衛(wèi)兵艷,尚小森,馮 濤,樊林花,軒瑞晶,劉茂林,陳小平*,劉田福#

(1山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001;2太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:cxp590223@163;#共同通訊作者,E-mail:13603518575@163.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是指冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生急性狹窄和閉塞,引起心肌細(xì)胞缺血缺氧及壞死,臨床上多伴有壓榨性胸痛[1]。近年來(lái),由于快節(jié)奏的生活壓力,AMI發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì),且年輕人發(fā)病的比例越來(lái)越高。AMI經(jīng)歷急性炎癥期(acute inflammatory period)、創(chuàng)面愈合期(wound healing period)、心室重構(gòu)期(ventricular reconstruction period)等病理過(guò)程將會(huì)出現(xiàn)大面積的心室壁缺氧及壞死,瘢痕形成,心室重構(gòu)[2]。雖然,干細(xì)胞(stem cells,SC)在治療AMI取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但對(duì)于動(dòng)脈狹窄及閉塞的效果尚欠佳,不能建立良好的側(cè)支循環(huán),這樣對(duì)于移植于梗死心肌區(qū)域的干細(xì)胞缺乏增殖和分化的血液營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境,嚴(yán)重影響了干細(xì)胞治療AMI的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[3]。血管新生能夠明顯改善AMI引起的心肌組織缺血缺氧情況,維持心室肌細(xì)胞的收縮及舒張功能,減慢甚至逆轉(zhuǎn)代償性的心室重構(gòu),有效減緩心力衰竭(cardiac failure)的發(fā)生[4]。血管新生是維持缺血心肌血液供應(yīng)的有效機(jī)制,建立側(cè)支循環(huán)、促進(jìn)血管新生已然成為保護(hù)缺血心肌的重要策略。

生長(zhǎng)分化因子-15(growth differentiation factor 15,GDF-15)作為T(mén)GF-β超家族中的一分子,對(duì)于缺血性心臟病有一定的保護(hù)作用[5]。GDF-15能夠修復(fù)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)損傷后的心肌,且相繼有臨床研究指出GDF-15能夠作為多種心源性疾病的診斷及預(yù)后指標(biāo),包括ST段抬高的AMI[6],慢性阻塞性肺疾病[7]以及慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)[8]等疾病。另外,體外和動(dòng)物模型研究證明,GDF-15具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等作用[9]。然而,目前已有的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果僅能證實(shí)GDF-15能夠改善血管閉塞引起的心肌缺血,且對(duì)代償性心肌肥厚具有逆轉(zhuǎn)作用。為了進(jìn)一步證實(shí)GDF-15對(duì)AMI血管新生及心功能的作用,本研究使用AMI小鼠模型,通過(guò)尾靜脈注射GDF-15 siRNA和GDF-15 cDNA慢病毒來(lái)研究GDF-15在AMI中對(duì)于心臟血管新生及改善心功能的作用,以期為治療AMI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量(22±2)g,購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(晉)2015-0001】,飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中【SYXK(晉)2015-0001】。實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào):IACUC2019-002)。

1.2 主要試劑與儀器

GDF-15 siRNA慢病毒(廣州復(fù)能基因有限公司,GC10312K1605,中國(guó)),GDF-15 cDNA慢病毒(廣州復(fù)能基因有限公司,GC10312K1606,中國(guó)),CD34抗體(Santa Cruz iotechnology,SC-133082,美國(guó)),Isoflurane(RWD,00105873,中國(guó)),Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,MST-8004,中國(guó)),GDF-15抗體(abcom,ab39999,美國(guó)),real-time PCR試劑盒(Promega,A6002,美國(guó)),GDF-15及β-actin引物由大連TaKaRa公司合成。

real-time PCR儀(QuantStudio 6 Flex,ABI,美國(guó)),酶標(biāo)儀(Epoch,BioTek,美國(guó)),顯微鏡(BX51,OLYMPUS,日本),小動(dòng)物超聲心動(dòng)儀(GE,VIVID7,美國(guó)),麻醉機(jī)(I-21025 Comerio,Ugo Basile S.R.L,意大利)。

1.3 AMI小鼠模型的制作及分組

氣管插管:2.5%異氟烷(isoflurane)面罩麻醉小鼠,使用22G留置針插入小鼠呼吸道,接呼吸機(jī)(吸/呼=1 ∶1.5,頻率80-100次/min,潮氣量1.2-1.5 ml),觀察小鼠的胸廓起伏和呼吸機(jī)頻率一致,證明插管成功。

手術(shù):小鼠左胸部脫毛,取右側(cè)臥位約35°體位,碘伏消毒切口,暴露肋骨,在3、4肋間放置撐開(kāi)器,暴露心臟,于左心耳下方約2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(8-0 proline線),肉眼可見(jiàn)左心室前壁等部位變白,心跳減弱,心電圖示ST-T抬高。最后,逐層縫合肌肉和皮膚[10]。撤掉呼吸機(jī),將小鼠置于37 ℃保溫毯上,待其蘇醒。

64只10周齡雄性C57BL/6J小鼠分成4組,分別是假手術(shù)組、模型組、GDF-15 siRNA組和GDF-15 cDNA組,每組16只。假手術(shù)組:除了不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈外,其余操作同模型組。GDF-15 siRNA組:造模前2 d尾靜脈注射100 μl滴度為106-107的GDF-15 siRNA慢病毒。GDF-15過(guò)表達(dá)組:造模前2日尾靜脈注射100 μl滴度為106-107的GDF-15 cDNA慢病毒。

1.4 小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)小鼠的心臟功能

術(shù)后第21天,2.5%異氟烷麻醉,用小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)小鼠心臟功能。測(cè)量如下指標(biāo):左心室舒張末期前壁厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、左心室收縮末期前壁厚度(left ventricular end-systolic anterior wall thickness,LVAWs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular dimensions at end-diastole,LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular dimensions at end-systole,LVEDs)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)、短軸縮短率(fractional shortening,FS),對(duì)心臟功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 心臟標(biāo)本采集

術(shù)后第21天,心臟超聲結(jié)束后,麻醉小鼠,開(kāi)胸取心臟組織。隨機(jī)選6只,生理鹽水灌洗心臟組織后,凍存于液氮中。另外10只5%異氟烷麻醉后,開(kāi)胸,剪開(kāi)右心耳,生理鹽水灌注,注射10 ml 10% KCl使之停搏在舒張期,待血液沖洗干凈,取下心臟組織甲醛灌注固定、脫水、石蠟包埋。制備5 μm切片,進(jìn)行HE染色、Masson三色染色及免疫組化染色。

1.6 real-time PCR檢測(cè)心肌組織GDF-15 mRNA的表達(dá)水平

四組小鼠均取梗死區(qū)同一部位左室前壁心肌約20 mg,提取RNA。GDF-15引物，F(xiàn):5′-AGTG AGTCCTTG T G T CTCTAC-3′;R:5′-GCAGGCTGGTGATGAGTC-3′,具體步驟參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.7 Western blot檢測(cè)心肌組織中GDF-15蛋白的表達(dá)

取小鼠心臟梗死區(qū)同一部位心肌約150 mg,組織勻漿,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA定量,煮蛋白使之變性,SDS-PAGE分離蛋白,濕轉(zhuǎn)蛋白條帶至PVDF膜上,再經(jīng)洗膜、封閉等過(guò)程,孵GDF-15抗體搖床過(guò)夜(4 ℃,80 r/min),孵二抗1 h,PBST洗膜3次。DAB顯影,Image J軟件分析WB條帶。

1.8 心肌梗死區(qū)毛細(xì)血管密度測(cè)定

CD34標(biāo)記血管進(jìn)行免疫組化染色,經(jīng)IMS圖像分析系統(tǒng)處理,熒光顯微鏡下(×400倍)隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算梗死區(qū)CD34陽(yáng)性染色的血管數(shù)目,取均數(shù)。

1.9 心肌梗死面積測(cè)定

心臟組織HE染色后,Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)進(jìn)行拍照,使用Image Pro Plus(IPP,6.0)軟件進(jìn)行分析,采用瘢痕計(jì)算法對(duì)梗死面積進(jìn)行計(jì)算:梗死百分比=(左心室梗死內(nèi)徑長(zhǎng)度+左心室梗死外徑長(zhǎng)度)/(左心室梗死內(nèi)徑周長(zhǎng)+左心室梗死外徑周長(zhǎng))×100%。

1.10 心肌纖維化的測(cè)量

心肌纖維化能反應(yīng)心室的順應(yīng)性,對(duì)心肌的收縮與舒張功能障礙有重要的評(píng)價(jià)功能。Masson染色法檢測(cè)心肌纖維化的程度。心肌石蠟切片,Masson染色后,Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)進(jìn)行拍照,IPP軟件進(jìn)行分析,測(cè)量整個(gè)圖片中纖維化面積,再對(duì)包括室間隔在內(nèi)的整個(gè)左心室面積進(jìn)行測(cè)量,計(jì)算膠原纖維含量(%)=纖維化面積/左室總面積×100%。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 超聲檢測(cè)各組小鼠心功能的結(jié)果

術(shù)后第21天,各組小鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)以評(píng)價(jià)其心功能。假手術(shù)組未結(jié)扎冠脈,沒(méi)有梗死發(fā)生,故心功能是正常的。與假手術(shù)組相比,模型組小鼠出現(xiàn)明顯的左室前壁振幅減弱,室腔膨大及室壁變薄,且左心室舒張末期前壁厚度(LVAWd)、收縮末期前壁厚度(LVAWs)、射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)均明顯下降,左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)和收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)均顯著增加。與模型組相比,GDF-15 siRNA組LVAWd、LVAWs、EF和ES均明顯下降,LVEDd和LVEDs均明顯增加,GDF-15 cDNA組LVAWd、LVAWs、EF和FS均有明顯的恢復(fù),明顯高于模型組,而LVEDd和LVEDs均明顯降低。所有結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與sham組比較，*P<0.05，**P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.001圖1 各組小鼠心功能檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Comparison of heart function of mice among four groups

2.2 小鼠心肌組織GDF-15 mRNA的檢測(cè)結(jié)果

模型組和假手術(shù)組比較，GDF-15的mRNA表達(dá)差異不明顯。與模型組比較,GDF-15 siRNA組GDF-15的mRNA表達(dá)明顯降低,是模型組的(0.32±0.12)倍,GDF-15 cDNA組則明顯升高是模型組的(3.41±0.23)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

2.3 各組小鼠心肌組織GDF-15蛋白的檢測(cè)結(jié)果

模型組和假手術(shù)組比較，GDF-15的蛋白表達(dá)差異不明顯。GDF-15 siRNA組GDF-15蛋白表達(dá)明顯降低,是模型組的(0.41±0.21)倍,GDF-15 cDNA組則明顯升高,是模型組的(4.16±0.19)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖3)。

2.4 小鼠梗死區(qū)毛細(xì)血管密度的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)心肌組織的血管新生情況,結(jié)果顯示:與模型組(285±18)相比,GDF-15 siRNA組(170±13)梗死區(qū)的毛細(xì)血管數(shù)量明顯減少,GDF-15 cDNA組(347±30)則促進(jìn)毛細(xì)血管的增生,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖4)。

圖4 各組小鼠心臟組織梗死區(qū)毛細(xì)血管密度Figure 4 Capillary density in infarcted area of heart tissue of mice in each group

2.5 小鼠心肌梗死面積的測(cè)定結(jié)果

術(shù)后第21天,四組小鼠心臟的HE染色代表性結(jié)果顯示:假手術(shù)組因未結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,沒(méi)有梗死發(fā)生。模型組可見(jiàn)明顯的左室梗死、心壁變薄和室腔變大;GDF-15 siRNA組小鼠較模型組,梗死面積變大、心壁變更薄、室腔更大;GDF-15 cDNA組則梗死程度受到抑制,梗死面積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01,見(jiàn)圖5)。

圖5 各組小鼠心臟組織的梗死情況Figure 5 Myocardial infarction of mice in each group

2.6 小鼠心臟組織膠原纖維含量的檢測(cè)結(jié)果

Masson結(jié)果顯示:AMI小鼠的心腔擴(kuò)大,室壁變薄伴有膠原纖維的沉積。膠原纖維含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:模型組膠原纖維含量與假手術(shù)組比較,代償性增加(P<0.05);與模型組比較,GDF-15 siRNA組抑制GDF-15的表達(dá)后,膠原纖維明顯增多,GDF-15 cDNA組GDF-15過(guò)表達(dá)后,使膠原纖維受到明顯抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖6)。

圖6 各組小鼠心臟組織梗死區(qū)膠原纖維含量Figure 6 Collagen content in infarcted areas of mice in each group

3 討論

AMI發(fā)生時(shí)心臟組織急性缺血,大量心肌細(xì)胞壞死凋亡,與此同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞也大量壞死凋亡,造成血管損傷且不能及時(shí)修復(fù),使心臟組織缺血進(jìn)行性加重。另外,AMI出現(xiàn)心臟組織大面積梗死和壞死后,心室重構(gòu)時(shí)瘢痕組織增生,使心臟的收縮和舒張功能受限[12]。加之,干細(xì)胞在AMI治療中因沒(méi)有良好的血供,使得干細(xì)胞得不到增殖和分化的肥沃土壤微環(huán)境,成為干細(xì)胞治療的一大發(fā)展瓶頸。因此,恢復(fù)AMI患者心臟的血液供應(yīng)具有非常重要的意義。血管新生能夠明顯恢復(fù)心肌梗死區(qū)域的血液供應(yīng),有了豐富血供就能改善心肌細(xì)胞的缺血和缺氧癥狀,提高AMI患者的轉(zhuǎn)歸。

有研究發(fā)現(xiàn),GDF-15能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),同時(shí)GDF-15能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等[13]。GDF-15的表達(dá)對(duì)于改善心肌缺血、心室重構(gòu)以及心力衰竭的預(yù)后具有正向作用,于飛等[14]前期的臨床試驗(yàn)也表明GDF-15濃度與冠脈側(cè)枝形成呈正相關(guān)。尚小森等[15]的前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)GDF-15能夠促進(jìn)心肌內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)增殖及成管,說(shuō)明GDF-15有血管新生的作用。為了進(jìn)一步研究GDF-15在AMI側(cè)支循環(huán)形成及心功能改善方面的作用,通過(guò)建立AMI動(dòng)物模型進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)研究。

本研究結(jié)果顯示,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后,通過(guò)HE與Masson染色可見(jiàn)AMI小鼠左室心壁變薄、心腔增大、且伴有膠原纖維沉積等,證明模型制作成功。對(duì)AMI小鼠的GDF-15進(jìn)行沉默時(shí),代表心室收縮功能的指標(biāo)，心室舒張末期前壁厚度(LVAWd)、收縮末期前壁厚度(LVAWs)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)進(jìn)一步降低,而代表心室功能減弱的指標(biāo)，左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)和收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)則增加。當(dāng)GDF-15過(guò)表達(dá)時(shí),心功能的相應(yīng)指標(biāo)到得明顯的恢復(fù),說(shuō)明GDF-15能夠改善心臟功能。另外,GDF-15 siRNA組小鼠出現(xiàn)缺血區(qū)毛細(xì)血管再生受到抑制,心肌缺血程度加重,導(dǎo)致心肌梗死程度進(jìn)一步擴(kuò)大,膠原纖維增多,加速了心室重構(gòu)的發(fā)生,這樣就導(dǎo)致心臟功能進(jìn)一步惡化。GDF-15過(guò)表達(dá)時(shí)能促進(jìn)缺血區(qū)的毛細(xì)血管的增加,明顯縮小梗死面積,對(duì)膠原纖維的沉積有抑制作用,緩解了心室重構(gòu),能有效緩解心室腔的擴(kuò)張。以上結(jié)果說(shuō)明,GDF-15能夠使心臟梗死區(qū)域血管化程度增加,改善心功能。推測(cè)可能是GDF-15抑制了血管內(nèi)皮的凋亡，且能夠釋放一些促血管生成因子使血管內(nèi)皮增生,進(jìn)而豐富缺血區(qū)血管化,這樣有利于缺血區(qū)內(nèi)環(huán)境得到改善、為心室重構(gòu)提供較為豐富的血液供應(yīng),對(duì)于重建功能、縮小梗死范圍和改善心功能等具有非常重要的意義。然而,對(duì)于GDF-15在促進(jìn)血管新生方面的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究來(lái)加以證明。

綜上所述,GDF-15可顯著增加梗死區(qū)內(nèi)的血管密度、減小梗死面積并抑制膠原沉積,有效改善心功能。