陳柯帆,陸運(yùn)鑫,莫苑君,盧旭全,譚智威,侯恩存

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科2區(qū),南寧 530012;*通訊作者,E-mail:yunxinlu99@163.com)

胰腺癌是目前惡性程度最高、預(yù)后最差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,且胰腺癌早期無特異性癥狀,約90%的患者確診時(shí)已處于中晚期,且多伴發(fā)遠(yuǎn)處或局部轉(zhuǎn)移[1]。胰腺癌的發(fā)病與發(fā)展是一個(gè)隱匿、緩慢且持續(xù)的過程,涉及多種因素協(xié)同作用,研究與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的蛋白和基因?qū)γ鞔_胰腺癌的分子機(jī)制意義重大,并且對早期診斷、干預(yù)和治療靶點(diǎn)具有切實(shí)的臨床意義[2,3]。正性調(diào)節(jié)區(qū)鋅指蛋白14(PRDM14)是人類腫瘤形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族中的一員,與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[4]。目前,PRDM14已被證明與乳腺癌[5]、肺癌[6]等多種惡性腫瘤的浸潤、侵襲密切相關(guān),在多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮正向調(diào)控作用[7]。本研究旨在探討PRDM14在胰腺癌中的表達(dá)和對腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

胰腺癌細(xì)胞株SW1990(ATCC細(xì)胞庫,美國)。10%胎牛血清(Abcam公司,英國),EDTA抗原修復(fù)液(Abcam公司,英國),山羊封閉血清(Abcam公司,英國),PRDM14抗體(Abcam公司,英國),DAPI染色液(Abcam公司,英國)。全景掃描顯微鏡VS120和圖像分析軟件(奧林巴斯(中國)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6-7周齡SPF級(jí)雄性小鼠裸鼠50只，體質(zhì)量18-22 g,平均(20.64±1.14)g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證：SCXK(京)2019-0006)，自由飲水及進(jìn)食，潔凈無菌環(huán)境下(溫度22-25 ℃、濕度40%-50%)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為胰腺癌Ⅰ組、胰腺癌Ⅱ組、胰腺癌Ⅲ組、胰腺炎組和對照組，各10只，根據(jù)研究設(shè)計(jì)分別對各組小鼠進(jìn)行建模。

1.3 人胰腺癌細(xì)胞SW1990原位植瘤模型建立

胰腺癌Ⅰ組：建立人胰腺癌細(xì)胞SW1990原位植瘤模型:胰腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后制備細(xì)胞懸液(3×106個(gè)),10%的水合氯醛25 μl/10 g進(jìn)行腹腔注射,麻醉完成后常規(guī)腹部消毒,取小鼠腹中偏左側(cè)剪開皮膚,打開腹腔找到脾臟,用生理鹽水棉簽將脾臟和胰腺輕輕向外翻出,采用300 U胰島素注射器將約0.1 ml胰腺癌細(xì)胞懸液注射于胰腺體尾部,以胰腺體尾部實(shí)質(zhì)鼓泡且無明顯外滲為注射成功標(biāo)志。注射完成后生理鹽水棉簽輕壓注射點(diǎn)30-60 s,將脾臟及胰腺復(fù)位,采用3-0無菌縫合線間斷縫合逐層關(guān)閉腹腔和皮膚,常規(guī)飼養(yǎng),定期稱重和檢查胰腺腫瘤生長狀態(tài)。

胰腺癌Ⅱ組：建立PRDM14-shRNA慢病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990原位植瘤模型,采用預(yù)先PRDM14-shRNA慢病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990制備細(xì)胞懸液(3×106個(gè))建立小鼠胰腺原位植瘤模型。操作步驟同胰腺癌Ⅰ組。

胰腺癌Ⅲ組：建立control病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990原位植瘤模型,采用預(yù)先control病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990制備細(xì)胞懸液(3×106個(gè))，建立小鼠胰腺原位植瘤模型。操作步驟同胰腺癌Ⅰ組。

1.4 急性胰腺炎小鼠模型建立

胰腺炎組采用腹腔注射雨蛙素和脂多糖建立急性胰腺炎模型,雨蛙素50 μg/kg腹腔注射10次,最后一次聯(lián)合脂多糖10 mg/kg注射,注射點(diǎn)選小鼠腹中偏左約脾門位置。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水。

1.5 免疫組化檢測胰腺組織PRDM14表達(dá)

所有小鼠常規(guī)飼養(yǎng)8周后處死并解剖,胰腺標(biāo)本一分為二,一部分經(jīng)石蠟包埋,行SP免疫組化染色[8],以PBS代替一抗作為空白對照,用已知的陽性標(biāo)本作為陽性對照。結(jié)果由2名病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片并判定,陽性判定:細(xì)胞顯色為深棕色或棕黃色[9]。結(jié)果判定:隨機(jī)取5個(gè)高倍視野,分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,通過染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比聯(lián)合進(jìn)行判定,染色強(qiáng)度評分:0分代表不顯色,1分為染色呈淡黃色,2分為染色呈中黃色,3分為染色呈深棕色;陽性細(xì)胞百分比:<10%為0分,10%-25%為1分,26%-50%為2分,>50%為3分,染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比為總分,總分≥3分為PRDM14陽性,<3分表示陰性[10]。

1.6 Western blot法檢測胰腺腫瘤組織PRDM14表達(dá)

所有小鼠常規(guī)飼養(yǎng)8周,胰腺標(biāo)本。采用Wes-tern blot法檢測小鼠胰腺腫瘤組織PRDM14表達(dá),方法:聚丙烯酰胺凝膠配制—上樣—凝膠電泳—轉(zhuǎn)膜—牛奶封閉—一抗孵育—二抗孵育—顯影成像。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測胰腺癌腫瘤干細(xì)胞遷移能力

采用培養(yǎng)箱中培養(yǎng)狀態(tài)良好的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990(胰腺癌Ⅰ組)、PRDM14-sh RNA慢病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990(胰腺癌Ⅱ組)和control病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990(胰腺癌Ⅲ組)，采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察三組細(xì)胞的遷移能力。具體方法：使用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PRDM14-shRNA慢病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990和control病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻懸浮孔中。隔日換液，顯微鏡定時(shí)觀察，待細(xì)胞融合度約90%，用10 μl移液器槍頭在所有培養(yǎng)孔上劃一條直線，注意要用力均勻，培養(yǎng)液吸除之后，用PBS沖洗各孔。加入2%血清培養(yǎng)基，將劃痕、換液后的6孔板置于顯微鏡下觀察劃痕、拍照。繼續(xù)培養(yǎng)2 d，顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS223.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率或百分比表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胰腺組織PRDM14的表達(dá)

胰腺癌造模組小鼠術(shù)后胰腺癌Ⅰ組死亡2只，胰腺癌Ⅱ組和胰腺癌Ⅲ組各死亡1只，對照組及胰腺炎組小鼠無死亡。免疫組化染色結(jié)果顯示，胰腺癌組小鼠PRDM14陽性表達(dá)率明顯高于對照組；胰腺癌Ⅰ組和胰腺癌Ⅲ組小鼠PRDM14陽性表達(dá)率明顯高于胰腺炎組小鼠，胰腺癌Ⅰ組和胰腺癌Ⅲ組PRDM14陽性表達(dá)率明顯高于胰腺癌Ⅱ組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1和圖1)。

表1 各組小鼠胰腺組織PRDM14免疫組化陽性表達(dá)例(%)

Table 1 Positive immunohistochemical expression of PRDM14 in pancreatic tissue of mice in each groupcases(%)

組別n 陽性 陰性對照組100(0.00)10(100.00)胰腺炎組101(10.00) 9(90.00)胰腺癌Ⅰ組87(87.50)?# 1(12.50)胰腺癌Ⅱ組93(33.33)? 6(66.67)胰腺癌Ⅲ組98(88.89)?# 1(11.11)

與對照組比較,*P<0.05;與胰腺炎組比較,#P<0.05

A.對照組；B.胰腺炎組；C.胰腺癌Ⅰ組;D.胰腺癌Ⅱ組;E.胰腺癌Ⅲ組圖1 不同胰腺組織PRDM14陽性表達(dá) (免疫組化,×20)Figure 1 Immunohistochemical PRDM14 positive expression images of different pancreatic tissues (×20)

2.2 胰腺癌各組小鼠胰腺腫瘤組織PRDM14表達(dá)差異

結(jié)果顯示，胰腺癌Ⅰ組和胰腺癌Ⅲ組PRDM14表達(dá)量明顯高于胰腺癌Ⅱ組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2,3)。

與胰腺癌Ⅱ組比較，*P<0.05圖2 各組胰腺癌小鼠胰腺腫瘤組織PRDM14表達(dá)差異Figure 2 Differential expression of PRDM14 in pancreatic tumor tissues of pancreatic cancer mice in each group

圖3 各組胰腺癌小鼠胰腺腫瘤組織PRDM14電泳圖Figure 3 PRDM14 expression of pancreatic tumor tissues in each group by electrophoresis

2.3 PRDM14對胰腺癌腫瘤干細(xì)胞遷移能力的影響

結(jié)果顯示，胰腺癌Ⅰ組和胰腺癌Ⅲ組腫瘤干細(xì)胞遷移能力明顯高于胰腺癌Ⅱ組(見圖4)。

圖4 三組胰腺癌腫瘤干細(xì)胞遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)Figure 4 Scratch test results of migration ability of pancreatic cancer tumor stem cells in three groups

3 討論

正性調(diào)節(jié)區(qū)鋅指蛋白14(PRDM14)所在的PRDM家族是關(guān)于人類腫瘤形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族,共17個(gè)(PRDM1-17)成員[11]。其中PRDM14現(xiàn)已被證實(shí)與多種細(xì)胞的增殖、分化有關(guān),與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。Nishikawa等[13]研究顯示,PRDM14可以作為判定乳腺癌臨床治療預(yù)后的參考指標(biāo);Taniguchi等[5]研究表明,可通過沉默PRDM14抑制乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。PRDM14在肺鱗癌和腺癌中高表達(dá),在癌旁組織中低表達(dá),且與分化程度密切相關(guān)[9]。

基于以上研究有理由推斷,PRDM14在乳腺癌及肺癌中可能具有致癌作用,并且對腫瘤細(xì)胞的侵襲和預(yù)后相關(guān)。國外學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn),在人乳頭瘤病毒(HPV)誘導(dǎo)的子宮頸癌和癌前病變中PRDM14基因啟動(dòng)子甲基化十分常見,且對HPV感染陽性的癌細(xì)胞具有不同程度的抑制作用[14]?？梢奝RDM14在不同類型的惡性腫瘤中表達(dá)及作用存在差異,有待于進(jìn)一步研究探討。目前,PRDM14與胰腺癌相關(guān)研究甚少,PRDM14在胰腺癌中的表達(dá)以及對腫瘤細(xì)胞的作用尚未明了。Moriya等[15]通過胰腺癌小鼠模型試驗(yàn)表示,抑制PRDM14表達(dá)可降低胰腺癌小鼠肝轉(zhuǎn)移,該學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn),胰腺組織炎癥可升高PRDM14表達(dá)水平,對介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生可能具有重要的作用[16]。

本研究結(jié)果顯示,在正常胰腺組織、胰腺炎組織以及胰腺癌組織中PRDM14陽性表達(dá)率呈明顯上升趨勢,未被處理的胰腺癌以及control病毒干擾的胰腺癌小鼠腫瘤組織PRDM14蛋白表達(dá)量明顯高于PRDM14-shRNA慢病毒干擾的胰腺癌小鼠,結(jié)果提示,PRDM14在胰腺癌腫瘤組織中呈高表達(dá),且與胰腺癌的發(fā)生具有密切關(guān)系。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,未被處理的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990以及control病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990劃痕后培養(yǎng)48 h腫瘤細(xì)胞遷移數(shù)量明顯高于PRDM14-shRNA慢病毒干擾的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990,結(jié)果進(jìn)一步提示,PRDM14的高表達(dá)參與胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?？紤]可能因?yàn)镻RDM14除具有PR結(jié)構(gòu)域外,還包括其他鋅指蛋白結(jié)構(gòu),多與具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)活性的蛋白質(zhì)存在高度同源的SET結(jié)構(gòu)域,使其具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性,通過此作用調(diào)控了相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤蛋白的表達(dá),參與DNA轉(zhuǎn)錄,介導(dǎo)相關(guān)通路參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的調(diào)控過程[17]?；谝陨涎芯抗P者認(rèn)為,PRDM14在胰腺癌組織中高表達(dá),且與腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),有望成為胰腺癌分子治療的新靶點(diǎn),具有重要的臨床研究價(jià)值。

綜上所述,PRDM14在胰腺癌組織中呈高表達(dá),可能與胰腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移存在緊密關(guān)系,值得進(jìn)一步研究探討。