實驗操作嚴(yán)格按照熒光定量PCR儀(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司，型號：TL988-IV)的操作流程進行。用2-ΔCt表示受檢組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct目標(biāo)蛋白-Ctβ-ACTIN。E-cadherin的PCR引物：正向引物：5′-AAGCCTCAGGTCATAAACATC-3′，反向引物：5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAG-3′。MUC1的PCR引物：正向引物：5′-GGTTCAAGTTACCGAAGGC-3′，反向引物：5′-GCAAGGAACACTTCGTTCG-3′。PINCH的PCR引物:正向引物：5′-AACATCGGCCGGTCCGGTAT-3′，反向引物：5′-TTGGCGGCACCAATTCGGC-3′。β-actin的PCR引物:正向引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物：5′-CAGGAGGTAGGTTCATAG-3′。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA相對表達量比較 非小細(xì)胞肺癌癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量分別為1.33±0.27、7.67±1.25、11.33±2.61，癌旁組織中分別為10.33±2.38、0.71±0.15、2.56±0.58，與癌旁正常組織比較，非小細(xì)胞癌組織中E-cadherin mRNA相對表達量低，MUC1 mRNA、PINCH mRNA相對表達量高(P均<0.05)。

2.2 非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與患者的年齡、性別、病理類型、分化程度、吸煙史和腫瘤大小無關(guān)(P均>0.05)，詳見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA的相對表達量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA、PINCH mRNA表達的相關(guān)性 非小細(xì)胞肺癌中E-cadherin mRNA與MUC1 mRNA表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635，P<0.001)；E-cadherin mRNA與PINCH mRNA表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.708，P<0.001)；MUC1 mRNA與PINCH mRNA表達無相關(guān)性(r=0.172，P=0.098)。

3 討論

鈣黏蛋白是細(xì)胞黏附分子，分為E、P和N三種類型，E-cadherin基因位于第16號染色體的16q22-q23.1位點，主要分布在上皮細(xì)胞表面，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞和基質(zhì)間黏附。研究表明，肺癌[10]、乳腺癌[11]等惡性腫瘤細(xì)胞表面E-cadherin表達減少，并且是腫瘤細(xì)胞惡性間質(zhì)性表型的標(biāo)志分子，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。本研究中，癌組織中E-cadherin表達明顯低于癌旁組織，其機制可能是腫瘤細(xì)胞絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活促進腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達增加，Snail1結(jié)合并抑制E-cadherin的表達，導(dǎo)致E-cadherin水平降低[12]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin表達與非小細(xì)胞肺癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明E-cadherin的表達可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。其主要原因一方面是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中E-cadherin表達量下調(diào)會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞之間的黏著性下降，癌細(xì)胞更傾向于向病灶外的區(qū)域發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致分期升高且易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移。另一方面，腫瘤細(xì)胞E-cadherin表達量下調(diào)常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤分期升高[13]。

黏蛋白是一種高分子量的糖蛋白，具有潤滑和保護上皮細(xì)胞的的作用，分為膜結(jié)合型蛋白和分泌型黏蛋白，MUC1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其基因定位于1q21，翻譯后被分解為氮端和碳端，兩者通過非共價鍵形成異源二聚體，機體處于正常狀態(tài)下，MUC1表達水平較低，多分布在胃腸道、呼吸道、乳腺等分泌上皮細(xì)胞的近管腔面[14,15]。近年研究表明腫瘤細(xì)胞中MUC1氮端通過與細(xì)胞間黏附分子-1、E-選擇素、半乳凝素-3結(jié)合激活相關(guān)的信號通路，從而促進腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中MUC1表達量明顯升高，其機制可能是腫瘤微環(huán)境中表皮生長因子受體家族、酪氨酸激酶受體活化后，激活PI3K/AKT信號通路、NF-κB 信號通路等，促進腫瘤細(xì)胞MUC1 的表達[16]。本研究中MUC1表達與非小細(xì)胞肺癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。其原因可能是由于MUC1與腫瘤干細(xì)胞的形成密切相關(guān)，MUC1的表達量增加會導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中干細(xì)胞比例增加，從而有利于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，同時腫瘤干細(xì)胞具有很強的遷移能力，因此MUC1表達下調(diào)能夠有效增強腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌惡性程度加重和轉(zhuǎn)移的增加[17]。

PINCH作為一種傳導(dǎo)整合蛋白，通過雙鋅指結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)配體結(jié)合，參與細(xì)胞的黏附和遷移功能，主要在細(xì)胞質(zhì)和基質(zhì)中低水平表達。目前已經(jīng)證實PINCH在乳腺癌、肺癌、大腸癌及前列腺癌等多種腫瘤中表達水平異常升高[18]，PINCH作為MAPK和TGF-β通路的下游分子，通過相應(yīng)下游效應(yīng)因子促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究中，非小細(xì)胞肺癌組織中PINCH表達量明顯升高，其原因可能與腫瘤細(xì)胞中Rsu1表達降低后，促進PINCH表達有關(guān)，其機制是Rsu1的表達具有穩(wěn)定PINCH的作用，Rsu1表達降低導(dǎo)致PINCH蛋白降解增多[19]。此外，癌組織中PINCH表達與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示PINCH參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。其機制是非小細(xì)胞肺癌中PINCH表達下調(diào)能夠激活MAPK和TGF-β信號通路，從而促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，同時PINCH與Nck-2 結(jié)合后，磷酸化激活蛋白激酶B，與整合素連接激酶氮端的錨蛋白集合形成的復(fù)合物影響整合素信號通路，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[20]。

本研究中E-cadherin表達與MUC1及PINCH表達呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是PINCH的LIM1域與整合素連接激酶相互作用，從而通過特定的整合素/整合素連接激酶信號通路介導(dǎo)局灶性粘連，進而影響E-cadherin表達水平[21]。腫瘤微環(huán)境中TNF-α和IFN-γ能夠促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致NF-κB通路的活化，抑制E-cadherin表達同時，促進MUC1表達[22]。

綜上所述，在非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin mRNA表達下調(diào)，而MUC1 mRNA和PINCH mRNA表達上調(diào)，E-cadherin mRNA、MUC1 mRNA和PINCH mRNA表達與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。E-cadherin、MUC1和PINCH有可能共同參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的增殖及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，有望成為非小細(xì)胞肺癌診斷、療效評估及預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)記物。