韓 悅 姚 煦

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所，南京，210042

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是常見的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病,多見于兒童,常伴食物過敏、過敏性鼻炎和哮喘,患者劇烈瘙癢,嚴重影響生活質(zhì)量,是皮膚科最受關注的疾病之一[1,2]。近20年世界范圍內(nèi)特應性皮炎的發(fā)病率迅速增高,西方發(fā)達國家兒童特應性皮炎的發(fā)病率約為10%～20%[3]。近年報道我國多城市兒童特應性皮炎發(fā)病率為12.94%。AD的發(fā)生與多種細胞息息相關，其中，角質(zhì)形成細胞(keratinocytes，KC)至關重要，其活化與炎癥在AD中扮演著關鍵性的角色。目前發(fā)病機制尚未完全明確，故特應性皮炎的治療仍非常困難[4]。因此,積極探索特應性皮炎的發(fā)病機制具有非常重要的意義。

外泌體是活細胞分泌的來源于晚期核內(nèi)體的膜性囊泡，直徑約為30～150 nm[5]。它天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等體液中[6]。外泌體1980年首次被發(fā)現(xiàn)，當時被認為是細胞排泄廢物的一種方式，如今隨著研究深入，外泌體運輸功能，特異靶向受體細胞，交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號傳導參與細胞間通訊等功能逐漸被揭示[7]。不同組織細胞來源的外泌體由于攜帶的蛋白質(zhì)不同，從而發(fā)揮不同的生物學功能[8]。外泌體除含有蛋白外，還含有各種非編碼RNA，如microRNAs等，參與基因的表達調(diào)控[9]。

目前為止，外泌體關于AD方面鮮有報道。因此我們嘗試通過檢測AD患者外周血中外泌體來研究其對KC的調(diào)控作用。此文基于傳統(tǒng)實驗方法擬探討AD患者外周血外泌體調(diào)控HaCaT細胞的活化及炎癥，為AD的診斷和發(fā)病機制提供一些理論指導。

1 材料與方法

1.1 一般資料 資料概況：本次臨床研究均獲受試者及其家屬知情并簽署知情同意書。選取2017年5月至2018年5月期間中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院就診的AD患者和同期健康人的外周血標本各30例為研究對象，并記錄患者的年齡、性別。AD患者中位數(shù)年齡為17.04歲，男/女比例為1.14，健康人年齡中位數(shù)為21.63歲，男/女比例為1.31，所有外周血標本均于清晨空腹采集。

納入標準： 符合AD的William診斷標準，年齡介于18～70歲，無其他嚴重疾病者。

排除標準：伴有其他皮膚病，心肝腎功能不全，臨床及隨訪資料不全。

1.2 exoEasy Maxi Kit試劑盒提取外泌體 預先過濾細胞培養(yǎng)上清，將大于0.8 μm的微粒全部除去，將buffer XBP加入到等體積樣品中，試管上下震蕩5次，室溫混合。將上述混合液結合在核酸純化柱上離心500 g 1 min，棄上清，將柱子復原至同一個接受管中。加入10 mL buffer XWP 5000 g離心5 min以去除殘余buffer，棄上清及接受管。轉移核酸純化柱至一個新的接受管。加入400 μL～1 mL bufferXE至膜上孵育1 min，離心500g 5 min，收集洗脫液。再次將洗脫液加入至exoEasy核酸純化膜中，并孵育1 min，離心5000 g 5 min，收集洗脫液轉移至凍存管，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 外泌體驗證

1.3.1 電鏡驗證 外泌體戊二醛固定。清洗：用1 mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。鋨酸固定：加入0.5 mL 2%鋨酸溶液 4度固定2 h。清洗：用1 mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1 mL梯度脫水分別靜置15 min，再用1 mL 100%乙醇脫水2次，每次20 min。置換：用1 mL丙酮置換2次，每次靜置15 min。浸漬。包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。聚合：將包埋板置于65℃條件下聚合48 h。染色：醋酸雙氧鈾染色10 min后清洗；醋酸鉛染色10 min后清洗。上機檢測。

1.3.2 外泌體粒徑分析(nanoparticle tracking analysis，NTA) 采用NTA檢測提取物粒徑大小，若介于30～200 nm之間，即為外泌體提取成功。

1.4 CCK-8法檢測HaCaT增殖 實驗采用CCK8法檢測各組細胞于轉染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時間點的增殖情況。將三組細胞調(diào)整至1.0×105/孔，取100 μL/孔在96孔板中接種，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入20 μL的CCK-8溶液(APExBIO，USA)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，不用清洗，直接用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。每組設6個副孔，重復三次。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 將轉染后的細胞培養(yǎng)48 h，用0.25%胰酶消化細胞后血清終止消化，離心300 g 5 min收集細胞。用冰PBS清洗細胞一次，300 g離心5 min。加入300 μL的1×Binding Buffer 懸浮細胞。加入5 μL的Annexin V-FITC(BD，USA)混勻后，避光，室溫孵育15 min。上機前5 min再加入5 μL的PI染色。

1.6 HaCaT細胞RNA的檢測

1.6.1 試劑盒提取總RNA 使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，德國)試劑盒提取血清中總RNA，操作步驟按照說明書進行。首先將兩組人群的全血離心2000 g 3 min，加入Buffer RLT震蕩混勻，將液體移入到2 mL的收集管內(nèi)離心2 min，加入一倍體積的70%乙醇，混勻，移出700 μL混合物到Rneasy收集柱，10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入700 μL的Buffer RW1，10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入500 μL Buffer RPE 10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入500 μL Buffer RPE蓋上蓋子，大于10000 rpm離心2 min，將柱子移入到一個新的2 mL收集管內(nèi)，全速離心1 min，將柱子移入到一個新的1.5 mL 收集管內(nèi)，加入30 μL的無Rnase water，10000 rpm離心1 min，重復一次，收集濾液。分光光度計檢測RNA濃度和OD值，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 熒光定量-PCR(q-PCR)檢測細胞中RNA的表達 首先利用primer 5.0進行引物設計，采用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒(QIAGEN，德國)將提取出來的總RNA逆轉錄合成cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為37℃ 60 min，95℃ 5 min。以cDNA為模板，利用SYBR?Green PCR Kit(QIAGEN，德國)進行PCR 擴增，反應體系為20 μL，反應條件為95℃ 15 min，1循環(huán)；95℃ 15 s，55℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為實驗的內(nèi)參基因，相對表達量以2-△△Ct形式表示，其中△CT=CT(目的基因)-CT(GAPDH)(表1)。

表1 各mRNA引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法 文中實驗結果數(shù)據(jù)在SPSS 20.0軟件中統(tǒng)計分析，統(tǒng)計圖在Graghpad Prism 7軟件中繪制和編輯加工，采用獨立t檢驗分析兩組獨立樣本間的均數(shù)差異，采用ANOVA檢驗進行多組間均數(shù)差異的比較。實驗數(shù)據(jù)中計量資料以均數(shù)±標準差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 外泌體對HaCaT細胞的增殖的影響 將0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白濃度的正常人-外泌體分別與HaCaT細胞共培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測各組細胞的0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時間點的增殖情況。與對照組相比，各濃度正常人-外泌體組在12 h、24 h、48 h時間點細胞增殖水平均明顯降低(均P<0.001)，40 g/L外泌體組尤為明顯(圖1、表2)。

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

圖1CCK-8檢測各組細胞的增殖情況

2.2 外泌體對HaCaT細胞的凋亡的影響 將0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白濃度的正常人-外泌體分別與HaCaT細胞共培養(yǎng)48 h，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細胞的凋亡情況。0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L外泌體組細胞的凋亡率分別是2.53±0.3、14.53±2.6、17.12±2.2、12.12±1.2，與對照組相比，各濃度外泌體組細胞凋亡水平均明顯升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。凋亡實驗結果中40 g/L外泌體組尤為顯著(圖2)。

2.3 外泌體驗證 為了驗證從外周血上清中分離的提取物是外泌體，我們用了兩種方法—電鏡與NTA。透射電鏡下觀察到均一的微小囊泡，NTA鏡下觀察到提取物粒徑在3 nm與200 nm之間，即為外泌體分離成功(圖3、4)。

表2 CCK-8法檢測各濃度外泌體加入HaCaT細胞的增殖情況

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

2.4 外泌體對HaCaT細胞的調(diào)控作用 根據(jù)加入外泌體情況分為三組：AD-外泌體組、正常人-外泌體組和對照組，利用q-PCR檢測各組細胞的活化(K16)、分化(K10、IVL)、炎癥指標(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)。結果顯示，較于正常人-外泌體組和對照組，AD-外泌體組中K16、K10、IVL，TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達上調(diào)(P<0.05)，CXCL1表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖5)。

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

圖2流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況

圖3 透射電鏡下外泌體結構(×400) 圖4 NTA檢測外泌體粒徑大小 4a：外泌體粒徑檢測；4b：外泌體粒徑三維模式圖

NC：未加入外泌體的對照組；NH-EXO：加入蛋白濃度為40 g/L的正常人外泌體組；AD-EXO：加入蛋白濃度為40 g/L的AD外泌體組

圖5qPCR法檢測各組細胞的細胞因子的表達差異

3 討論

特應性皮炎表現(xiàn)為皮膚增厚、瘙癢，有明顯的家族遺傳傾向，易患哮喘、過敏性鼻炎等過敏性疾病。大多從幼時發(fā)病，皮損遷延不愈、瘙癢劇烈，甚至影響患兒的身心健康[9-11]。目前，AD的發(fā)病機制尚不明確。因此，探索有關AD發(fā)生發(fā)展的分子標記具有重要意義。如果能利用現(xiàn)代實驗手段找出AD患者中的一些表達差異的生物標記物，那么對AD的早期治療具有非常重要的科學價值。隨著分子生物學、免疫學等基礎學科的迅猛發(fā)展，對AD的研究日益深入，

多種與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關的生物標記物被發(fā)現(xiàn)，外泌體即是其中之一[12]。

近期多項研究揭示了各種來源的外泌體對KC的多種調(diào)控作用。Zhang等[13]的研究解釋了肥胖者傷口愈合速度比正常人慢的現(xiàn)象，脂肪細胞源性外泌體通過直接與PUM2結合，促進其介導的NF-kB通路激活，進而誘導人KC炎癥和凋亡。最近一項研究[14]顯示，泛發(fā)性膿皰性銀屑病中性粒細胞源外泌體較正常中性粒細胞誘導KC中IL-1β、IL-36、IL-18、TNF-α和C-X-C基序趨化因子配體等炎癥基因的高表達。此外，患者的中性粒細胞比對照組分泌更多的外泌體，后被KC迅速內(nèi)化，通過激活NF-kB和MAPK信號通路增加這些炎癥分子的表達。綜上研究，脂肪細胞和中性粒細胞源外泌體可以調(diào)控人KCs的增殖、凋亡和炎性因子的分泌，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。基于以往研究，我們在本試驗中擬探索AD患者外周血中外泌體能否對KC的活化、炎癥產(chǎn)生影響。

首先收集我院AD患者和健康人的外周血樣本各30例并分離血漿中外泌體，采用電鏡與NTA來進行外泌體的結構驗證，然后進行外泌體的功能研究：將不同蛋白濃度的外泌體分別與HaCaT細胞共培養(yǎng)，檢測各組細胞的增殖、凋亡情況，目的是找出外泌體對細胞增殖凋亡的影響和它的最佳刺激濃度。結果發(fā)現(xiàn)，加入正常人-外泌體后的細胞增殖率較對照組顯著降低、凋亡率明顯升高；其中，加入40 g/L蛋白濃度刺激后的差異尤為顯著。因此我們將該濃度的外泌體進行后續(xù)實驗研究。根據(jù)加入外泌體情況將HaCaT細胞分為AD-外泌體組、正常人-外泌體組和對照組，檢測三組細胞的活化(K16)、分化(K10、IVL)、炎癥(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)指標。結果顯示，較正常人-外泌體組和對照組，AD-外泌體組中K16、K10、IVL、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達升高，而CXCL1差異無統(tǒng)計學意義。所以，AD-外泌體可以促進KC的增殖和炎癥因子的分泌。得出結論：AD患者外周血外泌體可以抑制KC的凋亡并促進KC的增殖、活化及炎癥因子的分泌，從而參與AD的發(fā)生發(fā)展。

在設計方面該實驗有一定的不足之處，因各種客觀因素，樣本量較少，從而對研究結果產(chǎn)生一定的影響，后期有條件可適當對樣本量進行擴充。此外，細胞實驗中我們選用了人正常角質(zhì)形成細胞系HaCaT，值得說明的是，細胞株與人體細胞間畢竟具有一定的變異性，目前兩者差異能否對實驗結果構成影響尚不明確。重要的是，外泌體中影響人KC活化、炎癥的具體物質(zhì)，還有待于進一步發(fā)現(xiàn)和研究。