王曉蓓,再圖那木·麥麥提明,馬衣日木·賽買提,哈斯也提·依不來音,白 睿

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830063;*通訊作者,E-mail:3236321936@qq.com)

阿爾茲海默病(Alzheimer disease,AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病[1],發(fā)生于老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損壞為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,AD是老年期最常見的癡呆類型,約占老年期癡呆的50%-70%[2,3],發(fā)病危險因素包括:老齡、陽性家族史、攜帶載脂蛋白Eε4(apolipoprotein Eε4,Apo Eε4)等位基因,研究還發(fā)現(xiàn)分揀蛋白相關(guān)受體-1(SORL1)基因增加晚發(fā)型AD的患病風(fēng)險[4],但SORL1等位基因并非AD發(fā)病的充分必要條件,還有其他危險因素參與了AD的發(fā)生。本研究通過對散發(fā)的AD患者SORL1基因多態(tài)性檢測,探索SORL1基因與新疆維吾爾族和漢族患阿爾茨海默病患者之間的相關(guān)性及民族之間的差異,為臨床早期診斷阿爾茨海默病提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

收集來自2016-08～2018-06在新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床腦科中心就診的及烏魯木齊周邊地區(qū)醫(yī)院就診的符合精神疾病的診斷和統(tǒng)計手冊(DSM-Ⅳ)診斷標(biāo)準(zhǔn)的在新疆地區(qū)居住時間超過10年的維吾爾族AD患者和漢族AD患者,排除標(biāo)準(zhǔn):抑郁癥引起的假性癡呆,其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、系統(tǒng)性疾病和物質(zhì)中毒所引起的癡呆,正處于心、血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者。收集AD患者131例,年齡≥65歲,均為散發(fā)性,其中維吾爾族72例,男性35例,女性37例;漢族AD 59例,男性26例,女性33例。同期選擇與病例組年齡、性別、生活環(huán)境及方式、民族習(xí)俗相匹配的非AD患者或健康志愿者做對照組,共128例,其中維吾爾族63例,男性28例,女性35例;漢族65例,男性25例,女性40例。病例組與對照組之間性別、年齡、族別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 AD組與對照組一般臨床資料比較

Table 1 Characteristics of the included subjects

組別男/女(例)年齡(歲)漢族/維吾爾族(例)病例組61/7074.40±7.92159/72對照組53/7575.20±7.58765/63χ2/t3.710.6730.467P0.0540.4130.494

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 全部病人及健康對照組采集外周靜脈血3 ml。

1.2.2 基因組DNA的提取 全血提取基因組DNA使用TIANamp Genomic DNA kit提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)。嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.3 SORL1基因測定 PCR技術(shù)及DNA測序檢測SORL1基因,研究中SNP基因座信息來自于公共數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) GeneBank數(shù)據(jù)庫,查詢基因SORL1基因標(biāo)準(zhǔn)序列。引物序列參數(shù)見表2,委托北京博淼生物科技有限公司完成通過連接酶檢測一聚合酶鏈反應(yīng)(LDR-PCR)方法對2個候選SORLl基因多態(tài)位點進(jìn)行基因分型。

表2 SORL1基因多態(tài)性位點引物和PCR序列

Table 2 SNP site, primer names and PCR primer sequences

位點引物名稱 PCR引物序列rs37818342nd-PCRPACGTTGGATGGGAACTGGAATCCATGTCTC1st-PCRPACGTTGGATGACTGACAAGGAGGTACT-GTGUEP-SEQCCATGTCTCCCATTTTCTrs37818362nd-PCRPACGTTGGATGGAATAAGAAGCTTGAGC-CAG1st-PCRPACGTTGGATGCAACACCCTGCTTTCAACTGUEP-SEQTGAGCCAGAACATAAATCAA

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

1.3.1 一般資料統(tǒng)計學(xué)分析 實驗為病例對照,年齡為計量資料,符合正態(tài)分布,兩組比較采用t檢驗。性別及族別為計數(shù)資料,采用χ2檢驗。

1.3.2 H-W吻合度檢測 為評估病例組和健康組樣本是否隨機及調(diào)查資料的可靠性,進(jìn)行H-W吻合度測驗。

1.3.3 基因頻率及基因型統(tǒng)計學(xué)方法 基因頻率和基因型的分布采用基因計數(shù)法,基因型資料采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗,計數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,兩組間相互比較采用χ2檢驗和(或)Fisher精確概率法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多位點關(guān)聯(lián)分析,使用多重檢驗Bonferroni校正。

2 研究結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg檢驗

經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度法檢驗后,結(jié)果表示,SORL1基因型位點的觀望值和期望值之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),病例組與對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,吻合度良好(見表3)。

表3 AD病例組與對照組基因多態(tài)性檢測結(jié)果

Table 3 Results of polymorphism test between AD group and control group

基因位點n基因型等位基因GGGAAAGAHWE(P)基因位點n基因型等位基因AAAGGGAGHWE(P)rs37818340.6596rs37818360.6499病例1314379045217病例1315448054204對照1287368550206對照1288417857197

HWE:Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗

2.2 SORL1基因多態(tài)性分析

維吾爾族、漢族病例組分別與對照組比較發(fā)現(xiàn)SORL1基因rs3781834位點基因型為GA型,rs3781834位點基因型為AG型(見表4)。

表4 AD組與對照組基因型及等位基因分布

Table 4 Genotypic and allelic distribution in AD group and control group

基因位點組別基因型χ2P等位基因χ2P rs3781834GGGAAAGA 漢族病例組322341.670.4328900.190.66對照組720383496 維吾爾族病例組115561.600.45171270.050.82對照組0164716110 rs3781836?AAAGGGAG 漢族病例組321341.670.4327890.200.65對照組719383395 維吾爾族病例組223460.300.86271150.0000.99對照組1224024102

*rs3781836基因多態(tài)性檢測中漢族病例組及漢族對照組、維吾爾族病例均有1例未檢出,因此各少1例

SORL1基因的rs3781834位點的基因型分布,漢族AD組與對照組比較,維吾爾族AD組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表4)；rs3781834等位基因G和A在維吾爾族AD患者與漢族AD患者中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016 7,見表5)。rs3781836位點的基因型和等位基因分布各組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表4,5)。

表5 維吾爾族和漢族AD患者基因型及等位基因分布

Table 5 Genotypic and allelic distribution in AD patients in Uygur and Han populations

組別rs3781834基因型rs3781834等位基因rs3781836基因型rs3781836等位基因GGGAAAχ2PGAχ2PAAAGGGχ2PAGχ2P維吾爾族115560.870.65171276.480.01223460.780.67271150.700.40漢族 322342890321342771

*rs3781836基因多態(tài)性檢測中漢族病例組及漢族對照組、維吾爾族病例均有一例未檢出,因此各少一例

2.3 AD患者SORL1基因rs3781834、rs3781836等位基因分布情況

散點圖是根據(jù)DNA產(chǎn)物峰面積大小計算得到SNP位點所有分型點狀圖，SORL1基因rs3781834、 rs3781836等位基因正常聚類圖中2個純合子分型根據(jù)產(chǎn)物峰高分別在靠近橫、縱軸聚類，在二者之間單獨聚類的一組為雜合子(見圖1，2)。根據(jù)散點圖rs3781834、rs3781836聚類良好。

3 討論

SORL1基因位于11號染色體上(11q24.1),它所編碼的蛋白是一種脂蛋白受體同源體,apoE受體主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá),大腦皮質(zhì)的錐體細(xì)胞、海馬、小腦的浦肯野細(xì)胞也有表達(dá)。SORL1基因變異可明顯增加晚發(fā)型阿爾茲海默病的患病風(fēng)險。已經(jīng)有報道，在研究AD的遺傳危險等位基因的多種假定中均提示SORL1是與AD發(fā)生有關(guān)聯(lián)的并排前10名的基因。基因組學(xué)數(shù)據(jù)顯示52個SORL1基因位點中,29個位點與阿爾茨海默病患病密切相關(guān),SORL1基因位點中與加勒比海地區(qū)的西班牙人、非裔美國人和個別白種人的相關(guān)性可分別達(dá)到98%,90%,53%[5.6]。雖然這些基因與AD發(fā)病的生物學(xué)機制相關(guān),但仍需要在大量人群中反復(fù)驗證[7]。許多研究都將SORL1基因的常見和罕見變異與AD聯(lián)系起來[7-10],不同的變異在不同的研究中是相關(guān)的,從小的修飾影響到因果影響范圍不等。El Bitar等[11]在沙特阿拉伯AD患者中研究發(fā)現(xiàn)SORL1在家族和散發(fā)的AD中均起到一定的作用。以65歲為界限,AD可分為早發(fā)型(early-onset Alzheimer’s disease,EOAD)和晚發(fā)型(late-onsets Alzheimer’s disease,LOAD),以后者為主,約占95%,本研究的AD患者均為晚發(fā)型患者,這與AD的流行病學(xué)相符。我們首次分析了新疆維吾爾族人群中SORL1基因rs3781834,rs3781836與AD的相關(guān)性。結(jié)果提示SORL1基因多態(tài)性位點rs3781834、rs3781836與新疆地區(qū)AD患者無明顯相關(guān)性。然而Wen等[12]的研究發(fā)現(xiàn),19個SNP位點中rs985421、rs12364988、rs4598682、rs3781834、rs3781836是與LOAD相關(guān)的。一項超大規(guī)模涉及到30 000名受試者的研究,跨種族的包括白種人和亞洲人的meta分析中,也證明SORL1與LOAD相關(guān)[13]。一項關(guān)于晚發(fā)型LOAD的研究發(fā)現(xiàn)rs2070045、rs2282649和rs3834968三個基因變異可使中國北方人和歐洲人群患AD的風(fēng)險增高，這三種基因變異具有顯著的遺傳效應(yīng)，可以調(diào)節(jié)人腦組織中SORL1的表達(dá)[14]。LOAD的發(fā)病率及基因頻率具有種族差異性,因此這一結(jié)論需要在其他人群中進(jìn)行驗證[15]。張玉潔等[16]研究中對SORL1基因的rs2070045及rs3824968位點進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)rs2070045及rs3824968可能和新疆哈薩克族及漢族AD患者無相關(guān)性,經(jīng)民族分層后仍未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。本研究經(jīng)過民族的分層后發(fā)現(xiàn)rs3781834等位基因GG、GA、AA在維吾爾族AD患者與漢族AD患者比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義,這可能與新疆少數(shù)民族和漢族人種不同的遺傳背景、生活方式、飲食習(xí)慣有關(guān)。但需大樣本的、多中心的研究進(jìn)一步證實rs3781834基因型多態(tài)性在不同民族的患者之間存在差異。近年來阿爾茲海默病相關(guān)的多項研究中研究對象為國外人群,部分有多中心跨種族的大型研究,國內(nèi)阿爾茲海默病主要以中國南方地區(qū)的為主,新疆人群相關(guān)研究較少,地域因素也可能是導(dǎo)致患者發(fā)病的原因之一[7],但這需要進(jìn)一步大規(guī)模、跨種族的、多中心的研究來證實。

*No Call:未發(fā)現(xiàn)等位基因的病例個數(shù)圖1 rs3781834 GG、GA、AA等位基因位點散點圖Figure 1 Scatter map of alleles at the rs3781834 site

*No Call:未發(fā)現(xiàn)等位基因的病例個數(shù)圖2 rs3781836 AA、AG、GG等位基因位點的散點圖Figure 2 Scatter map of alleles at the rs3781836 site

總而言之,在我們的樣本中未發(fā)現(xiàn)SORL1基因的2個位點與AD相關(guān),可能原因:①AD發(fā)生機制比較復(fù)雜,不能用單一因素解釋SORL1基因與新疆地區(qū)AD患者之間的相關(guān)性;②可能因為我們實驗的局限性,希望未來有大樣本的、多中心的、不同人群中AD遺傳基因的差異研究。