王惠蕓，陳佩瑤，歐陽雨晴，王冬，王靈芝*

1.北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，北京 100029

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子屬鴉膽子Bruceajavanica(L.) Merr.的干燥成熟果實，味苦，性寒，有小毒，歸大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、治瘧、治痣等功效，主產(chǎn)于廣東、廣西、云南、福建等地[1]?？鼓[瘤是鴉膽子最顯著的藥理作用之一，其中鴉膽子油及苦木內(nèi)酯類化合物為重要有效成分[2-3]，目前鴉膽子油已廣泛應用于胃癌[4]、非小細胞肺癌[5]、宮頸癌[6]、大腸癌[7]、肝癌[8]等疾病的治療。生物肽在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理調(diào)節(jié)作用，肽類藥物具有分子量小、對腫瘤敏感、成本低等傳統(tǒng)化療藥物和大分子抗體藥物所不具備的特點，因而成為近年來國內(nèi)外研究熱點[9]。該類藥物可通過免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤血管生成、促進細胞凋亡、影響細胞周期、抑制細胞內(nèi)信號傳導等機制來發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。課題組前期研究表明鴉膽子球蛋白源生物肽可抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖[11]。不同地理位置、氣候條件等對中藥材質(zhì)量和功效均有一定程度的影響，產(chǎn)地對鴉膽子蛋白質(zhì)品質(zhì)及相關藥理作用是否存在影響，尚未見詳細報道，本研究擬對其進行系統(tǒng)研究，并對其球蛋白源小分子肽的細胞毒性進行評價。

1 材料與儀器

1.1 材料

鴉膽子分別采購自廣東、廣西、云南、福建4個產(chǎn)地，產(chǎn)地信息見表1，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子Bruceajavanica(L.) Merr.的干燥成熟果實。

表1 不同產(chǎn)地鴉膽子來源

1.2 試劑

胃蛋白酶(批號：101644990，Sigma)；DMEM培養(yǎng)基(批號：1830761，Gibco)；FBS(批號：9080763，Vistech)；雙抗(批號：30002283，Corning)；蛋白質(zhì)標準品(批號：00544005，普科利萊)。所有化學試劑均為分析純。

1.3 儀器

FW-100型高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；BP221S型電子分析天平(Sartorius公司)；全自動旋光儀(美國魯?shù)婪蚬?；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；GTR10-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；FD-50冷凍干燥機(上海比朗儀器制造有限公司)；DL-CJ-1N高性能無菌工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；MCO-18AIC(UV)CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；Epoch酶標儀(美國Bio-Tek公司)；TE2000-S倒置顯微鏡(日本NIKON公司)。

2 方法

2.1 鴉膽子主成分含量測定

2.1.1蛋白質(zhì)含量和純度測定 采用凱氏定氮法[12]96：不同產(chǎn)地的鴉膽子粉碎后，過四號篩。精密稱定鴉膽子粉末或量取蛋白溶液于凱式燒瓶中，依次加入濃硫酸和催化劑進行消化直至終點，消化液定容后，取適量溶液進行蒸餾，進而用0.005 mol·L-1的硫酸滴定。按公式(1)(2)根據(jù)滴定所用硫酸量計算蛋白質(zhì)含量。每個樣品重復3次。

(1)

液體樣品中蛋白含量[mg·(100 mg)-1]=
(A-B)×0.14×6.25×N

(2)

式中：A為滴定樣品所用稀硫酸的體積(mL)；B為滴定空白樣品所用稀硫酸的體積(mL)；N為樣品的稀釋倍數(shù)；C為粉末樣品的質(zhì)量(g)。

2.1.2水分含量測定 采用烘干法[12]103：稱取(2.00±0.01) g樣品平鋪于干燥至恒質(zhì)量的稱量瓶(質(zhì)量記為m0)中，精確稱量其質(zhì)量記為m1，開口放置于105 ℃的烘箱內(nèi)5 h，取出冷卻后稱質(zhì)量記為m2，再次放入烘箱中重復上述步驟，直至連續(xù)2次稱量的質(zhì)量相差不超過0.005 g。每個樣品重復3次。

(3)

2.1.3灰分含量測定 采用馬弗爐法[12]105：精確稱取樣品平鋪于干燥坩堝(質(zhì)量m0)中，精確稱量其質(zhì)量m1，置于馬弗爐內(nèi)，500～600 ℃使樣品完全炭化，取出冷卻，稱量其質(zhì)量m2，再次放入馬弗爐內(nèi)至恒質(zhì)量。

(4)

2.1.4粗脂肪含量測定 采用索式提取法[13]：精確稱取樣品放置于干燥濾紙筒(質(zhì)量記為m0)內(nèi)，稱質(zhì)量(記為m1)后放入索氏提取器內(nèi)，石油醚回流8～10 h，烘干稱質(zhì)量(記為m2)。每個樣品平行3份，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算粗脂肪含量。

(5)

2.1.5淀粉含量測定 采用旋光法[14]：精確稱取3份樣品，分多次加入2.1 mL稀鹽酸(0.309 mol·L-1)，沸水浴加熱15 min，冷卻后，依次加入亞鐵氰化鉀和醋酸鋅溶液，搖勻后定容過濾，測定溶液旋光值α1。另稱取3份樣品，加入40%的乙醇室溫放置1 h，定容后過濾，取50 mL濾液加稀鹽酸(7.7 mol·L-1)，再依次加入亞鐵氯化鉀和醋酸鋅溶液，搖勻后定容過濾，測定溶液旋光值α2。樣品淀粉含量見公式(6)。

(6)

2.2 鴉膽子球蛋白提取

鴉膽子球蛋白提取方法參考文獻[15]等。藥材用雙蒸水4 ℃振蕩1 h，4 ℃ 10 000 r·min-1離心(離心半徑5為 cm)30 min，棄上清液，重復操作1次；再加入5% NaCl溶液于4 ℃振蕩1 h，10 000 r·min-1離心30 min獲得鴉膽子球蛋白提取液，重復操作1次，合并2次提取液；球蛋白提取液經(jīng)布氏漏斗過濾后，4 ℃透析(MWCO=3 kDa)24 h，期間每4 h換1次水，蛋白溶液冷凍干燥后備用。

2.3 SDS-PAGE電泳

采用垂直不連續(xù)體系[16]：分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。蛋白樣品溶液加入適量上樣緩沖液后，沸水浴變性5 min，冰浴10 min，上樣量為20 μg，室溫恒壓電泳；考馬斯亮藍R-250染色。

2.4 鴉膽子小分子肽(≤3 kDa)的制備

參考文獻[17]將4個產(chǎn)地的鴉膽子球蛋白分別用胃蛋白酶進行水解(底物濃度1%，酶與底物濃度比1∶10，酶解液pH=2.0，37 ℃)，酶解48 h后，100 ℃水浴5 min以終止反應，隨即冰浴10 min，于4 ℃，10 000 r·min-1、離心(離心半徑為5 cm)20 min，取上清液并轉(zhuǎn)移至超濾管(MWCO=3 kDa)中，4000 r·min-1、4 ℃下超濾離心，收集濾過液冷凍干燥。

2.5 鴉膽子小分子肽對A375的增殖抑制作用

取對數(shù)生長期的人源惡性黑色素瘤細胞A375，經(jīng)胰酶消化后，使其成均勻單細胞懸浮態(tài)，調(diào)整細胞密度為2×104個mL，按100 μL孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，給藥組分別加入150 μL受試樣品(質(zhì)量濃度為1、2、4、8、16 μg·mL-1)，陰性對照組加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基，加入100 μL MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)，于570 nm處測定吸光值(A)，計算細胞增殖抑制率。

(7)

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地鴉膽子主成分含量比較

4個產(chǎn)地鴉膽子主成分含量如表2所示。各產(chǎn)地鴉膽子蛋白質(zhì)含量存在顯著差異，廣西產(chǎn)地質(zhì)量分數(shù)最高，為17.23%；其次是云南產(chǎn)地，為14.20%；福建和廣東產(chǎn)地鴉膽子蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為13.20%和12.61%。粗脂肪質(zhì)量分數(shù)中，廣西產(chǎn)地最高，為22.10%，廣東產(chǎn)地質(zhì)量分數(shù)最低，僅占14.88%。淀粉質(zhì)量分數(shù)中，廣西產(chǎn)地最低，為46.73%，廣東產(chǎn)地最高，為56.41%。水分均不超過10%，總灰分均不超過6.5%，均符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

3.2 不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白含量比較

不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白含量及純度結(jié)果見表3。廣西產(chǎn)地鴉膽子質(zhì)量分數(shù)最高，為1.12 mg·(100 mg)-1，占總蛋白的6.52%，顯著高于其他3個產(chǎn)地鴉膽子(P<0.05)。同時，廣西鴉膽子球蛋白純度最高，為96.58%，其次是廣東、福建和云南，蛋白純度依次為94.56%、90.21%和87.03%，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 不同產(chǎn)地鴉膽子檢查項目比較 %

注：同一列不同字母表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；下同。

表3 不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白含量

3.3 不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白分子量分布

不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白電泳圖譜如圖1所示。產(chǎn)地對鴉膽子球蛋白條帶分布未造成明顯影響，主要分布在33、19、11 kDa附近，但不同產(chǎn)地蛋白條帶豐度略有不同。

注：1.標準蛋白；2.廣東產(chǎn)地；3.廣西產(chǎn)地；4.云南產(chǎn)地；5.福建產(chǎn)地。圖1 不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白電泳圖

3.4 不同產(chǎn)地鴉膽子小分子肽細胞毒性研究

不同產(chǎn)地的鴉膽子小分子肽作用于A375細胞，均呈現(xiàn)出一定的增殖抑制作用，且隨著作用時間的延長細胞數(shù)目逐漸減少，細胞均呈現(xiàn)出皺縮變圓、細胞膜破裂、細胞碎片增加的現(xiàn)象(見圖2)，而陰性對照組細胞數(shù)目隨時間呈現(xiàn)正常增長趨勢。

注：A.陰性對照組；B.廣西產(chǎn)地鴉膽子球蛋白小分子肽給藥組；1.給藥后24 h；2.給藥后48 h；3.給藥后72 h；各組給藥質(zhì)量濃度均為8 μg·mL-1。圖2 鴉膽子球蛋白小分子肽作用于A375細胞的形態(tài)學觀察

不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白源小分子肽對人源惡性黑色素瘤A375細胞的增殖抑制率見圖3。結(jié)果表明，鴉膽子生物肽對A375細胞均呈現(xiàn)一定的增殖抑制作用，且呈時間依賴性和劑量依賴性。以廣西產(chǎn)地鴉膽子生物肽為例，當藥物質(zhì)量濃度為4 μg·mL-1時，給藥24、48、72 h后，藥物對A375細胞的抑制率分別為19.29%、26.14%、41.01%，呈時間依賴性；當藥物作用時間為48 h時，隨著藥物濃度的增加，對A375細胞的抑制率分別為3.96%、8.48%、26.14%、48.98%、68.07%，呈遞增趨勢。

4產(chǎn)地小分子肽作用細胞72 h后，計算其最小半數(shù)抑制濃度(IC50)值，由表4可知，福建產(chǎn)地的IC50值最低，為2.78 μg·mL-1(P<0.05)，其次是廣西產(chǎn)地(5.54 μg·mL-1)，云南和廣東產(chǎn)地的IC50值較高，分別為8.34、8.16 μg·mL-1，說明福建和廣西產(chǎn)地的鴉膽子球蛋白酶解物對人源惡性黑色素瘤細胞A375的細胞毒性較其他2個產(chǎn)地強。

圖3 不同產(chǎn)地質(zhì)量濃度鴉膽子球蛋白小分子肽對A375細胞的增殖抑制率

表4 不同產(chǎn)地鴉膽子球蛋白小分子肽對A375細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)

4 討論

黑色素瘤具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移早且廣泛等特點，目前該病臨床常用的藥物治療方法主要有干擾素、分子靶向和免疫治療等，但均存在一定缺陷，如易產(chǎn)生耐藥性[18]、延遲反應等，且獲益者有限[19]。因此，尋找新型高效低毒抗黑色素瘤藥物亟待解決。

生物肽是由少于100個的氨基酸通過肽鍵連接形成的、相對分子質(zhì)量低于10 000、對生命活動有益或具有一定生理活性的化合物[20]，可以通過酶解法、發(fā)酵法和化學合成法等來制備。目前已從多種動植物中獲得抗腫瘤肽。Kannan等[21]從米糠中分離得到五肽Glu-Gln-Arg-Pro-Arg具有抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和肝癌細胞生長的作用。Wang等[22]從油菜籽制備得到的多肽Trp-Thr-Pro可引起HepG2細胞凋亡。Wang等[23]酶解牡蠣得到的多肽組分對S180荷瘤小鼠的抑瘤率可達48%。Su等[24]等從山羊脾臟中分離得到的抗癌活性肽(ACBP)通過阻滯細胞周期和細胞凋亡信號通路抑制人胃癌細胞(BGC-823)生長。

產(chǎn)地對有效成分含量及藥效有著重要影響。孫向陽等[25]研究表明，不同產(chǎn)地黃芪的解熱抗炎作用存在差異；劉英等[26]研究表明云南不同產(chǎn)地人參皂苷總含量差異較大；羅宇東等[27]比較了廣西不同產(chǎn)地的滕苦參強心苷含量，發(fā)現(xiàn)欽州八塞溝產(chǎn)地含量最高；盧聰[28]等研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地人參蛋白表達具有顯著性差異，且與產(chǎn)地緯度相關。中藥材中大分子的藥效及物質(zhì)基礎逐漸引起科研工作者重視。本研究對不同產(chǎn)地鴉膽子蛋白質(zhì)含量和小分子肽細胞毒活性進行了深入研究，結(jié)果顯示廣西產(chǎn)地鴉膽子總蛋白和球蛋白含量最高；且其小分子肽對人源惡性黑色素瘤細胞A375的增殖抑制作用僅次于福建產(chǎn)地，從而為該藥的質(zhì)量標準制定和臨床應用提供進一步理論依據(jù)，也為惡性黑色素瘤藥物的研發(fā)提供了新的候選材料。