郭林芝,王曉暉,岳 丹,杜圣家,李靈敏*

(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:13835125305@163.com)

脂肪組織是機(jī)體重要的能量倉(cāng)庫(kù),其廣泛存在于全身的皮下及內(nèi)臟各處。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),脂肪組織包括白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)。近年來(lái),人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)脂肪組織的研究,如研究白色脂肪棕色化的機(jī)制、探究降糖藥物使體重減輕的原理等[1,2],許多研究都需要以良好的脂肪組織石蠟切片為基礎(chǔ)。無(wú)論是白色脂肪還是棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)都含有脂滴,而脂滴的主要成分為三酰甘油酯,由于其成分的特殊性,采用常規(guī)組織的脫水流程恐難達(dá)到良好的制片效果。為了制出滿意的脂肪組織石蠟切片,本實(shí)驗(yàn)用兩種脫水流程比較白色脂肪組織和棕色脂肪組織石蠟切片制作效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性BALB/c小鼠8只,清潔級(jí),體質(zhì)量22-25 g,購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(晉)2015-0001]。

1.2 主要試劑及儀器

蘇木素染液、伊紅染液購(gòu)自珠海貝索公司;飽和油紅O染色液購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;Rabbit Anti-GLP-1R antibody購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;山羊抗兔IgG/HRP聚合物,購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Leica TP1020自動(dòng)脫水機(jī);Leica RM2245型半自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式切片機(jī);Leica CM1950冰凍切片機(jī)。

1.3 脂肪組織采集及處理流程

頸椎脫臼法處死小鼠6只,每只鼠分別取雙側(cè)睪丸脂肪墊的白色脂肪組織標(biāo)本2塊和雙側(cè)肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織標(biāo)本2塊,大小為(0.5-1.5)cm×(0.5-1.5)cm×(0.2-0.3)cm,將每只鼠的兩種脂肪組織均隨機(jī)等分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。所有標(biāo)本均用10%的中性甲醛浸泡固定24 h。其中,對(duì)照組標(biāo)本采用常規(guī)組織脫水程序進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本采用延長(zhǎng)脫水程序進(jìn)行(見(jiàn)表1)。后續(xù)透明及浸蠟過(guò)程兩組均按常規(guī)時(shí)間進(jìn)行。處理后的脂肪組織標(biāo)本用Leica石蠟包埋機(jī)包埋。

表1 組織脫水程序比較

Table 1 Comparison of tissue dehydration procedures

組別70%乙醇80%乙醇90%乙醇95%乙醇95%乙醇Ⅱ100%乙醇100%乙醇Ⅱ?qū)φ战M2h2h1h1h1h30min30min實(shí)驗(yàn)組4h3h2h2h2h1h1h

1.4 切片、展片及烤片

制作好的石蠟塊用Leica RM2245型半自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度4 μm。在水溫42 ℃進(jìn)行展片，60 ℃烤片30 min-1 h。

1.5 HE染色及免疫組化染色

脂肪組織HE染色按常規(guī)組織HE染色流程進(jìn)行。免疫組化:切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育10 min,枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)高壓修復(fù)2 min,晾至室溫,10%BSA室溫封閉20 min,滴加GLP-1R抗體(1 ∶200),4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加二抗37 ℃ 40 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片,陽(yáng)性表達(dá)部位在細(xì)胞膜。

1.6 兩種脂肪組織油紅O染色

頸椎脫臼法處死2只實(shí)驗(yàn)小鼠,取兩種脂肪組織按照文獻(xiàn)置于10%中性甲醛內(nèi)固定24 h,擦干水分后凍于-80 ℃冰箱30 min,OCT包埋后置冰凍切片機(jī)切片,厚度為10 μm[3]。油紅O染色:冰凍切片蒸餾水洗滌;60%異丙醇浸洗;油紅O染色10 min;60%異丙醇分化至間質(zhì)清楚;蘇木素復(fù)染;甘油明膠封片。

2 結(jié)果

2.1 白色脂肪組織的兩種脫水流程HE染色結(jié)果

延長(zhǎng)程序組脂肪組織經(jīng)HE染色,鏡下觀,脂肪組織無(wú)裂縫,細(xì)胞排列緊密,形態(tài)飽滿,呈多邊形空泡狀,胞核呈扁平,清晰可見(jiàn),胞膜無(wú)明顯斷裂、松散(見(jiàn)圖1A、B)。

常規(guī)程序組脂肪組織HE染色,鏡下可見(jiàn)脂肪組織形態(tài)基本完整,局部可見(jiàn)裂縫,細(xì)胞排列緊密,但形態(tài)欠飽滿,胞核扁圓形,清晰可見(jiàn),部分細(xì)胞膜有斷裂,松散(見(jiàn)圖1C、D)。

A.延長(zhǎng)程序(×100);B.延長(zhǎng)程序(×400);C.常規(guī)程序(×100);D.常規(guī)程序(×400)圖1 白色脂肪組織HE染色Figure 1 HE staining of white adipose tissue

2.2 棕色脂肪組織的兩種脫水流程HE染色結(jié)果

兩種程序處理的棕色脂肪組織經(jīng)HE染色,鏡下可見(jiàn)脂肪組織形態(tài)完整、無(wú)裂縫,細(xì)胞排列緊密,脂肪細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)許多小空泡,細(xì)胞周圍血管清晰可辨,兩種程序HE染色無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖2)。

A.延長(zhǎng)程序(×100);B.延長(zhǎng)程序(×400);C.常規(guī)程序(×100);D.常規(guī)程序(×400)圖2 棕色脂肪組織HE染色Figure 2 HE staining of brown adipose tissue

2.3 兩種脂肪組織石蠟切片免疫組化染色

在石蠟切片HE染色的基礎(chǔ)上,我們分別選取白色脂肪組織延長(zhǎng)程序和棕色脂肪組織常規(guī)程序進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示,兩種脂肪組織在免疫組化染色過(guò)程中均未見(jiàn)明顯脫片,鏡下可見(jiàn)白色脂肪組織(見(jiàn)圖3A)和棕色脂肪組織(見(jiàn)圖3B)結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)飽滿,胞膜完整,陽(yáng)性表達(dá)明顯,背景清晰。

A.白色脂肪(×400) B.棕色脂肪(×400)圖3 脂肪組織GLP-1免疫組化染色Figure 3 GLP-1 immunohistochemical staining of adipose tissue

2.4 兩種脂肪組織冰凍切片油紅O染色

兩種脂肪組織油紅O染色結(jié)果顯示,白色脂肪組織細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較大的單個(gè)紅染的脂滴(見(jiàn)圖4A),而棕色脂肪組織細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)大小不等的紅染脂滴(見(jiàn)圖4B)。

3 討論

脂肪組織主要由不同性質(zhì)的脂肪細(xì)胞組成,按照脂肪細(xì)胞的種類及功能的不同,將其分為白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)[4]。WAT的功能主要是將機(jī)體中過(guò)剩的能量以中性脂肪的形式貯存,以供機(jī)體需求時(shí)利用[5]。此外,WAT還可作為熱絕緣體,有助于維持體溫平衡[6]。BAT由于血管豐富呈棕色,主要維持機(jī)體體溫和調(diào)控能量平衡[7]。兩種脂肪細(xì)胞功能的不同主要源于其細(xì)胞組成不同。白色脂肪細(xì)胞內(nèi)含有一個(gè)較大的脂滴,幾乎占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞(見(jiàn)圖4A),線粒體含量卻很少;而棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)雖然也含有脂滴,但是脂滴較小(見(jiàn)圖4B),且多嵴線粒體和胞質(zhì)含量豐富[8]。雖然都是脂肪組織,但由于兩種脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異,導(dǎo)致組織處理的脫水流程也會(huì)有差異。

A.白色脂肪(×400) B.棕色脂肪(×400)圖4 脂肪組織油紅O染色Figure 4 Oil red O staining of adipose tissue

白色脂肪的脂滴大且含量多,若按照常規(guī)脫水流程進(jìn)行,會(huì)出現(xiàn)脫水、脫脂不徹底,石蠟不能完全進(jìn)入到組織細(xì)胞內(nèi)起到支撐作用,組織便會(huì)塌陷,難以切出完整切片。乙醇是實(shí)驗(yàn)室常用的脫水、脫脂試劑,乙醇分子中的極性基團(tuán)羥基(-OH)可以與組織細(xì)胞內(nèi)的水形成氫鍵將水置換出來(lái)從而起到脫水作用;而乙醇又可以與脂滴中的三酰甘油酯發(fā)生醇解反應(yīng)從而起到脫脂作用。所以,必須延長(zhǎng)白色脂肪在乙醇脫水、脫脂的時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),延長(zhǎng)程序處理的白色脂肪,HE染色脂肪組織結(jié)構(gòu)完整無(wú)裂縫,脂肪細(xì)胞形態(tài)飽滿,細(xì)胞膜無(wú)明顯斷裂,免疫組化陽(yáng)性結(jié)果明顯,背景清晰,結(jié)果明顯優(yōu)于常規(guī)程序。相對(duì)于白色脂肪,棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴小而少,且細(xì)胞表面遍布神經(jīng)及血管[9],對(duì)細(xì)胞起到了良好的支撐作用。所以,按照常規(guī)組織的脫水流程就可以完成脫水、脫脂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無(wú)論是常規(guī)組織流程還是延長(zhǎng)流程制作的石蠟切片,HE染色均可見(jiàn)棕色脂肪結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞飽滿,周圍血管清晰,免疫組化陽(yáng)性結(jié)果明顯,背景清晰。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于做油紅O染色的小鼠與HE染色及免疫組化的小鼠不是采自同一小鼠的標(biāo)本,主要由于小鼠棕色脂肪組織標(biāo)本較小,再切取一部分做冰凍會(huì)導(dǎo)致冰凍組織太小,影響制片及染色效果。

綜上所述,制作白色脂肪石蠟切片,應(yīng)采用延長(zhǎng)脫水程序,保證脫水、脫脂徹底;棕色脂肪,則按照常規(guī)組織制片程序制作石蠟切片,從而提高制片速度,提高科研效率。