王藝曉　樸君　程兆榜　鄧金花　周益軍　李碩

摘要：采用室內(nèi)灰飛虱接種鑒定的方法評價了江蘇地區(qū)主要雜草對水稻條紋病毒（rice stripe virus， 簡稱RSV）的感染率。結(jié)果顯示，看麥娘、稗、旱稗、狗尾草、升馬唐的感染率較高，為38.24%～62.00%，具有成為RSV“橋梁”寄主的可能性。對病害大流行年份（2005年）江蘇主要雜草種類RSV感染率田間調(diào)查工作進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)野生禾本科雜草中存在RSV感染，但其感染率低于同期小麥植株的感染率，這說明小麥是RSV侵染循環(huán)中重要的“橋梁”寄主。于病害不流行年份（2018—2019年）在江蘇多地采集田邊稗草和狗尾草，經(jīng)分子生物學(xué)檢測，可檢測出RSV。禾本科雜草對病害流行的貢獻度低于小麥，其在病害侵染循環(huán)中的作用主要體現(xiàn)在維持RSV在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的存在。

關(guān)鍵詞：禾本科雜草;水稻條紋病毒;病毒感染率;田間調(diào)查;風(fēng)險評估

中圖分類號：S451文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2020）04-0014-06

Risk Assessment of Gramineae Weeds for Rice Stripe Virus Epidemic in the Field

WANG Yi-xiao1，2， PIAO Jun1， CHENG Zhao-bang2， DENG Jin-hua2， ZHOU Yi-jun2， LI Shuo2

（1.School of Life Science，Liaoning Normal University， Dalian 116081， China;2.Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

Abstract：The infection rate of rice stripe virus （RSV） to main weeds in Jiangsu Province was evaluated using Laodelphax striatellus for inoculation in laboratory. Alopecurus aequalis， Echinochloa crusgalli， E. hispidula， Setaria viridis and Digitaria ciliaris could serve as “bridge” hosts of RSV. Their infection rates were between 38% and 62%. RSV infection rate to main weed species in fields in Jiangsu Province during the epidemic year （2005） was summarized. RSV infection existed in wild Gramineae weeds， but its infection rate was lower than that in wheat plants at the same time. It suggested that wheat was an important “bridge” host in RSV infection cycle. RSV was detected in E. crusgalli and S. viridis collected from many locations in Jiangsu Province when the disease was not prevalent （2018—2019）. The contribution of Gramineae weeds to the disease epidemic was lower than that of wheat， and their role in the disease infection cycle was mainly reflected in maintaining the existence of RSV in the farmland ecosystem.

Key words：Gramineae weed; rice stripe virus; virus infection rate; field survey; risk assessment

水稻條紋葉枯病是水稻重要病毒病害之一，該病由介體昆蟲灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallén）傳播水稻條紋病毒（rice stripe virus， 簡稱RSV）引起。在2003—2010年，水稻條紋葉枯病在以江蘇省為中心的華東稻區(qū)暴發(fā)，對水稻生產(chǎn)造成了極大損失[1-2]。病害曾在我國擴及到18個?。ㄊ?、自治區(qū)）的多個稻區(qū)，其中以江蘇、浙江、安徽、河南、山東、云南等地的粳稻田發(fā)病最為普遍[1]。此外，該病害在東亞地區(qū)的日本、韓國、朝鮮等地也有分布[3-4]?；绎w虱是RSV的主要傳播介體，它與水稻條紋葉枯病的流行和暴發(fā)有著非常密切的關(guān)系[1，5]。RSV可由灰飛虱經(jīng)卵傳至子代[6-7]，這一特性是RSV在稻麥輪作區(qū)多年持續(xù)流行的重要原因，所以條紋葉枯病一旦大發(fā)生，就可以造成持續(xù)數(shù)年的流行危害。2010年以后，隨著以抗病品種和“防蟲網(wǎng)阻斷傳毒”為核心技術(shù)的綠色綜合防控體系大面積推廣，水稻條紋葉枯病在華東稻區(qū)的感染趨勢逐年下降[2，8]。近年來，該病主要在云南省流行危害，已成為當前危害云南水稻最嚴重的病毒病[9]，并向四川省南部地區(qū)擴散[10]。

RSV為纖細病毒屬（Tenuivirus）成員，自然條件下只侵染禾本科植物，與同屬的其他病毒相比，RSV的寄主范圍相對較廣[11]。實驗室條件下，RSV可以通過摩擦接種侵染本氏煙[12]，也可通過灰飛虱傳毒侵染擬南芥[13]。研究人員室內(nèi)接種鑒定發(fā)現(xiàn)，除水稻外，RSV還能侵染大麥、小麥、看麥娘（Alopecurus aequalis Sobol.）、玉米、早熟禾等80多種禾本科作物和雜草[4，14]，故RSV在田間存在著廣泛的潛在寄主。在江蘇省稻麥輪作區(qū)，大量種植的冬小麥成為病毒和灰飛虱的主要越冬場所和中間寄主[15]。雖然RSV的禾本科雜草寄主范圍已有詳細報道，但各雜草種類對RSV的感染率，尤其是田間自然條件下的感染率還不清楚。條紋葉枯病在江蘇大流行期間，馬唐[Digitaria sanguinalis （L.） Scop.]、稗[Echinochloa crusgalli （L.） Beauv.]、升馬唐[Digitaria ciliaris （Retz.） Koel.]等禾本科雜草在田間已普遍發(fā)生，這些雜草有作為RSV流行過程中“橋梁”寄主的潛力，為介體傳毒提供毒源，但它們在病害發(fā)生流行中的作用尚不明確。評估調(diào)查雜草寄主在RSV流行中的風(fēng)險作用，對解析RSV的侵染循環(huán)規(guī)律有著重要意義，同時也可以為水稻條紋葉枯病的綜合防治提供參考。因此，本研究采用室內(nèi)接種鑒定方法評價了江蘇地區(qū)主要雜草種類對RSV的感染率，并對病害大流行年份（2005年）江蘇主要雜草種類RSV田間感染率調(diào)查工作進行了總結(jié)，同時，于病害不流行年份（2018—2019年）在江蘇多地采集田邊雜草，進行RSV感染情況檢測，綜合分析雜草在病毒流行中的風(fēng)險作用。

1 材料與方法

1.1 傳毒介體

帶毒（RSV）灰飛虱群體為筆者所在實驗室篩選保存?；绎w虱采集自江蘇省海安市，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所植物病毒研究室利用RSV經(jīng)卵傳播特性經(jīng)多代篩選獲得高親和性帶毒（RSV）群體，并在實驗室內(nèi)常年維持帶毒，具體篩選方法參照劉海建等的研究[16]。本試驗所用灰飛虱群體帶毒率為80%。

1.2 雜草寄主室內(nèi)接毒及檢測

于田間收集江蘇地區(qū)主要禾本科雜草的種子，雜草種類包括看麥娘、牛筋草[Eleusine indica （L.） Gaertn.]、馬唐、狗尾草[Setaria viridis （L.） Beauv.]、稗[Echinochloa crusgalli （L.） Beauv.]、旱稗[Echinochloa hispidula （Retz.） Nees.]、升馬唐、千金子[Leptochloa chinensis （L.） Nees.]和菵草[Beckmannia syzigachne （Steud.） Fern.]，共計9種。雜草種子用赤霉素浸種 8 h，在燒杯中播種，置于26 ℃光照培養(yǎng)箱種。在苗期按照3頭/株的比例接入帶毒灰飛虱，接毒3 d后，雜草苗移至室外無蟲網(wǎng)室生長，并觀察記錄葉片癥狀。每個品種設(shè)3個重復(fù)，以不接毒樣本作為對照，2周后利用RSV單克隆抗體采用斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA） [17]檢測雜草樣本的感染率。

1.3 病害大流行年份江蘇地區(qū)田間雜草RSV感染率調(diào)查

于RSV大流行年份（2005年）春季在江蘇地區(qū)已發(fā)生RSV感染小麥的麥田中采集野生禾本科雜草。采集地點包括江蘇省東海市、句容市大卓鎮(zhèn)和東昌鎮(zhèn)、建湖縣、靖江市、阜寧縣、淮安市楚州區(qū)、泰州市姜堰區(qū)婁莊鎮(zhèn)。采集雜草種類為江蘇地區(qū)麥田4—5月常見野生禾本科雜草，包括看麥娘、牛筋草、馬唐、狗尾草、稗、菵草、野燕麥（Avena fatua）、狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]、棒頭草（Polypogon fugax Nees ex Steud.）、李氏禾[Leersia hexandra Swartz]、鵝觀草（Roegneria kamoji Ohwi）和耿氏硬草[Sclerochloa kengiana （Ohwi） Tzvel.]，共計12種。每種雜草樣本數(shù)為10～374株不等，實驗室內(nèi)采用Dot-ELISA法檢測RSV感染率，并對同期田間小麥病株率進行調(diào)查。

1.4 病害不流行年份江蘇地區(qū)田間雜草RSV感染檢測

于病害不流行年份（2018—2019年）在江蘇省泰州市姜堰區(qū)、興化市、泰興市、句容市以及南京市溧水區(qū)等地稻田田埂采集表現(xiàn)類似“花葉條紋”癥狀的稗草和狗尾草。用Trizol法提取雜草葉片總RNA，設(shè)計靶向RSV NS2和NS3基因的2對特異檢測引物，ns2-F：5′-ATGGCATTACTCCTTTTCAAT-3′和ns2-R：5′-TCACATTAGAATAGGACACT-3′，ns3-F：5′-ATGAACGTGTTCACATCG-3′和ns3-R：5′-CCATGAAGAAGCCTCAGAAACTG-3′，進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收測序。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜草寄主室內(nèi)接毒RSV檢測結(jié)果

室內(nèi)用帶毒灰飛虱接種9種常見雜草，經(jīng) Dot-ELISA 檢測，結(jié)果顯示除菵草外，看麥娘、牛筋草、馬唐、狗尾草、稗、旱稗、升馬唐和千金子8種雜草均可被RSV侵染（表1），其中，看麥娘、升馬唐、狗尾草、稗、旱稗感染率較高，達38.24%～62.00%，表明這幾種雜草對RSV較為敏感，具有在RSV流行過程中作為“橋梁”寄主的可能性。

2.2 病害大流行年份田間雜草RSV感染率調(diào)查結(jié)果

于RSV大流行年份（2005年）在各地發(fā)生RSV感染的麥田中采集野生禾本科雜草樣本，共計12種，2 865份。經(jīng)Dot-ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)野生禾本科雜草中存在RSV感染，但感染率較低。采自東海市、建湖縣和阜寧縣的看麥娘中檢測出RSV，感染率分別為1.87%、1.00%和0.63%，采自淮安市楚州區(qū)的耿氏硬草RSV檢出率為2.50%，其余樣本均未檢出RSV（表2）。而同期田間小麥病株率調(diào)查結(jié)果（阜寧縣）顯示，發(fā)病田塊病株率為3.33%～16.40%，平均病株率為6.95%。這些結(jié)果說明RSV在自然條件下可由介體灰飛虱傳播侵染禾本科雜草，但雜草的感染率遠低于小麥的感染率，小麥是RSV侵染循環(huán)中重要的“橋梁”寄主。

2.3 病害不流行年份田間雜草RSV感染檢測結(jié)果

于病害不流行年份（2018—2019年）在江蘇多地稻田邊采集顯示出類似“花葉條紋”癥狀的稗草和狗尾草樣本。經(jīng)RT-PCR檢測，2對引物均可擴增出符合目的基因（NS2和NS3）預(yù)期大小的特異條帶（圖1），經(jīng)測序表明所擴增基因與目的序列一致，說明于姜堰、興化、泰興采集的稗草和句容、溧水采集的狗尾草樣本均出現(xiàn)RSV感染。由于樣本采集田塊附近的水稻植株未發(fā)生感病情況，這表明在病害不流行時期，禾本科雜草在病害侵染循環(huán)中的作用主要體現(xiàn)在維系RSV在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的存在。

3 討論

2003—2010年，水稻條紋葉枯病在江蘇地區(qū)暴發(fā)流行，給水稻生產(chǎn)造成嚴重威脅。在研究病害暴發(fā)流行規(guī)律時，筆者所在研究團隊發(fā)現(xiàn)稻麥輪作栽培方式是導(dǎo)致毒源積累和介體灰飛虱大發(fā)生的重要原因[15]。麥田是RSV和灰飛虱的主要越冬場所，小麥是RSV病害循環(huán)的重要中間寄主[18]，而田間禾本科雜草在病害侵染循環(huán)中的作用有待明確。本試驗采用室內(nèi)接種方法評價了江蘇地區(qū)主要禾本科雜草對RSV的感染率，并對病害大流行年份江蘇地區(qū)主要雜草種類的RSV田間感染率的調(diào)查工作進行了總結(jié)，同時對病害不流行年份田邊雜草的病毒感染情況進行了檢測。

室內(nèi)灰飛虱接毒試驗表明，看麥娘、升馬唐、狗尾草、稗、旱稗對RSV感染率較高，具有成為RSV潛在“橋梁”寄主的可能性。但在春季麥田中調(diào)查禾本科雜草的病毒感染率發(fā)現(xiàn)，僅有少量植株為RSV陽性，低于小麥的病株率，這說明小麥可能是RSV侵染循環(huán)中重要的“橋梁”寄主。甚至在特定條件（如早播或春后出苗后毒源得到補充，灰飛虱群體帶毒率提高）下，還會出現(xiàn)RSV嚴重危害小麥生長的現(xiàn)象[18-19]，進一步促進病害大流行。禾本科雜草對病害流行的貢獻度低于小麥，處于次要地位，可能原因如下：小麥作為麥田中的農(nóng)作物被集中種植，相對于野生禾本科雜草為優(yōu)勢種群，加之農(nóng)田除草措施進一步降低了雜草的數(shù)量;灰飛虱對小麥這類禾本科作物和禾本科雜草存在取食偏好性，小麥更滿足灰飛虱的營養(yǎng)要求，同等條件下灰飛虱傾向于選擇小麥作為寄主，只有小麥收割后灰飛虱才會被迫大量遷移到田邊的野生雜草上取食;小麥可以為灰飛虱提供穩(wěn)定的越冬場所，而很多禾本科雜草秋冬枯萎春季萌發(fā)，在早春無法及時為越冬帶灰飛虱提供營養(yǎng)。上述原因綜合作用導(dǎo)致灰飛虱傳播RSV侵染禾本科雜草的概率較小。此外，室內(nèi)接種鑒定發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)禾本科雜草被灰飛虱傳毒后，一般不容易出現(xiàn)花葉、褪綠等典型癥狀，這說明野生禾本科雜草對RSV抗性較高，這可能也是禾本科雜草田間感染率低的原因之一。

雜草在病害侵染循環(huán)中的作用主要體現(xiàn)在維系RSV在自然界中的存在。盡管RSV可以由灰飛虱經(jīng)卵傳播，但由于RSV對卵孵化的負效應(yīng)[8]，帶毒群體存在自然衰減，在抗病品種大面積種植的條件下，灰飛虱從水稻植株重新獲毒的概率大大降低，近年來江蘇多地田間灰飛虱帶毒率為0就是1個例證。但RSV并沒有消失，主要原因是雜草作為野生寄主，為RSV在農(nóng)田系統(tǒng)中存活提供了條件。本試驗于病害不流行的2018—2019年在多地稻田邊采集顯示“花葉條紋”癥狀的稗草和狗尾草樣本，經(jīng)分子檢測，確認為RSV感染，為上述觀點提供了直接證據(jù)。本試驗顯示，部分禾本科雜草在室內(nèi)條件下對RSV有較高感染率，說明這些雜草具備成為RSV“橋梁”寄主的潛力。江蘇地區(qū)稻田田埂及下茬麥田雜草群落結(jié)構(gòu)調(diào)查顯示，禾本科雜草占有絕對優(yōu)勢，其中就包括對RSV有較高感染率的看麥娘、稗、馬唐等[20-22]。野生禾本科雜草為RSV和灰飛虱的越冬和越夏2個重要環(huán)節(jié)提供了便利。在水稻條紋葉枯病的綜合防控中，麥田翻耕破壞介體越冬場所的技術(shù)被應(yīng)用，野生雜草可為其提供越冬場所。在水稻秧田期，防蟲網(wǎng)覆蓋隔離措施被廣泛應(yīng)用[2-24]，而此時小麥已完成收割，無法遷移到水稻秧田的灰飛虱將被迫遷移到田邊溝坎的雜草中生存。這種情況下，禾本科雜草則成為病害侵染循環(huán)中的重要一環(huán)，對RSV的流行存在非常重要，在防控不到位的情況下，可能還會引起條紋葉枯病的發(fā)生。因此，在條紋葉枯病的防控工作中，不應(yīng)忽視對雜草的管理。

參考文獻：

[1]周益軍. 水稻條紋葉枯病[M]. 南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010.

[2]周益軍，李 碩，程兆榜，等. 中國水稻條紋葉枯病的研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（5）：1007-1015.

[3]Otuka A. Migration of rice planthoppers and their vectored re-emerging and novel rice viruses in East Asia [J]. Frontiers in Microbiology，2013，4：309.

[4]Toriyama S. Rice stripe virus [J]. CMI/ABB Description of Plant Viruses，1983，269：15.

[5]Hibino H. Biology and epidemiology of rice viruses [J]. Annual Review of Phytopathology，1996，34：249-274.

[6]Huo Y，Liu W W，Zhang F J，et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector [J]. PLoS Pathogens，2014，10：e1003949.

[7]Deng J H，Li S，Hong J，et al. Investigation on subcellular localization of rice stripe virus in its vector small brown planthopper by electron microscopy [J]. Virology Journal，2013，10：310.

[8]Li S，Wang S J，Wang X，et al. Rice stripe virus affects the viability of its vector offspring by changing developmental gene expression in embryos [J]. Scientific Reports，2015，5：7883.

[9]張水英，譚冠林，任國敏，等. 2013—2014年云南主要稻區(qū)病毒病調(diào)查及RSV的分子變異[J]. 中國水稻科學(xué)，2015，29（5）：535-545.

[10]鄭桂賢. RSV四川分離物p3基因原核表達及其影響本氏煙內(nèi)源基因表達研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2018.

[11]Falk B W，Tsai J H. Biology and molecular biology of viruses in the genus tenuivirus [J]. Annual Review of Phytopathology，1997，36：139-163.

[12]Yao M，Zhang T Q，Zhou T，et al. Repetitive prime-and-realign mechanism converts short capped RNA leaders into longer ones that may be more suitable for elongation during rice stripe virus transcription initiation [J]. Journal of General Virology，2012，93：194-202.

[13]Sun F，Yuan X，Zhou T，et al. Arabidopsis is susceptible to rice stripe virus infections [J]. J Phytopathol，2011，159（11）：767-772.

[14]阮義理，金登迪，許如銀. 水稻條紋葉枯病毒的寄主植物[J]. 植物保護，1984，10（3）：22-23.

[15]程兆榜，何敦春，陳全站，等. 單季稻小麥輪作區(qū)灰飛虱發(fā)生規(guī)律[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2013，50（3）：706-717.

[16]劉海建，程兆榜，王 躍，等. 灰飛虱傳遞水稻條紋病毒研究初報[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23（5）：492-494.

[17]王貴珍，周益軍，陳正賢，等. 水稻條紋病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用[J]. 植物病理學(xué)報，2004，34（4）：302-306.

[18]程兆榜，鄧金花，任春梅，等. 江蘇小麥條紋病毒病的發(fā)生及其病原的RT-PCR分析[J]. 麥類作物學(xué)報，2007，27（6）：1138-1142.

[19]Xiong R Y，Cheng Z B，Wu J X，et al. First report of an outbreak of rice stripe virus on wheat in China [J]. Plant Pathol，2008，57：397.

[20]李淑順，張連舉，強 勝. 江蘇中部輕型栽培稻田雜草群落特征及草害綜合評價[J]. 中國水稻科學(xué)，2009，23（2）：207-214.

[21]左然玲. 稻麥輪作田雜草遷移動態(tài)規(guī)律研究及其調(diào)控技術(shù)[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[22]王開金，強 勝. 江蘇麥田雜草群落的數(shù)量分析[J]. 草業(yè)學(xué)報，2007，16（1）：118-126.

[23]李粉華，孫國俊，季 敏，等. 灰飛虱傳水稻病毒病綜合防控技術(shù)應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：137-139.

[24]徐小蘭，丁桂珍，胡蓮鳳，等. 水稻條紋葉枯病與黑條矮縮病綜合防控技術(shù)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012 （5）：195-196.

收稿日期：2020-09-13

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金 [編號：CX（20）3135]。

作者簡介：王藝曉（1996—），女，遼寧鐵嶺人，碩士研究生，主要從事植物病毒與昆蟲介體互作相關(guān)研究。E-mail：wyx19960105@126.com。

通信作者：李 碩，博士，副研究員，主要從事昆蟲介體傳播植物病毒機理及控制技術(shù)相關(guān)研究，E-mail：lishuo@jaas.ac.cn;周益軍，博士，研究員，主要從事植物病毒病害相關(guān)研究，E-mail：yjzhou@jaas.ac.cn。