盧春霞 劉長(zhǎng)彬 石國(guó)慶 楊華

摘要：為了構(gòu)建pET30a-bPAG9重組表達(dá)載體，并在BL21（DE3） 感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高效表達(dá)牛妊娠相關(guān)糖蛋白9（bPAG9），通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)bPAG9基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，人工合成bPAG9全基因序列，經(jīng)雙酶切法將bPAG9基因插入到表達(dá)載體pET30a中。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-bPAG9轉(zhuǎn)染至BL21（DE3） 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)過(guò)超聲波裂解和親和層析方法獲得重組蛋白bPAG9。用SDS-PAGE 和 Western Blot方法檢測(cè)重組蛋白bPAG9的表達(dá)效果。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增得到1 128 bp的優(yōu)化bPAG9基因片段，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-bPAG9經(jīng)雙酶切獲得約5 244 bp和1 125 bp的2條片段，與預(yù)期值相符;對(duì)重組載體測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化后的基因堿基序列完全一致，編碼的氨基酸序列未發(fā)生突變;SDS-PAGE 和 Western Blot 鑒定結(jié)果顯示，獲得相對(duì)分子質(zhì)量約為4.0×104的bPAG9重組蛋白，通過(guò)親和層析純化后，重組蛋白bPAG9純度到達(dá)90%以上。

關(guān)鍵詞：牛妊娠相關(guān)糖蛋白;密碼子;重組蛋白;原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S823.9+13+.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）01-0122-08

Abstract：To construct the recombinant expression vector pET30a-bPAG9 and express bovine pregnancy associated glycorprotein-9（bPAG9） in BL21（DE3） cells， the codons of original bPAG9 gene were redesigned and optimized by bioinformatics techniques. Furthermore， the codon-optimized gene bPAG9 was synthesized by PCR and connected with pET30a vector by double digestion. The pET30a-bPAG9 expression vector was constructed and transfected into BL21（DE3） cells. The recombinant protein bPAG9 was obtained by ultrasonic lysis and affinity chromatography. SDS-PAGE and Western blotting were performed to detect the expression of the recombinant protein bPAG9. The results showed that the optimized bPAG9 gene fragment of 1 128 bp was obtained by PCR. After amplification and enzymatic digestion， two fragments of 5 244 bp and 1 125 bp were obtained from pET30a-bPAG9 expression vector. These results were consistent with expectations. The sequencing results of recombinant vector showed that the base sequence of bPAG9 gene in expression vector was consistent with the optimized gene， and the amino acid was not mutated. The results Westernblotting and SDS-PAGE indicated that the recombinant protein bPAG9 with the relative molecular weight of about 4.0×104 was successfully expressed in BL21（DE3） cells. The purity of recombinant protein bPAG9 was over 90% after purification by affinity chromatography.

Key words：bovine pregnancy associated glycoprotein;codon;recombinant protein;prokaryotic expression

妊娠相關(guān)糖蛋白 （ Pregnancy-associated glycoproteins，PAG） 是偶蹄類動(dòng)物胎兒胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞合成、分泌的一類糖蛋白。1991年Zoli 等[1]從奶牛胎盤中分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為6.7×104的糖蛋白，與Butler等[2]發(fā)現(xiàn)的妊娠特異性蛋白 B （ PSPB ）有著高度的相似性，構(gòu)成了一個(gè)龐大的胎盤糖蛋白家族，統(tǒng)稱PAG。PAG屬于天冬氨酸蛋白酶家族，與胃蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E有50%以上的相同氨基酸序列，但大多數(shù)PAG由于催化位點(diǎn)氨基酸發(fā)生置換使得其沒(méi)有酶活性。牛妊娠相關(guān)糖蛋白（bPAG）基因家族至少有 22 個(gè)轉(zhuǎn)錄本以及變異體，由胎盤滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞和滋養(yǎng)外胚層的雙核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生，有些在胚胎附植后進(jìn)入母體血液 [3-5]，且整個(gè)孕期持續(xù)存在，常作為一種標(biāo)志物用于家畜早期妊娠診斷[6-8]。

目前，基于免疫分析的商品化PAG檢測(cè)試劑盒在國(guó)外已大規(guī)模推廣應(yīng)用，并取得較高的診斷準(zhǔn)確率[9-10]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于PAG相關(guān)研究報(bào)道較少，無(wú)商品化的PAG蛋白和抗體銷售，而進(jìn)口試劑盒檢測(cè)成本過(guò)高，限制了其在國(guó)內(nèi)牧場(chǎng)的推廣應(yīng)用。因此，如何獲取高純度PAG蛋白，研發(fā)相應(yīng)的快速檢測(cè)方法及產(chǎn)品，是規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)急需解決的問(wèn)題。

目前，已有研究者從多種哺乳動(dòng)物胎盤子葉中分離出PAG 天然蛋白 [1， 11-12]，但是純化步驟繁瑣復(fù)雜，需要多種純化方法同時(shí)使用才能獲得高純度的PAG。也有人利用豌豆凝集素[13-14]及胃蛋白酶抑制劑[15-16]等特異性結(jié)合PAG，通過(guò)親和層析法分離獲得PAG，但該法成本較高，不利于PAG蛋白的大量純化。而體外重組蛋白技術(shù)為PAG結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用研究提供了新思路，目前已有人在真核系統(tǒng)中表達(dá)了bPAG1[17]，但PAG1 在體內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)，在母畜產(chǎn)后80～100 d內(nèi)仍能檢測(cè)到，在此時(shí)間段內(nèi)檢測(cè)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[6， 18]。有研究結(jié)果表明，bPAG9早在牛妊娠后25 d 就已經(jīng)表達(dá)[3]，且在前3個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平顯著高于bPAG1 [19]。因此，bPAG9可作為理想的標(biāo)志物用于家畜早期妊娠診斷。但迄今為止，尚未見(jiàn)到關(guān)于bPAG9重組蛋白的研究報(bào)道。

本研究根據(jù)bPAG9基因信息及宿主細(xì)胞對(duì)密碼子的偏好性，在不改變氨基酸序列的前提下對(duì)bPAG9基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增bPAG9全基因序列，然后構(gòu)建proEM-bPAG9重組質(zhì)粒，在BL21（DE3） 大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)bPAG9重組蛋白，為奶牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

BL21（DE3） 感受態(tài)細(xì)胞、pET30a載體、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自德泰生物科技（南京）有限公司，Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，SDS-PAGR變性丙烯酰胺凝膠制備試劑盒、Ni-IDA 蛋白純化試劑盒、小鼠抗6× His單克隆抗體、蛋白質(zhì)Mark、DNA mark、Nde I內(nèi)切酶、Hind III 內(nèi)切酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、二硫蘇糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟、谷胱甘肽、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、咪唑（Imidazole ）、尿素（Urea ）等購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨、硫酸卡那霉素等購(gòu)自Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

VeritiTM 96梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;Essential V4凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)UVITEC公司產(chǎn)品;Powerpac 300電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;DYCZ-24EN雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠產(chǎn)品;DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳，北京六一儀器廠產(chǎn)品;Thermo311 CO2 培養(yǎng)箱，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品;Thermo ScientificTM Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀，美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品;AKTA Explorer 100 蛋白純化層析系統(tǒng)，美國(guó)GE公司產(chǎn)品;MicroPulser電轉(zhuǎn)儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;BSC -150 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊事業(yè)有限公司產(chǎn)品;優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1bPAGP基因優(yōu)化與合成根據(jù) GenBank公布的bPAG9（登錄號(hào)：AF020511.1）基因序列，利用密碼子優(yōu)化軟件MaxCodonTM[德泰生物科技（南京）有限公司]對(duì)bPAG9基因進(jìn)行優(yōu)化，在保證氨基酸序列不變的情況下，利用宿主細(xì)胞對(duì)密碼子的偏好性，將低頻密碼子替換為使用頻率高的密碼子，提高密碼子適用指數(shù)（CAI），同時(shí)降低序列中堿基重復(fù)結(jié)構(gòu)，調(diào)整序列的G+C含量在理想?yún)^(qū)間（30%～70%）。并在優(yōu)化基因5′端和3′端設(shè)計(jì)Nde I、Hind III酶切位點(diǎn)和His標(biāo)簽序列。根據(jù)優(yōu)化的bPAG9基因，應(yīng)用 Primer premier軟件設(shè)計(jì)18條引物。引物1：5′-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATCGTGAAAATCCCGCTGCGCCAAGTCAAAACCATGCGTAAAACCCTGTCCGGCAAAA -3′（下劃線為Nde I酶切位點(diǎn)）;引物18：5′-CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATTAATGATGATGATGATGATGAACCGCGCGTGCCAGACCAATA-3′（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)）（其余引物未列出）。然后通過(guò)全基因合成法擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用 DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段。bPAG9基因優(yōu)化及合成由德泰生物科技（南京）有限公司完成。

1.3.2pET30a-bPAG9重組載體的構(gòu)建將pET30a載體用Nde I和Hind III進(jìn)行雙酶切，pET30a載體酶切體系：pET30a載體5.0 μl、10×FD Buffer 5.0 μl、Nde I 2.5 μl （10 U/μl）、Hind III 2.5 μl （10 U/μl）、ddH2O 加至50.0 μl，37 ℃酶切1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒回收，將回收的酶切產(chǎn)物和目的DNA片段用連接酶在50 ℃連接25 min，連接體系：PAG9 DNA 4.0 μl、線性pET30a載體3.5 μl、T4 DNA連接酶 2.5 μl （5 U/μl）。

1.3.3pET30a-bPAG9重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定將連接產(chǎn)物使用42 ℃熱激法轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)1 h，取20 μl菌液涂到含有硫酸卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落接種到新的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)4 h，取 2 μl菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定。上游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′;下游引物：5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。反應(yīng)體系：菌液1.0 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物0.5 μl，聚合酶0.5 μl，dNTP 0.5 μl （10 mmol/L），ddH2O加至50.0 μl;反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性25 s，62 ℃退火20 s， 72 ℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將初步判斷為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后，收集菌液。采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系和條件：重組質(zhì)粒5.0 μl、10×FD Buffer 5.0 μl、Nde I 2.5 μl （10 U/μl）、Hind III 2.5 μl （10 U/μl），ddH2O加至50.0 μl，37 ℃酶切1 h，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR鑒定與雙酶切鑒定得到的陽(yáng)性克隆送德泰生物科技（南京）有限公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確無(wú)誤后，進(jìn)行質(zhì)粒大量抽提，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4表達(dá)菌株的制備將重組質(zhì)粒采用42 ℃熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株中，加入200 μl LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、195 r/min培養(yǎng)1 h，取80 μl菌懸液涂布于含有50 μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單菌落接種到含有50 μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，取0.9 ml的菌液與0.1 ml 80%無(wú)菌甘油混合，-80 ℃保存。

1.3.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)取表達(dá)菌株菌液20 μl接種到含有50 μg/ml的硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日接種到含50 μg/ml的硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.5～0.8時(shí)，取少量樣品作為未誘導(dǎo)對(duì)照，其余菌液加入終濃度0.25 mmol/L IPTG，分別在15 ℃或37 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。收集600 μl培養(yǎng)液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入50 μl PBS重懸沉淀，加熱變性，SDS-PAGE電泳分析。

1.3.6重組蛋白的純化收集擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的菌體，加入細(xì)胞裂解液Buffer A[50 mmol/L Tris （pH8.0）、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑、1 mmol/L DTT、1%TritionX-100、1 μg/ml Leupeptin]，超聲波裂解破碎菌體，4 ℃、12 500 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，上清液過(guò)0.45 μm濾膜。沉淀用Buffer B[50 mmol/L Tris （pH8.0）、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT、1% Triton X-100、2 mmol/L EDTA]重懸，超聲波裂解破碎，12 500 r/min、4 ℃離心15 min，保留沉淀，加入Buffer C[50 mmol/L Tris （pH8.0）、150 mmol/L NaCl、8 mol/L 尿素、20 mmol/L咪唑]，超聲波破碎，12 500 r/min、4 ℃離心15 min，上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾。采用Ni-IDA柱對(duì)以上兩種上清液分別進(jìn)行親和層析，首先用Buffer A或Buffer C平衡Ni-IDA柱，直至吸光度A280接近基線，將制備好的上清液分別上柱，4 ℃孵育60 min，用15倍柱體積的Buffer A或Buffer C沖洗Ni-IDA柱，除去雜蛋白，直至吸光度A280接近基線，然后分別采用含50 mmol/L、100 mmol/L、500 mmol/L咪唑的Buffer A或Buffer C洗脫目的蛋白，流速1.5 ml/min。分別收集上清液、流穿液、洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化效果，收集含目的蛋白質(zhì)的洗脫液。純化后的目的蛋白質(zhì)采用BCA試劑盒測(cè)定濃度。

1.3.7重組蛋白的Western blot鑒定純化后的重組蛋白bPAG9經(jīng)SDS-PAGE電泳后，取下凝膠，采用半干式電轉(zhuǎn)印法將重組蛋白bPAG9轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF 膜使用之前在甲醇中浸泡 30 s，之后將 PVDF 膜、凝膠、濾紙置于轉(zhuǎn)膜液浸泡，浸泡后將三者按照正確順序放在轉(zhuǎn)印儀上，轉(zhuǎn)印 45 min。取下 PVDF 膜于 5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h后，1×PBST漂洗3～4次，每次5 min。加入1∶2 000 稀釋的抗 His 標(biāo)簽小鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h，1×PBST漂洗。最后用ECL發(fā)光底物拍照。

2結(jié)果與分析

2.1bPAG9基因優(yōu)化結(jié)果

GenBank公布（登錄號(hào)：AF020511.1）的bPAG9基因全長(zhǎng)為1 311 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)（Coding sequence， CDS）長(zhǎng)度為1 140 bp。對(duì)該基因進(jìn)行優(yōu)化后，優(yōu)化基因bPAG9的密碼子適用指數(shù)（CAI）由0.73提高到0.89，G+C含量無(wú)明顯變化，優(yōu)化前后分別為48.82%和49.00%，優(yōu)化前后兩個(gè)基因的核苷酸同源性為63.4%，氨基酸序列完全一致。將優(yōu)化的基因加入酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽等序列，切去信號(hào)肽編碼序列，bPAG9優(yōu)化基因序列全長(zhǎng)1 128 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列為1 113 bp（圖1）。

2.2bPAG9優(yōu)化基因 PCR擴(kuò)增與鑒定

對(duì)bPAG9優(yōu)化基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明，PCR成功擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的優(yōu)化的目的基因bPAG9，片段大小約1 128 bp，與理論大小基本相符。

2.3重組質(zhì)粒pET30a-bPAG9的構(gòu)建及鑒定

將PCR擴(kuò)增的優(yōu)化的目的基因片段和線性化的pET30a載體進(jìn)行連接，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建牛妊娠相關(guān)糖蛋白9的重組表達(dá)載體pET30a-bPAG9。將鑒定為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果（圖3）顯示重組質(zhì)粒電泳后呈現(xiàn)環(huán)狀、線性和超螺旋3種基本形態(tài)，酶切后的pET30a線性載體和bPAG9基因片段大小與理論值（5 244 bp和1 125 bp）相符，且酶切條帶單一，表明重組載體構(gòu)建成功。將測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化后的bPAG9基因?qū)Ρ确治觯瑝A基序列完全一致，符合率為100%，其編碼的氨基酸序列與GenBank （protein ID：AAC04682.1） 公布的完全一致，表明bPAG9優(yōu)化基因插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。

2.4bPAG9重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET30a-bPAG9轉(zhuǎn)入到BL21（DE3）大腸桿菌后，在相同的IPTG誘導(dǎo)濃度下，分別進(jìn)行15 ℃和37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，以未加入IPTG作為對(duì)照。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，15 ℃和37 ℃誘導(dǎo)條件下，在相對(duì)分子質(zhì)量4.0×104左右均有明顯的蛋白質(zhì)條帶，未誘導(dǎo)的對(duì)照則無(wú)相應(yīng)的目的條帶?？紤]低溫誘導(dǎo)表達(dá)有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，因此選擇誘導(dǎo)表達(dá)溫度為15 ℃。以上結(jié)果說(shuō)明，bPAG9基因在原核表達(dá)宿主BL21（DE3）中成功誘導(dǎo)表達(dá)。

2.5bPAG9重組蛋白的純化

誘導(dǎo)表達(dá)后的菌株超聲波破碎后，對(duì)上清液進(jìn)行Ni-IDA柱親和層析純化，隨后利用SDS-PAGE對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖5）顯示，所有泳道均沒(méi)有目的蛋白，表明表達(dá)菌株裂解后上清液中沒(méi)有可溶性bPAG9重組蛋白。菌體破碎后收集的沉淀經(jīng)2次超聲波溶解后，再經(jīng)過(guò)Ni-IDA純化得到高濃度的融合蛋白，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖6）顯示，菌體沉淀溶解后的上清液在相對(duì)分子質(zhì)量約4.0×104處出現(xiàn)高濃度的目的條帶，表明bPAG9重組蛋白分布在沉淀即包涵體中，所有洗脫組分中均含有目的蛋白，其中含500 mmol/L咪唑的洗脫溶液獲得純度較高的bPAG9重組蛋白。經(jīng)DS-PAGE分析，純化后的重組蛋白bPAG9純度大于90%。BCA方法測(cè)定其濃度為0.34 mg/ml。

Original為原始bPAG9基因序列，Optimized為優(yōu)化后的bPAG9 基因序列，下劃線為優(yōu)化后基因與原始基因的差異堿基位點(diǎn)，粗體為起始和終止密碼子，方框?yàn)镹de I和Hind III酶切位點(diǎn)，斜體為His標(biāo)簽序列，省略號(hào)為刪除的信號(hào)肽位點(diǎn)。

2.6重組蛋白bPAG9的Western blot鑒定

純化的bPAG9重組蛋白C 端包含一個(gè)His 標(biāo)簽，根據(jù)這一特性，利用 His標(biāo)簽抗體對(duì)bPAG9重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果（圖7）顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約 4.0×104處有特異雜交條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致。bPAG9原始基因CDS長(zhǎng)度為1 140 bp，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，編碼379個(gè)氨基酸殘基（Amino acid， AA），信號(hào)肽區(qū)域位于第1～15位氨基酸殘基，蛋白質(zhì)理論相對(duì)分子質(zhì)量為 4.286×104，等電點(diǎn)8.82。優(yōu)化的基因在去除信號(hào)肽和增加His標(biāo)簽序列后，CDS長(zhǎng)度為1 113 bp，編碼371個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為 4.212×104。本研究原核表達(dá)的重組蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約 4.0×104，與預(yù)期蛋白質(zhì)大小基本一致，說(shuō)明該重組蛋白質(zhì)在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功誘導(dǎo)表達(dá)。

3討論

牛妊娠相關(guān)糖蛋白 （bPAG） 種類繁多，人們利用RT-PCR技術(shù)從牛胎盤組織中篩選出了至少22種 PAG的cDNA轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)其出現(xiàn)的時(shí)間將其分為古代組與現(xiàn)代組，古代組PAG出現(xiàn)在8.000×107年前，經(jīng)過(guò)進(jìn)化在約5.000×107年前出現(xiàn)現(xiàn)代組PAG[4]。 大多數(shù)bPAG如bPAG1、bPAG3、bPAG4、bPAG5、bPAG6、bPAG7、bPAG9、bPAG14、bPAG15、bPAG16、bPAG17、bPAG18、bPAG19、bPAG20、bPAG21、bPAG22屬于現(xiàn)代組，由胎盤滋養(yǎng)外胚層的雙核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生，由于催化中心堿基發(fā)生了突變而不具有酶活性;而bPAG2、bPAG8、bPAG10、bPAG11、bPAG12、bPAG13屬于古代組，在整個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中產(chǎn)生，保留了典型天冬氨酸肽酶的所有特征，具有酶活性[3，5，20]。由于bPAG家庭成員間的序列差異，bPAG基因在整個(gè)妊娠期的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)空特異性[3，5，19-21]，如Green等運(yùn)用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胎盤中RNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)bPAG2、bPAG4、bPAG5、bPAG8、bPAG9、bPAG10、bPAG11 早在妊娠后25 d就已經(jīng)表達(dá)，而bPAG1、bPAG6、bPAG7在妊娠后 45 d開(kāi)始表達(dá)，主要存在于妊娠中后期[3]。而且，bPAG9在妊娠后3個(gè)月內(nèi)表達(dá)水平顯著高于bPAG1 [19]。因此，bPAG9可作為一個(gè)更理想的標(biāo)志物用于牛早期妊娠診斷。

由于bPAGs 蛋白種類繁多，增加了對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能研究的難度，體外重組蛋白質(zhì)的出現(xiàn)為探究該類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能提供了新思路。因此，前人對(duì) bPAGs 在真核和原核系統(tǒng)中的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)研究。Patel 等[17]構(gòu)建真核表達(dá)載體PAG-pRcRSV，分別在HEK 293和CHO細(xì)胞中首次表達(dá)了PAG1重組蛋白，Western blot分析結(jié)果顯示，HEK293細(xì)胞表達(dá)效果優(yōu)于CHO細(xì)胞。Telugu 等[22]為驗(yàn)證古代組bPAG是否具有酶活性，利用昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了bPAG2 和 bPAG12重組蛋白，并對(duì)這2種蛋白質(zhì)的水解活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示2個(gè)重組蛋白質(zhì)具有良好的蛋白質(zhì)水解活性。但是真核表達(dá)系統(tǒng)操作復(fù)雜，且表達(dá)量低，成本較高。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)以其低成本、高表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)受到人們的青睞。國(guó)內(nèi)對(duì)于PAG的研究極少，薄小輝[23]將bPAG4 基因插入到pET28a 原核表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，采用 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)bPAG4 重組蛋白，但蛋白質(zhì)表達(dá)效率沒(méi)有報(bào)道。

本研究為提高bPAG9在BL21（DE3）的表達(dá)量，利用MaxCodonTM軟件在不改變氨基酸序列的前提下，通過(guò)消除稀有密碼子，利用偏好密碼子以及平衡G+C含量等策略對(duì)bPAG9基因進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的bPAG9基因G+C含量為49%，密碼子適用指數(shù)（CAI）提高到0.89。然后通過(guò)全基因合成法合成了bPAG9優(yōu)化基因，并將其成功插入到pET30a載體中，采用BL21（DE3） 感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)原核表達(dá)獲得表達(dá)量和純度均較高的bPAG9重組蛋白，為bPAG9抗體的制備和牛早期妊娠診斷產(chǎn)品的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZOLI A P， BECKERS J F， WOUTERS-BALLMAN P， et al. Purification and characterization of a bovine pregnancy-associated glycoprotein[J]. Biology of Reproduction， 1991， 45（1）： 1-10.

[2]BUTLER J E， HAMILTON W C， SASSER R G， et al. Detection and partial characterization of two bovine pregnancy-specific proteins[J]. Biology of Reproduction， 1982， 26： 925-933.

[3]GREEN J A， XIE S， QUAN X， et al. Pregnancy-associated bovine and ovine glycoproteins exhibit spatially and temporally distinct expression patterns during pregnancy[J]. Biology of Reproduction， 2000， 62： 1624-1631.

[4]HUGHES A L， GREEN J A， GARBAYO J M， et al. Adaptive diversification within a large family of recently duplicated， placentally expressed genes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2000， 97： 3319-3323.

[5]WOODING F B， ROBERTS R M， GREEN J A. Light and electron microscope immunocytochemical studies of the distribution of pregnancy associated glycoproteins （PAGs） throughout pregnancy in the cow： possible functional implications[J]. Placenta， 2005， 26： 807-827.

[6]ZOLI A P， GUILBAULT L A， DELAHAUT O W B， et al. ?Radioimmunoassay of a bovine pregnancy-associated glycoprotein in serum： its application for pregnancy diagnosis[J]. Biology of Reproduction， 1992， 46： 83-92.

[7]FRIEDRICH M， HOLTZ W. Establishment of an ELISA for measuring bovine pregnancy-associated glycoprotein in serum or milk and its application for early pregnancy detection[J]. Reproduction in Domestic Animals， 2010， 45： 142-146.

[8]DUFOUR S， DUROCHER J， DUBUC J， et al. Comparison of a commercial bovine pregnancy-associated glycoprotein ELISA test and a pregnancy-associated glycoprotein radiomimmunoassay test for early pregnancy diagnosis in dairy cattle[J]. Animal Reproduction Science， 2015， 159： 31-37.

[9]DUFOUR S， DUROCHER J， DUBUC J， et al. Bayesian estimation of sensitivity and specificity of a milk pregnancy-associated glycoprotein-based ELISA and of transrectal ultrasonographic exam for diagnosis of pregnancy at 28 to 45 days following breeding in dairy cows[J]. Preventive Veterinary Medicine， 2017， 140： 122-133.

[10]KAYA M S， KSE M， BOZKAYA F. Early pregnancy diagnosis using a commercial ELISA test based on pregnancy-associated glycoproteins in Holstein-Friesian heifers and lactating cows[J]. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences， 2016， 40： 694-699.

[11]BELLA A， SOUSA NM， DEHIMI ML， et al. Western analyses of pregnancy-associated glycoprotein family （PAG） in placental extracts of various mammals[J]. Theriogenology， 2007， 68： 1055-1066.

[12]EI AMIRI B， REMY B， DE SOUSA N M， et al. Isolation and characterization of eight pregnancy-associated glycoproteins present at high levels in the ovine placenta between day 60 and day 100 of gestation[J]. Reproduction Nutrition Development， 2004， 44： 169-181.

[13]KLISCH K， DE SOUSA N M， BECKERS J F， et al. Pregnancy associated glycoprotein-1， -6， -7， and-17 are major products of bovine binucleate trophoblast giant cells at midpregnancy[J]. Molecular Reproduction and Development， 2005， 71（4）： 453-460.

[14]BARBATO O， SOUSA N M， KLISCH K， et al. Isolation of new pregnancy-associated glycoproteins from water buffalo （Bubalus bubalis） placenta by Vicia villosa affinity chromatography[J]. Research in Veterinary Science， 2008， 85： 457-466.

[15]GREEN J A， PARKS T E， AVALLE M P， et al. The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoproteins （PAGs） in the serum of pregnant cows and heifers[J]. Theriogenology， 2005， 63（5）： 1481-1503.

[16]EGEN T E， EALY A D， LANDON L A， et al. Autoimmunization of ewes against pregnancy-associated glycoproteins does not interfere with the establishment and maintenance of pregnancy[J]. ?Animal An International Journal of Animal Bioscience， 2009， 3（6）： 850-857.

[17]PATEL O V， TAKAHASHI T， IMAI K， et al. Generation and purification of recombinant bovine pregnancy associated glycoprotein[J]. The Veterinary Journal， 2004， 168： 328-335.

[18]MIALON M M， CAMOUS S， RENAND G， et al. Peripheral concentrations of a 60-kDa pregnancy serum protein during gestation and after calving and in relationship to embryonic mortality in cattle[J]. Reprod Nutr Dev， 1993，33：269-282.

[19]PAREL O A， YAMADA O， KIZAKI K， et al. Quantitative analysis throughout pregnancy of placentomal and interplacentomal expression of pregnancy-associated glycoproteins-1 and -9 in the cow [J]. Mol Reprod Dev， 2004， 67：257-263.

[20]TELUGU B P V， WALKER A M， GREEN J A. Characterization of the bovine pregnancy-associated glycoprotein gene family- analysis of gene sequences， regulatory regions within the promoter and expression of selected genes[J]. BMC Genomics， 2009， 10：185-201.

[21]XIE S， GREEN J， BIXBY J B， et al. The diversity and evolutionary relationships of the pregnancy-associated glycoproteins， an aspartic proteinase subfamily consisting of many trophoblast-expressed genes[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94： 12809-12816.

[22]TELUGU B P， PALMIER M O， VAN DOREN S R， et al. An examination of the proteolytic activity for bovine pregnancy-associated lycoproteins 2 and 12[J]. Biol Chem， 2010， 391（2/3）： 259-270.

[23]薄小輝. 妊娠相關(guān)糖蛋白在奶牛早期妊娠診斷上的應(yīng)用研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2017.

（責(zé)任編輯：張震林）