石紫云,張 雅,趙 靜,劉飛飛,袁曉華
(1陜西省人民醫(yī)院產(chǎn)科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院檢驗科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:PurClShi@163.com)
妊娠高血壓(pregnancy-induced hypertension,PIH)簡稱妊高征,是一種妊娠孕婦特有的一種常見疾病[1,2]。妊娠高血壓可嚴重影響孕婦和胎兒的生命健康,對孕婦及胎兒的腎臟、心臟和大腦等多種器官均可造成損傷,嚴重時可造成孕婦和胎兒死亡。因此,妊娠高血壓的早期診斷具有重要意義。
過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是核激素受體超家族的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ三種亞型[3]。多項研究報道PPAR-γ在高血壓等心血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PPAR-γ是一種核激素受體,可對血管結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響,PPAR-γ主要通過其配體(包括噻唑烷二酮類)激活[4]。PPAR-γ活化后可通過激活下游靶標參與調(diào)節(jié)脂肪酸儲存和葡萄糖代謝。據(jù)報道,敲除PPAR-γ可抑制高脂肪飲食小鼠模型脂肪組織的生成[5]。并且,PPAR-γ也參與妊娠期母體代謝和胎盤發(fā)育。
內(nèi)皮素(endothelins,ET)是一種調(diào)節(jié)血管收縮和升高血壓的內(nèi)皮來源的收縮因子。內(nèi)皮素是一種有效的血管收縮劑,內(nèi)皮素的過度表達可誘發(fā)高血壓、心臟病等多種疾病,并且其在妊娠期間具有重要作用[6]。內(nèi)皮素-1(ET-1)是由平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的一種參與血管功能調(diào)節(jié)的重要血管活性肽之一,包括改變血管直徑、改變血流和控制基底動脈張力等[7]。內(nèi)皮素受體(endothelin receptors,ETR)可在血管等許多組織中表達,主要包括ETAR和ETBR兩種受體[8]。據(jù)報道,PPAR-γ可抑制ET-1信號并調(diào)節(jié)血壓和內(nèi)皮功能[9]。然而,目前尚不清楚PPAR-γ在妊娠高血壓發(fā)病過程中對ETR表達和血管收縮的影響。因此,本研究探討了PPAR-γ在妊娠高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用,以期為妊娠高血壓的診治提供理論參考。
從南京醫(yī)科大學實驗動物中心購買60只SD雌性大鼠和30只SD雄性大鼠,大鼠體質(zhì)量為206-229 g。將雌性大鼠隨機分為對照組、模型組、羅格列酮組、波生坦組,每組15只大鼠。按照雌性和雄性2 ∶1的比例將大鼠飼養(yǎng)在籠中進行交配,次日清晨收集大鼠陰道分泌物并進行顯微鏡檢查,以發(fā)現(xiàn)精子為妊娠0天。
對妊娠大鼠進行尾靜脈注射內(nèi)毒素建立妊娠高血壓大鼠模型,內(nèi)毒素購自美國Sigma公司。將內(nèi)毒素用生理鹽水稀釋至濃度為1 μg/ml,模型組、羅格列酮組和波生坦組大鼠妊娠第15天后開始注射2.0 μg內(nèi)毒素,分別在0,1,6,24,72 h注射。對照組大鼠注射相同體積的生理鹽水。在羅格列酮組大鼠妊娠15 d后,每天按照2 mg/kg的劑量對大鼠灌胃PPAR-γ激活劑羅格列酮(成都恒瑞制藥有限公司,國藥準字:H20030569)。波生坦組大鼠每天以50 mg/kg劑量灌胃內(nèi)皮素受體阻斷劑波生坦(Actelion Pharmaceuticals Ltd.,批準文號:H20110291)。模型組大鼠從妊娠第15天到實驗結(jié)束每天用10 ml/kg蒸餾水灌胃。從妊娠第12天開始,每3 d通過無創(chuàng)性尾動脈壓測量儀測量各組大鼠的尾動脈收縮壓(SBP),共檢測到妊娠第21天。
妊娠第12天開始,每隔3 d通過注射針收集大鼠的頸動脈外周血2 ml,4 000 r/min離心10 min分離血清。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海雙贏生物科技有限公司)檢測各組大鼠的血小板水平。此外,分別將各組大鼠放入標準代謝籠中收集尿液,用鄰苯三酚紅鉬比色法檢測尿蛋白(南京森貝伽生物科技有限公司)。
大鼠妊娠21 d后,頸椎脫臼處死大鼠,對腹部皮膚剃毛消毒,用鑷子提起腹部皮膚,用組織剪先剪開一個小口并分離皮下組織、筋膜,剪開皮膚,進入大鼠子宮,剖開孕鼠子宮,取出胎盤并用10%甲醛固定,石蠟包埋制作4 μm切片,然后將切片分別用100%二甲苯Ⅰ和100%二甲苯Ⅱ洗滌10 min,梯度乙醇分別洗滌5 min,蒸餾水洗滌3 min。然后將切片用蘇木精染色10 min,可見細胞核被染為藍紫色。伊紅染色6 min,蒸餾水洗滌,并進行顯色。切片用梯度乙醇洗滌5 min,100%二甲苯Ⅰ和Ⅱ洗滌10 min。中性樹膠封片,并在光學顯微鏡下觀察拍照。
切片脫蠟后用1%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗滌并用正常血清封閉。將ET-1一抗(1 ∶1 000,美國Abcam公司)與切片在4 ℃過夜孵育,然后用PBS洗滌。向切片中加入生物素化的山羊抗兔二抗(1 ∶1 000,美國Abcam公司)室溫孵育1 h,然后再次用PBS洗滌。然后DAB顯色,蘇木精復染,脫水、透明和封閉處理后在顯微鏡下觀察切片。PBS代替ET-1一抗作為陰性對照。隨機選擇5個視野(×200)在光學顯微鏡下觀察切片并計數(shù)陽性細胞。染色強度評分如下:無染色,0分;輕度染色,1分;中度染色,2分;重度染色,3分;0-1分為陰性表達(-);1-2分為弱陽性表達(+);3-4分為中等陽性表達(++);5-6分為強陽性表達(+++)。陽性率為陽性表達(+、++和+++)例數(shù)占總數(shù)的百分比。
大鼠妊娠21 d后,頸椎脫臼處死大鼠,對腹部皮膚剃毛消毒,用鑷子提起腹部皮膚,用組織剪先剪開一個小口并分離皮下組織、筋膜,剪開皮膚,進入大鼠子宮,剖開孕鼠子宮,取出胎盤。應用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取大鼠胎盤組織中的總RNA。采用Synergy Brands(SYBR)Premix Ex TaqTM試劑盒(日本Takara公司)在Applied Biosystems 7300實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)上進行RT-qPCR。PPAR-γ、ETAR和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物序列見表1。反應條件如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環(huán),72 ℃延伸5 min。GAPDH作為內(nèi)參基因。2-ΔΔCt法用于計算基因的相對表達量。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物上游 下游 PPAR-γ5′-GTCAAAGAGCGATCAGCCAACGTCG-3′5′-CGGCCATGAAGCCAATCC-3′ETAR5′-AGCGTCAGGAGCGAGTCATG-3′5′-GGCTGTTGCGTTCTGCTGTCCTCG-3′GAPDH5′-TGAAACCTCGGGTCGTGCCT-3′5′-ACAGTGCGCCACGCTAAGTAG-3′
大鼠妊娠21 d后,頸椎脫臼處死大鼠,對腹部皮膚剃毛消毒,用鑷子提起腹部皮膚,用組織剪先剪開一個小口并分離皮下組織、筋膜,剪開皮膚,進入大鼠子宮,剖開孕鼠子宮,取出胎盤。使用總蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取胎盤組織中的蛋白質(zhì),使用BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)測量蛋白質(zhì)濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜在室溫下用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。然后將膜分別與一抗PPAR-γ(1 ∶2 000,Abcam)(1 ∶2 000)、ETAR(1 ∶2 000,Cell Signaling Technologies)和GAPDH(1 ∶1 000,Abcam)在4 ℃過夜孵育。使用Tris緩沖鹽水和吐溫(TBST)沖洗3次。然后與二抗在室溫下孵育1 h,并將膜洗滌3次。采用ECL化學發(fā)光試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)進行顯影,GAPDH作為內(nèi)參,應用Image J軟件分析條帶灰度值,用目的蛋白和GAPDH的平均灰度值的比值來反映蛋白的相對表達量。
SPSS 18.0軟件用于分析數(shù)據(jù)。計數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗和單因素方差分析進行組間比較。計數(shù)數(shù)據(jù)表示為頻數(shù)和百分比,使用非參數(shù)秩和檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果顯示,從妊娠第12天開始,隨著孕齡的增加,模型組大鼠的收縮壓和尿蛋白逐漸升高,而血小板計數(shù)逐漸降低(P<0.05)。羅格列酮組和波生坦組的收縮壓、血小板計數(shù)和尿蛋白在不同孕齡均與對照組無顯著差異(P>0.05,見表2)。
對照組大鼠胎盤組織正常,未見明顯病理改變。模型組大鼠胎盤組織中炎性細胞浸潤明顯、毛細血管充血、空泡化細胞增多。然而,波生坦組和羅格列酮組大鼠的病理改變明顯減輕,血管充血和炎性細胞浸潤明顯減少(見圖1)。
免疫組化染色結(jié)果顯示,ET-1主要在血管內(nèi)皮細胞和絨毛合體滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)和細胞膜中表達。與對照組相比,羅格列酮組和波生坦組胎盤染色位置無顯著差異。對照組、羅格列酮組和波生坦組胎盤組織的ET-1主要為陰性或低表達,而在模型組中主要為陽性表達。對照組、羅格列酮組和波生坦組中ET-1的陽性率顯著低于模型組(P<0.05,見圖2和表3)。
表2 各組大鼠的收縮壓、血小板濃度和尿蛋白含量
Table 2 Systolic blood pressure, platelet concentration and urinary protein content of rats in each group
指標 分組 妊娠12d 妊娠15d 妊娠18d 妊娠21d 收縮壓(mmHg)對照組103.22±4.53103.26±5.27109.42±7.26109.13±6.36模型組104.23±4.64124.27±9.22?a133.75±8.53?b142.32±11.25?c羅格列酮組105.17±5.12110.36±7.54#111.64±5.37#112.29±5.37#波生坦組104.92±5.26108.33±6.51#109.65±5.25#113.32±7.44# 血小板濃度(×109/L)對照組841.24±53.22834.36±65.32837.43±56.35841.27±63.73模型組844.86±46.26588.37±74.28?a523.85±58.62?b421.25±54.32?c羅格列酮組840.19±62.90837.36±65.96#841.75±56.32#846.53±61.36#波生坦組841.94±58.20838.32±57.93#843.74±61.38#844.15±61.06# 尿蛋白含量(g/L)對照組 0.22±0.05 0.21±0.03 0.21±0.03 0.23±0.05模型組 0.20±0.02 0.57±0.06?a 0.82±0.13?b 1.37±0.11?c羅格列酮組 0.21±0.05 0.24±0.04# 0.26±0.05# 0.24±0.04#波生坦組 0.21±0.04 0.23±0.03# 0.24±0.03# 0.21±0.05#
與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與妊娠12 d比較,aP<0.05;與妊娠15 d比較,bP<0.05;與妊娠18 d比較,cP<0.05
圖1 各實驗組大鼠胎盤組織的HE染色Figure 1 HE staining of rat placenta tissues in each group
圖2 各組大鼠胎盤組織中ET-1的免疫組化染色Figure 2 Immunohistochemical staining of ET-1 in rat placenta tissues in each group
表3 各組大鼠胎盤組織中ET-1的陽性表達(例)
Table 3 ET-1 expression in rat placenta tissues in each group(cases)
分組陰性(-)弱陽性(+)中等陽性(++)強陽性(+++)陽性率對照組 1320013.33%模型組 325580.00%?羅格列酮組1131026.67%#波生坦組 1221020.00%#
與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,大鼠妊娠21 d后,與對照組相比,模型組和波生坦組的PPAR-γ mRNA和蛋白表達水平顯著降低,而羅格列酮組與對照組PPAR-γ mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。
與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖3 各組大鼠妊娠21 d后的PPAR-γ mRNA和蛋白表達Figure 3 PPAR-γ mRNA and protein expression at 21 d of gestation in rats of each group
RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,大鼠妊娠21 d后,與對照組相比,模型組的ETAR mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。而羅格列酮組和波生坦組與對照組的ETAR mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4)。
與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖4 各組大鼠妊娠21天后的ETAR mRNA和蛋白表達Figure 4 ETAR mRNA and protein expression at 21 d of gestation in rats of each group
妊娠高血壓的發(fā)病率約為總孕婦例數(shù)的5%-8%,是一種對孕婦和胎兒妊娠結(jié)局具有重要影響的常見妊娠孕婦特有疾病。研究發(fā)現(xiàn),過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)和內(nèi)皮素(ET)及其受體(ETR)的異常表達與妊娠高血壓的發(fā)病機制密切相關(guān)[10-12]。本研究探討了PPAR-γ、ET和ETR在內(nèi)毒素誘導的妊娠高血壓SD大鼠模型中的表達及其與疾病進展的關(guān)系。
多項研究均證實,妊娠高血壓患者在妊娠過程中會出現(xiàn)收縮壓或舒張壓升高,并伴隨血小板計數(shù)降低,嚴重時還會出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能障礙。此外,妊娠高血壓發(fā)病過程中會導致蛋白尿的出現(xiàn),從而發(fā)展為子癇前期。為此,本研究通過對妊娠大鼠進行尾靜脈注射內(nèi)毒素建立妊娠高血壓大鼠模型,從而研究妊娠高血壓的發(fā)病過程及藥物治療機制。本研究顯示,從妊娠第12天開始,隨著孕齡的增加,模型組大鼠的收縮壓和尿蛋白逐漸升高,而血小板計數(shù)逐漸降低(P<0.05)。此外,本研究通過HE染色評價各組大鼠的胎盤組織病理改變,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胎盤組織中炎性細胞浸潤明顯、毛細血管充血、囊泡結(jié)構(gòu)增多。表明本研究建模成功。
內(nèi)皮素-1(ET-1)是一種由平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的血管收縮劑,參與血管功能調(diào)節(jié),包括改變血管直徑、改變血流和控制基底動脈張力等[7]。內(nèi)皮素的過度表達可誘發(fā)高血壓、心臟病等多種疾病,并且其在妊娠期間具有重要作用[6]。內(nèi)皮素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,內(nèi)皮素受體被激活后可導致細胞內(nèi)鈣離子的向內(nèi)流動,促進平滑肌細胞收縮,從而促進血壓升高。內(nèi)皮素受體可分為兩種亞型,ETAR和ETBR。ETAR和ETBR兩種受體生物學效應存在很大差異。ETAR位于血管平滑肌細胞上,主要參與介導血管收縮和細胞增殖;ETBR位于血管內(nèi)皮上,主要介導血管的舒張功能。內(nèi)皮素與內(nèi)皮素受體(ETR)結(jié)合可激活其下游效應因子,從而調(diào)節(jié)心血管變化[13]。ETBR可與抑制性G蛋白偶聯(lián),抑制內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶基因表達,釋放前列環(huán)素、一氧化氮等舒張因子,同時ETBR還促進內(nèi)皮細胞重吸收和清除ET-1。其他研究已經(jīng)證實,ETBR基因敲除可加重小鼠肺動脈高壓程度[14]。因此,激活ETBR能抑制肺動脈高壓形成,由于ETAR和ETBR發(fā)揮不同的生物學效應,因此本文中未涉及ETBR的研究。本研究免疫組化染色顯示,ET-1主要在血管內(nèi)皮細胞和絨毛合體滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)和膜中表達,并且妊娠高血壓模型組大鼠胎盤組織的ET-1主要為陽性表達。另外,RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示模型組ETAR表達明顯上調(diào)。妊娠高血壓大鼠模型胎盤組織中ET-1和ETAR的表達均顯著上調(diào),說明ET-1/ETAR信號通路在妊娠高血壓發(fā)病過程中被異常激活。
過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是核激素受體超家族的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,PPAR-γ可對血管產(chǎn)生重要影響,其在高血壓等心血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PPAR-γ主要通過其配體(包括噻唑烷二酮類)激活[4]。敲除PPAR-γ可抑制高脂肪飲食小鼠模型脂肪組織的生成[5]。并且,PPAR-γ也參與妊娠期母體代謝和胎盤發(fā)育。本研究中RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,大鼠妊娠21 d后,妊娠高血壓大鼠模型胎盤組織中的PPAR-γ表達水平顯著降低,上述結(jié)果說明,PPAR-γ的表達在妊娠高血壓胎盤中被抑制。
羅格列酮是一種噻唑烷二酮類的抗糖尿病藥,羅格列酮可與脂肪細胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)結(jié)合來作為胰島素敏化劑,從而增加靶細胞對胰島素的敏感性。文獻報道,羅格列酮是一種PPAR-γ激活劑,羅格列酮通過調(diào)節(jié)PPAR-γ的表達來治療高血壓相關(guān)疾病[15]。此外,羅格列酮可以通過提高胰島素敏感性來改善血糖控制[16]。波生坦是一種內(nèi)皮素受體拮抗劑,多項臨床研究均顯示波生坦可有效治療肺動脈高壓。通常情況下,內(nèi)皮素受體與內(nèi)皮素-1結(jié)合可引起肺血管收縮。而波生坦能夠有效抑制內(nèi)皮素-1與內(nèi)皮素受體的結(jié)合,從而有效降低肺血管阻力,從而降低血壓[17]。還有研究報道,波生坦可用于治療兒童肺動脈高壓,并且療效顯著[18]。本研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮組和波生坦組的收縮壓、血小板計數(shù)和尿蛋白在不同孕齡均與對照組無顯著差異(P>0.05)。此外,波生坦組和羅格列酮組大鼠的胎盤組織病理改變明顯減輕,血管充血和炎性細胞浸潤明顯減少。說明羅格列酮和波生坦對妊娠高血壓大鼠具有較好的保護作用。
據(jù)報道,PPAR-γ可抑制ET-1信號并調(diào)節(jié)血壓和內(nèi)皮功能[9]。本研究中,通過應用PPAR-γ激活劑羅格列酮治療后,妊娠高血壓大鼠胎盤組織中PPAR-γ明顯上調(diào),達到與對照組相當?shù)乃?而ET-1和ETAR明顯下調(diào),說明了PPAR-γ可抑制ET-1/ETAR信號通路的活化,進而減緩疾病進程。另外,大鼠應用內(nèi)皮素受體阻斷劑波生坦治療后,妊娠高血壓大鼠胎盤組織中PPAR-γ的表達水平與未經(jīng)治療的模型組無顯著差異,然而ET-1和ETAR明顯下調(diào),波生坦的治療達到了與羅格列酮相似的效果,因此,間接證實了激活PPAR-γ通過抑制ET-1/ETAR信號通路來發(fā)揮治療作用。
總之,在妊娠高血壓大鼠模型胎盤組織中,PPAR-γ表達下調(diào),而ET-1和ETAR上調(diào)。激活PPAR-γ可通過抑制ET-1/ETAR信號通路來降低血管收縮作用,從而抑制妊娠高血壓的疾病進展。