侯影，張旭

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600

傷科凝膠劑是根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，采用現(xiàn)代制藥技術(shù)開發(fā)研制成的外用制劑。傷科凝膠劑處方由紅花、馬錢子、三七、續(xù)斷等十味中藥組成，根據(jù)藥材性質(zhì)及臨床需要，經(jīng)實(shí)驗(yàn)選擇的劑型為凝膠劑，以卡波姆-940為基質(zhì)加工制成。具有止痛消腫、化瘀活血的作用，主要用于瘀血腫痛、跌打損傷等癥。近年來凝膠劑是為滿足臨床需要而發(fā)展起來的一種新的藥物劑型，目前國內(nèi)外研究開發(fā)已很廣泛且日漸成熟。常用基質(zhì)有卡波姆(Carbomer，CBM)、羥甲基纖維素鈉、泊洛沙姆(poloxmner)、甲殼胺、瓊脂、殼聚糖等。凝膠劑基質(zhì)可以應(yīng)用卡波姆-940，具有制備工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性優(yōu)異、對(duì)皮膚無刺激性、外觀細(xì)膩、無油膩、滑爽、干后易清洗等特點(diǎn)，是優(yōu)良的外用劑型。凝膠劑自身具有液體和固體的雙重特性，從收縮率、導(dǎo)電性、蒸氣壓等方面，可以被看作為液體；從結(jié)構(gòu)上，高濃度凝膠所具有的物質(zhì)狀態(tài)，又可以看作是固體。凝膠劑作為一種透皮吸收好、無油膩感、涂展性好、易于清洗的新外用劑型，可廣泛用于控釋制劑、緩釋制劑及脈沖釋放等新型給藥途徑，適用于皮膚、黏膜、腔道。傳承內(nèi)病外治的治療理念，既可以避免口服藥經(jīng)過酶、酸等作用在胃腸道內(nèi)產(chǎn)生首過效應(yīng)，且可以降低藥物自身的毒副作用，凝膠劑作為外用制劑已成為近幾年來局部用藥的熱點(diǎn)研究方向。

方中馬錢子為馬錢子科馬錢Strychnosnux-vomicaL.的成熟種子，始見于《本草綱目》[1]。其性溫，味苦，有大毒，主要?dú)w脾、肝經(jīng)；具有消腫散結(jié)，通絡(luò)止痛之效。臨床治療風(fēng)濕頑痹、跌打損傷、麻木癱瘓、咽喉腫痛、癰疽瘡毒、骨折腫痛等方面具有顯著療效[2]。士的寧為馬錢子主要含有的生物堿的單體成分，它既是有效成分，也是有毒成分，中毒劑量與治療劑量相當(dāng)，口服30～100 mg可以達(dá)到致死量[3]，曾有臨床報(bào)道，1名69歲男性血樣中含有0.29 mg·L-1士的寧導(dǎo)致死亡[4]。選擇士的寧為實(shí)驗(yàn)考察的指標(biāo)，為判定處方中藥品質(zhì)量的實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而保證藥品的質(zhì)量[5]。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以士的寧提取量為考察指標(biāo)對(duì)凝膠劑的提取工藝進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀；微量進(jìn)樣器(規(guī)格：25 μL，Hamilton 美國)；數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)：KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)：RE-52，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(型號(hào)：FA1004B，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；十萬分之一分析天平(型號(hào)：METTLER AE240，瑞士METTLER)；酸度計(jì)(型號(hào)：PHS-2C，上海偉業(yè)儀器廠)；低速大容量多管離心機(jī)(型號(hào)：LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠)；高速粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司)。

1.2 試藥

馬錢子、三七等處方中藥均由大連美羅中藥廠有限公司提供。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翟延君教授鑒定為正品。

士的寧對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110706-200505)；乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；庚烷磺酸鈉(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)；磷酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；磷酸二氫鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；乙醇為分析純；水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

硅膠柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱溫：室溫。流動(dòng)相：乙腈-磷酸二氫鉀(0.02 mol·L-1)與庚烷磺酸鈉(0.01 mol·L-1)等量混合的溶液(pH值為2.8，用10%磷酸調(diào)節(jié))(21∶79)。檢測(cè)波長：254 nm，測(cè)定時(shí)間：60 min。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱定士的寧對(duì)照品，置于容量瓶，用甲醇溶解，稀釋至刻度線，制成每1 mL含0.004 mg儲(chǔ)備溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

稱取1/4處方量馬錢子、紅花、三七、續(xù)斷等十味中藥共9份，每份質(zhì)量為66 g。按照表2進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用加熱回流提取的方法，得乙醇提取液，量取提取液體積，取正交設(shè)計(jì)的9份提取液，每份提取液記錄體積，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL，加入到容量瓶(10 mL)中，加入甲醇溶液進(jìn)行稀釋，至標(biāo)準(zhǔn)刻度，混合均勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，得到的續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性供試品溶液制備

取除去馬錢子以外的其他中藥，按優(yōu)選出的提取工藝提取制備陰性供試品，再參照2.3項(xiàng)下方法制備，備用。

2.5 線性范圍考察

分別精密吸取士的寧對(duì)照品溶液(0.004 012 mg·mL-1)2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL，注入液相色譜器儀中，測(cè)定色譜峰的峰面積，分別以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪出對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到回歸方程為：Y=1 797.5X-1.133 3，r=0.999 9。士的寧進(jìn)樣量在0.010 03～0.060 18 μg線性關(guān)良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取士的寧對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)6次進(jìn)樣，測(cè)定士的寧的峰面積。士的寧RSD為0.14%，顯示該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，分別精密稱定，按上述2.1項(xiàng)下的色譜條件和2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行測(cè)定含量，結(jié)果士的寧RSD為0.98%，顯示此方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣取同一2.3項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果表明：士的寧RSD為0.76%。說明在制備后24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

同一批樣品(已知士的寧含量)精密稱取0.1 g，依次精密加入一定量的士的寧對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下的方法操作，同時(shí)制備6份，按上述2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算樣品回收率，士的寧平均回收率為99.75%，RSD為1.19%。

2.10 正交試驗(yàn)法

2.10.1供試品溶液的含量測(cè)定 各精密吸取10 μL供試品溶液、混合對(duì)照品溶液，測(cè)定士的寧含量，并計(jì)算士的寧提取量。士的寧對(duì)照品、士的寧正交提取9#供試品、陰性供試品溶液的色譜圖見圖1～3。

圖1 士的寧對(duì)照品HPLC圖

圖2 9#傷科凝膠劑供試品溶液HPLC圖

圖3 缺的士寧的陰性供試品溶液HPLC圖

2.10.2因素水平的確定與考察指標(biāo) 方中馬錢子主要含有的化學(xué)物質(zhì)有馬錢子堿、士的寧、豆甾醇苷、脂肪油、番木鱉苷、棕櫚酸及綠原酸等[6]。其中，生物堿既為其主要有效成分又為其毒性成分。王雪等[7]的研究結(jié)果表明，馬錢子堿和士的寧都是具有強(qiáng)烈毒性的物質(zhì)，其中馬錢子堿的毒性是士的寧毒性的20 倍；相關(guān)研究[8-9]表明，口服 5～10 mg 士的寧可出現(xiàn)中毒癥狀，口服30 mg 左右可導(dǎo)致死亡。而在使用一定量的馬錢子后不僅能導(dǎo)致藥源性損傷，還能損害腎小管上皮細(xì)胞，繼而誘發(fā)腎功能衰竭和尿毒癥等。依據(jù)本方中各中藥化學(xué)成分的性質(zhì)，在乙醇中有較好的溶解度，故選擇回流提取的方法。在單因素考察的基礎(chǔ)上，以乙醇溶媒濃度(A)、溶媒量(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，以士的寧提取量和浸膏收率為指標(biāo)，試驗(yàn)按照L9(34)正交表進(jìn)行，提取工藝優(yōu)選因素水平見表1。

表1 傷科凝膠劑提取工藝因素水平

2.10.3正交試驗(yàn) 稱取1/4處方量馬錢子、紅花、三七、續(xù)斷等十味中藥共9份，每份質(zhì)量為66 g。依據(jù)正交試驗(yàn)表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行回流提取，得乙醇提取液，量取提取液體積，測(cè)定提取液中士的寧含量，并計(jì)算士的寧提取量。以浸膏收率綜合評(píng)分加權(quán)值為0.5，士的寧提取總量綜合評(píng)分加權(quán)值為0.5，兩者之和為綜合評(píng)分，作為考察指標(biāo)，結(jié)果見表2。方差分析見表3。

表2 傷科凝膠劑提取工藝正交表L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 傷科凝膠劑提取工藝方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.00。

2.11 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從方差分析結(jié)果看出，各因素影響均不顯著。本實(shí)驗(yàn)的影響因素主次順序?yàn)镈>A>C>B，經(jīng)綜合分析，確定其最佳提取工藝條件為A2B1C2D3。即以60%乙醇為溶媒，提取3次，溶媒為 10、8、8倍量，每次1.5 h。

2.12 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取1/4處方量的處方中藥3份，以10、8、8倍60%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液。得乙醇提取液，量取提取液體積，測(cè)定提取液中士的寧含量，并計(jì)算士的寧提取量，結(jié)果見表4。

表4 傷科凝膠劑提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，士的寧提取量和浸膏收率均略高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的考察指標(biāo)最高提取量，說明優(yōu)選的提取工藝合理可行。

3 討論

馬錢子主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、坐骨神經(jīng)痛、痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損等疾病，是痹癥治療的主要藥物，臨床上具有較高的應(yīng)用價(jià)值[10-11]。馬錢子有效成分主要為總生物堿，其中70%～80%為馬錢子堿和士的寧，主要作用于心血管系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)[12]。研究表明，馬錢子堿(稱布魯生)和士的寧(番木鱉堿) 又是馬錢子的主要毒性成分。其作用機(jī)理為對(duì)脊髓后角細(xì)胞具有高度的選擇性興奮作用，進(jìn)而使脊髓的運(yùn)動(dòng)性反射作用增強(qiáng)，促使感覺器官的敏感性增強(qiáng)，主要作用為延髓血管運(yùn)動(dòng)中樞及呼吸中樞的興奮、骨骼肌的緊張度增強(qiáng)，進(jìn)而使大腦皮質(zhì)感覺中樞的機(jī)能得到提高[13]，表現(xiàn)為強(qiáng)直性的驚厥，因而產(chǎn)生呼吸肌的抑制而致死。作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制甘氨酸受體的士的寧，可以阻斷激活的甘氨酸受體，過度興奮齒狀回神經(jīng)元使其產(chǎn)生驚厥。同時(shí)還具有阻止乙酰膽堿被膽堿酯酶破壞的作用，進(jìn)而促進(jìn)胃腸的蠕動(dòng)，產(chǎn)生腹痛瀉痢。另外，馬錢子具有損害腎小管的上皮細(xì)胞的作用，進(jìn)而破壞氨基酸代謝、脂質(zhì)的代謝和糖酵解的過程，長期使用可損害人體肝腎功能[14]。臨床目前應(yīng)用的馬錢子多作為復(fù)方制劑，用于鎮(zhèn)痛、抗炎作用多為馬錢子有效成分及其單方外用制劑。

凝膠膏劑是指飲片細(xì)粉、提取物、化學(xué)藥物和親水性基質(zhì)(相適宜的)混和均勻后，選擇性地涂布于相適宜的背襯材料，進(jìn)而制成的貼膏劑。復(fù)方馬錢子凝膠膏劑是以卡波姆為基質(zhì)，制成凝膠膏劑外用，用于治療軟組織炎癥產(chǎn)生的疼痛損傷，具有良好的鎮(zhèn)痛和抑制炎癥作用[15]。外用凝膠膏作為經(jīng)皮給藥的一種新型制劑，具有保濕性良好、載藥量大、對(duì)皮膚無刺激及過敏反應(yīng)、 可反復(fù)粘貼、給藥劑量可以控制，生產(chǎn)過程中對(duì)環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)，符合中藥大劑量、多組分的用藥特點(diǎn)，是近年來研究經(jīng)皮給藥的復(fù)方中藥新劑型的熱點(diǎn)[16]。

凝膠劑是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男聞┬?。適用于皮膚、腔道及黏膜給藥，可避免口服給藥存在的首過效應(yīng)，使藥物不良反應(yīng)減少，遵循“內(nèi)病外治”的中醫(yī)理念。同時(shí)具有使用方便、舒適、易于涂布、外形美觀、不污染衣物、生物相容性好、透皮吸收好等多種優(yōu)點(diǎn)。近年來，出現(xiàn)的新制藥技術(shù)，如包合物凝膠制備技術(shù)、殼聚糖凝膠劑制備技術(shù)、脂質(zhì)體凝膠制備技術(shù)等，使凝膠劑的應(yīng)用范圍擴(kuò)大，而且多種新技術(shù)相結(jié)合，使凝膠劑質(zhì)量更穩(wěn)定、作用更持久，提高生物利用度，并具有皮膚靶向性作用。因此，凝膠膏劑作為一種新劑型，可制成不同的給藥途徑，正得到廣泛的重視和應(yīng)用。綜上所述，實(shí)驗(yàn)中處方中藥提取工藝考察，以處方中士的寧提取量和浸膏收率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)，確定處方中藥最佳提取工藝為以10、8、8倍60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。結(jié)果表明，該提取工藝科學(xué)合理、穩(wěn)定可靠，適合于傷科凝膠劑的工業(yè)化提取。