王青松，劉泉

（1.湖北警官學院刑事技術(shù)與情報系2015級本科生，湖北 武漢；2.湖北警官學院刑事技術(shù)與情報系教師，湖北 武漢）

0 引言

口腔拭子中含有大量的DNA，目前已經(jīng)成為我國案件中的主要生物物證檢材。尤其在刑事案件中，口腔拭子會伴隨著杯子、煙蒂等遺留在形式犯罪現(xiàn)場，成為偵查人員突破案件的關(guān)鍵。在提取運輸過程中，口腔拭子DNA 會在運輸途中轉(zhuǎn)移到物證袋上。不同的物證袋來裝載樣本會讓DNA 的轉(zhuǎn)移量不同。隨著運輸時間的不同，口腔拭子樣本與物證袋之間的DNA 的轉(zhuǎn)移量也不相同，即便是微量的DNA 轉(zhuǎn)移也有可能會造成STR 分型的不全或缺失，導致檢測難度加大。這類生物物證檢材成為近年來法醫(yī)學DNA 分析領(lǐng)域的熱點和難點。我國研究更多的是對于DNA 提取、定量、擴增的過程進行研究，通過對檢材本身進行控制，來達到減少DNA 丟失的可能性。對于檢材保存和保存時間的變化的研究相對較少。當現(xiàn)場條件有限，在現(xiàn)場取得的拭子樣本應(yīng)該放置在什么物證袋中能夠減少口腔拭子DNA 的轉(zhuǎn)移。在刑事案件偵破過程中，提取證據(jù)往往需要花費大量的時間，不同保存時間口腔拭子DNA 遺失的速率也不一樣，所以本課題組在2019 年5 月制備制備口腔拭子9 個，分成6 h 組、24 h 組和48 h 組，研究口腔拭子在不同時間不同物證袋中DNA 的量如何變化，從保存生物檢材方面來降低口腔拭子DNA 的轉(zhuǎn)移率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

塑料物證袋（1 2 c m×1 5 c m）1 0 個，紙質(zhì)物證袋（1 2 c m×1 5 cm）10 個，用無菌棉簽刮擦口腔內(nèi)壁獲得的唾液DNA，夾子若干，標簽紙，物證袋封口膜若干。

1.2 主要儀器與試劑

中德美聯(lián)AGCU-EX22 擴增試劑盒，中德美聯(lián)AGCUEX22 測序試劑盒，9947A 試劑，蛋白酶K（Merck 公司，德國），DL-Dithiothreitol，Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（Eppendorf 公司，德國），ABI 3500 遺傳分析儀。

1.3 方法

1.3.1 實驗質(zhì)量控制

在進行每次實驗前，對部分實驗儀器和實驗材料進行擦洗或浸泡，所用試劑為0.05%的次氯酸和70%己醇，在對部分實驗儀器和實驗材料進行干燥，干燥時需在無菌的無紡布上進行，并用紫外燈照射至少24 h 以上。隨機選取5 個紙質(zhì)物證袋和5 個塑料物證袋以及5 根棉簽，然后對所選取的檢材進行DNA 提取、定量、擴增和毛細管電泳，檢測結(jié)果均為陰性[1]。

1.3.2 不同時間段的口腔拭子DNA 樣本的制備

取3 根無菌棉簽同時在志愿者口腔內(nèi)壁上擦拭，將1 根放入紙質(zhì)物證袋，1 根放入塑料物證袋，6 h 后分別從2 個物證袋中拿出，用夾子懸空放置，另1 根用夾子夾住用來計算總體DNA 的量，用于對照，并用便簽紙分別對每根棉簽和物證袋進行標注。以此方法分別設(shè)立3 組，棉簽放入物證袋中的時間分別為6 h、24 h、48 h，分別放入干燥避光的地方。

1.3.3 檢材檢驗過程

實驗過程中，保持實驗室溫度為（23±1）℃，空氣相對濕度保持為50%左右。使用Chelex-100 法對已經(jīng)進行處理好的口腔拭子樣本進行DNA 提取。將用來計算全部DNA量的棉簽用手術(shù)剪剪碎棉簽全部頭部，加到含適量純水的EP管中，用記號筆標記為A，向沉渣懸液中Chelex-100～400 μL，同時加入80 μL 蛋白酶K（10 mg/mL）及20 μL DTT，輕輕混勻，以相同方法分別制備放入紙質(zhì)物證袋中的棉簽、紙質(zhì)物證袋將棉簽接觸部位、塑料物證袋將接觸棉簽部位、塑料物證袋中的棉簽并分別標記為B、C、D、E。將5 份檢材用56 ℃孵育30 min，后高速振蕩20 s，再用100 ℃加熱8 min。取出，振蕩15 s，12000 rpm 離心3 min，在4 ℃條件下取上清液用于PCR 擴增。其余幾組樣本用同樣方式進行DNA 提取。24 h 樣本按照6 h 樣本制取方法依次標記為A1、B1、C1、D1、E1。48 h 樣本按照6 h 樣本制取方法依次標記為A2、B2、C2、D2、E2。

配置10 μL 體系擴增試劑，在EP 管中加入MIX 試劑4 μL，再加入primer 2 μL，水2.6 μL，酶0.4 μL，以同體系配置9 份，將提取所得到的上清液樣品每份樣品及陽性對照、陰性對照各取1 μL 加入到配置好的試劑管中。按照試劑盒程序進行擴增。待擴增完畢，放入ABI 3500 測序儀進行測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計3 組實驗?zāi)０錝TR 分型圖譜所得出峰高來確定全部DNA 定量結(jié)果，將所測得的DNA 量以轉(zhuǎn)移率的形式進行表述。注意觀察每一個圖譜的電子內(nèi)標。通過將物證袋上提取到的口腔拭子DNA 的量和樣品上提取到的口腔拭子DNA 的量與物證袋上提取到的口腔拭子DNA 的量之和進行對比來計算轉(zhuǎn)移率（轉(zhuǎn)移率=物證袋提取到的口腔拭子DNA量/物證袋提取到的口腔拭子DNA 量+樣品提取到的口腔拭子DNA 量）。將所得STR 分型圖譜與已知分型結(jié)果比對，當?shù)任换蚍甯撸?0 RFU 者為有效分型結(jié)果。通過將檢測到的紙質(zhì)物證袋與塑料物證袋與袋內(nèi)棉簽DNA 總量與用來用作對照的棉簽DNA 總量進行對比來計算檢測率（檢測率=物證袋和袋內(nèi)棉簽DNA 總量/對照用的棉簽DNA 總量）。

2 結(jié)果

2.1 不同時間不同物證袋DNA 峰值

本實驗每個STR 分型圖譜均為單獨個體，樣品STR 分型圖譜峰值中有純合子峰值達到200 rfu 以上以及雜合子等位基因峰值均在200 rfu 以上的基因座標記為成功檢出；當樣品圖譜峰值低于200 rfu 的基因座標記為未檢出。通過對D3S1368 等22 個STR 基 因 座 進 行 分 析，6 h 樣 本A 中TH01 這對等位基因峰值達到32127，B 中TH01 峰值最高為17732，C 中TH01 峰 值 最 高 為2496，D 中D2S1338 等位基因中峰值最高為845，E 中TH01 等位基因峰值最高為11232。24 h 樣本中A1 中TH01 峰值最高為14476，B1 中TH01 峰值最高為7713，C1 中TH01 峰值最高為1404，D1中TH01 峰 值 最 高 為894，E1 中TH01 峰 值 最 高 為10560；48 h 樣本中A2 中D19S433 等位基因峰值最高為62910，B2中D19S433 峰值最高為41330，C2 中D19S433 峰值最高為8730，D2 中峰值最高的是TH01 為5030，E2 中D19S433 峰值最高為52360，詳細情況見表1。

表1 口腔拭子在紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋中DNA 峰高值

2.2 不同時間各個樣本的轉(zhuǎn)移率

通過轉(zhuǎn)移率的公式計算可以得出，6 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率為12.34%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率為6.70%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率比紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率低。24 h 的樣本中紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率為15.40%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率為7.81%，48 h 的樣本中紙質(zhì)物證袋轉(zhuǎn)移率為17.44%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率為8.76%。通過樣本檢測率的公式計算得出，6 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的檢測率為37.04%，塑料物證袋的檢測率為62.41%；24 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的檢出率為38.30%，塑料物證袋的檢測率為22.48%；48 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的檢測率為20.43%，塑料物證袋的檢測率為8.77%，見圖1。

圖1 不同時間段唾液在紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋轉(zhuǎn)移率

3 討論與分析

DNA 接觸轉(zhuǎn)移在法醫(yī)物證研究中占有重要地位，其中二次轉(zhuǎn)移更是近年來被法醫(yī)學者們越來越多的談?wù)揫2-3]。Mariya Goray 等人模擬常規(guī)刑事案件提取檢材對170 個手套上二次轉(zhuǎn)移的DNA 進行了研究，發(fā)現(xiàn)有131 個手套上檢出高于閾值的等位基因，說明二次轉(zhuǎn)移在法醫(yī)學實踐中非常常見[4]。浙江警察學院的學者通過對9 名志愿者在洗手后30 min、2 h、6 h 分別握持木柄螺絲刀、橡膠柄螺絲刀、膠木插頭1 min 和佩戴粗紗手套15 min，及手部脫落細胞的二次轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)，在洗手后30 min 和2 h 后，從手套中檢出11～16個基因座的人數(shù)為26 人，明顯多于從木柄檢出的14 人和橡膠柄螺絲刀中檢出的14 人，說明不同類型的客體DNA 的轉(zhuǎn)移率是不一樣的。本實驗與以往研究不同的是，研究了同種物證在不同物證袋上DNA 的轉(zhuǎn)移情況以及隨著時間變化，不同時間段的檢材的轉(zhuǎn)移情況會有何不同。實驗結(jié)果顯示，所有放在物證袋中的棉簽均發(fā)生了DNA 轉(zhuǎn)移，但不同的物證袋在相同時間內(nèi)，DNA 的轉(zhuǎn)移率不同，同一物證袋在不同時間下，DNA 的轉(zhuǎn)移率也不相同。

從實驗結(jié)果比較它們的轉(zhuǎn)移率可知，放入紙質(zhì)物證袋中的口腔拭子DNA 轉(zhuǎn)移率三個時間段都要比塑料物證袋中的口腔拭子DNA 轉(zhuǎn)移率會高。原因可能是塑料物證袋是非滲透性材質(zhì)，而紙質(zhì)物證袋材質(zhì)是滲透性材質(zhì)。Gosch Annica[5]通過研究帶塑料柄的螺絲刀和帶涂層鋼制的撬棍也有類似發(fā)現(xiàn)，帶塑料柄的螺絲刀STR 基因座DNA 轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)率高達90%，帶涂層鋼制的撬棍STR 基因座DNA 轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)率10%，滲透性客體的DNA 轉(zhuǎn)移率明顯高于非滲透性材質(zhì)。

實驗結(jié)果還顯示紙質(zhì)物證袋中的DNA 量隨著時間增長在變多，紙質(zhì)物證袋中的DNA 的轉(zhuǎn)移率在3 個時間段里也逐步增大；塑料物證袋3 個時間段塑料物證袋的DNA 轉(zhuǎn)移率有輕微的上升，但總體上基本保持不變。這可能是塑料物證袋不透氣，不利于樣品的保存從而導致DNA 降解加速的原因。這說明在犯罪現(xiàn)場如果遇到較為新鮮的生物物證，裝在塑料物證袋中比裝在紙質(zhì)物證袋中更容易減少DNA 的轉(zhuǎn)移。而在實際工作中，如果遇到微量DNA，為防止這些微量物證丟失，導致偵破案件難度加大[6]，建議選擇紙質(zhì)物證袋保存，這將有利于提高后期的檢出率。

實驗結(jié)果還顯示同一時間段，同一組樣品中紙質(zhì)物證袋與紙質(zhì)物證袋中的棉簽中含有的DNA 總量和塑料物證袋與塑料物證袋中棉簽上含有的DNA 總量要比實際測得的用作對照的棉簽DNA 總量少（表1）。筆者分析，其原因可能有以下3 點：第一，這是因為在制備DNA 檢材過程中，用眼科手術(shù)剪剪取棉簽纖維時只剪取了棉簽表層，會有部分DNA 丟失。第二，同時物證袋樣本在制備過程中因為EP 管較小，只剪取了棉簽頭放入的一部分，所以也有可能造成DNA 缺失。第三，也有可能在采用直接剪取法剪取物證袋時手套上或者是剪刀上也會沾染上DNA，導致實際物證袋和放入物證袋中棉簽的DNA 量加起來比對照組用來測量DNA 總量的棉簽含量低。這個現(xiàn)象提示我們在提取DNA 時要注意提取全面，同時法醫(yī)人員在運送檢材時要注意檢材在物證袋中的移動，避免DNA 轉(zhuǎn)移量增大。筆者在進行實驗的過程中，發(fā)現(xiàn)會有個別組的樣本STR 分型圖譜跑不出，當同比稀釋之后，可以跑出正常的STR 分型圖譜。實際案件中一般只需要一小部分實驗檢材能夠得出DNA 的分型圖譜，大量的DNA 容易導致峰值過高甚至DNA 測序儀測不出具體峰值。3 組時間段用來得出DNA 總量的棉簽DNA 量都不同，這與每次制備樣本時有關(guān)，樣本制備時用棉簽擦取口腔內(nèi)壁的力度次數(shù)都影響DNA 的含量。橫向分析可以看出，3 組實驗效果都比較明顯，能檢驗出大量的STR 基因座，說明當檢材新鮮時，檢材內(nèi)含有的DNA 量大，提取難度低、條件好時可采用Chelex-100法提取接觸DNA，能夠很好的發(fā)揮其優(yōu)勢，盡量避免檢查方法對結(jié)果產(chǎn)生影響。

本實驗得出的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)48 h 塑料物證袋的檢測率異常低，其他樣品的檢測率屬于正常值。這種情況可能是因為在進行DNA 提取時沒有把物證袋上含有DNA 的范圍剪取全面造成DNA 遺失。3 個時間段的紙質(zhì)物證袋中的遺失率都比塑料物證袋的遺失率高，此種現(xiàn)象暫時無系統(tǒng)解釋，有待進一步研究。

通過STR 分型圖譜可以看出6 h 樣本中存在有污染情況，存在污染的情況有很多種，可能有制備樣本時的污染，有可能是轉(zhuǎn)移過程中沒有做到絕對的防污染[7]，另一方面，實驗室潛在的污染是對DNA 分型存在污染的進一步的解釋，即使在DNA 提取過程中用了所有能夠避免污染的材料，我們?nèi)孕枰O(shè)定陰性對照和陽性對照來專門針對樣本管特異性污染。如今法醫(yī)界有不少學者對污染的各種不同類型和檢測情況都進行過討論，并對污染造成的潛在影響進行評估，包括依據(jù)指南對STR 分析結(jié)果的解釋、最終獲得的數(shù)據(jù)等[8]。隨著科技發(fā)展，也許有一天能夠創(chuàng)立一個評估系統(tǒng)能夠?qū)ξ廴驹斐傻募訇栃越Y(jié)果進行評估和能夠移除常規(guī)和LCN 模板證據(jù)處理中的危險因素，以及創(chuàng)立對陰性對照進行分析的應(yīng)用專家系統(tǒng)。

4 結(jié)論

通過對實驗數(shù)據(jù)進行分析，可以得出以下結(jié)論：（1）口腔拭子DNA 在紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋中都會發(fā)生轉(zhuǎn)移；（2）同一時間下，塑料物證袋中口腔拭子DNA 的轉(zhuǎn)移率比紙質(zhì)物證袋中的轉(zhuǎn)移率低；（3）隨著時間推移，口腔拭子DNA 在紙質(zhì)物證袋中轉(zhuǎn)移量增大，而在塑料物證袋的轉(zhuǎn)移量基本不變。由此可以得出塑料物證袋比紙質(zhì)物證袋更適宜裝口腔拭子類生物物證。